Бесклеточный дот-блот как практичная и адаптируемая платформа иммуноферментного анализа для выявления ответа антител в сыворотке крови человека и животных

Мы описываем недавно разработанную платформу иммуноферментного анализа, основанную на принципах бесклеточной синтетической биологии и методе дот-блоттинга для настраиваемого обнаружения ответа антител в сыворотках крови человека и животных.

Череда глобальных патогенных вспышек за последние два десятилетия высветила важность стратегий серонадзора. Платформы иммуноферментного анализа, которые служат для обнаружения специфических антител к заболеванию в сыворотке крови пациентов, лежат в основе серонадзора. Типичными примерами являются иммуноферментные анализы и анализы бокового потока; Однако, несмотря на то, что эти методы являются золотым стандартом, они требуют расходных материалов и специализированного оборудования, специфичных для патогенов, что ограничивает их использование за пределами хорошо обеспеченных ресурсами лабораторий.

Недавно мы разработали новую платформу иммуноферментного анализа под названием Cell-Free Dot-Blot (CFDB) и валидировали ее с использованием сывороток человека и животных против SARS-CoV-2. В отличие от обычных иммунологических анализов, образцы сыворотки пациента с CFDB иммобилизуются до твердой фазы (нитроцеллюлозной мембраны), в то время как целевой антиген суспендируется в подвижной фазе анализа. Для улучшения доступа к возможностям серонадзора антигены CFDB производятся по требованию и с использованием инфраструктуры с низким уровнем нагрузки с использованием экспрессии белков in vitro . Здесь антиген сливается с пептидной меткой, которую можно обнаружить с помощью одного универсального репортерного белка для любого анализа CFDB. В результате CFDB не требует доступа к считывателю с несколькими лунками или очищенным коммерческим молекулярным компонентам. С учетом этих соображений CFDB устраняет недостатки существующих платформ иммуноферментного анализа, обеспечивая доступность для нецентрализованных лабораторий, адаптируемость к новым патогенам и доступность для сообществ с низким уровнем дохода.

В данной статье мы предоставим пошаговый протокол подготовки и проведения иммунологического анализа CFDB. Используя в качестве примера нашу недавнюю работу по SARS-CoV-2 CFDB, мы рассмотрим дизайн антигенной ДНК для бесклеточного производства по требованию, за которым последует приготовление репортерного белка CFDB, иммобилизация образцов сыворотки в твердой фазе и, наконец, этапы связывания с антигеном и обнаружения анализа. Мы ожидаем, что, следуя этим инструкциям, исследователи смогут адаптировать анализ CFDB для выявления иммунных реакций в сыворотке крови человека и животных на любой конкретный патоген.

Пандемия COVID-19 выявила острую потребность в недорогих и масштабируемых диагностических инструментах, особенно в условиях ограниченных ресурсов¹. Традиционные иммунологические анализы, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), доказали свою важность для выявления иммунных реакций ^2,3. Однако их высокая стоимость, зависимость от сложных реагентов и зависимость от специализированного оборудования ограничивают их доступность, особенно во время глобальных кризисов в области здравоохранения. В ответ на эти вызовы мы разработали Cell-Free Dot Blot (CFDB) — недорогую адаптируемую платформу иммуноанализа, предназначенную для обнаружения антител к SARS-CoV-2 в сыворотках крови человека и животных.

CFDB использует бесклеточную синтетическую биологию для быстрого производства вирусных антигенов по требованию с использованием линейных шаблонов ДНК ^4,5. Это устраняет необходимость в традиционных процессах клонирования, экспрессии и очистки на основе клеток, что значительно ускоряет производство антигена при одновременном снижении затрат. Метод CFDB упрощает обнаружение антител за счет использования формата dot blot, при котором сыворотки обнаруживаются непосредственно на мембранах нитроцеллюлозы. Эта система устраняет необходимость в дорогостоящих многолуночных планшетах и специализированном лабораторном оборудовании, что позволяет упростить рабочий процесс «погружения» на этапах инкубации и промывки. Платформа также использует систему SpyCatcher-SpyTag, в которой химера пероксидазы SpyCatcher2-Apex2 действует как универсальный реагент вторичного обнаружения ^5,6. Он производится с использованием стандартной экспрессии на основе кишечной палочки, что устраняет зависимость от дорогостоящих коммерческих конъюгатов антител. В результате, система CFDB может выполнять серологические анализы с производительностью, сравнимой с ИФА, при значительно более низких затратах - около 3 долларов США за анализ 96 образцов по сравнению с более чем 300 долларами США за коммерческий набор ИФА⁵.

Чтобы продемонстрировать эффективность CFDB, мы проверили его способность обнаруживать антитела в предварительно охарактеризованных сыворотках крови человека и животных. Наши результаты тесно коррелировали с методом ИФА при выявлении положительных и отрицательных образцов на COVID-19. В дополнение к диагностике на людях мы оценили полезность CFDB на животных моделях, тестируя сыворотки от хомяков, инфицированных SARS-CoV-2, и тех, кто был вакцинирован рекомбинантным белком нуклеокапсида. Эти тесты подтвердили потенциал CFDB для использования как в человеческой, так и в ветеринарной диагностике, что делает его универсальным инструментом для мониторинга иммунных реакций у разных видов. Одним из ключевых преимуществ CFDB является ее гибкость. Просто модифицируя матрицу ДНК, кодирующую интересующий антиген, платформу можно быстро адаптировать для обнаружения антител против различных патогенов, что делает ее ценной для будущей готовности к пандемии. Его низкая стоимость, простой рабочий процесс и минимальные требования к инфраструктуре делают его особенно подходящим для децентрализованных лабораторий и сред с ограниченными ресурсами, где доступ к коммерческой диагностике ограничен.

В этой работе мы предоставим пошаговую инструкцию по подготовке и проведению анализа CFDB. Во-первых, мы рассмотрим разработку и синтез линейных матриц ДНК для бесклеточного производства антигенов, которые являются основными реагентами для обнаружения в анализе. Затем мы описываем этапы приготовления реагента для вторичного обнаружения анализа SpyCatcher2-Apex2. После этого мы предоставляем инструкции по бесклеточному производству и проверке качества самих антигенов. Наконец, мы подробно опишем процесс проведения анализа CFDB на образцах сыворотки крови человека или животных.

Все эксперименты с хомяками проводились в Национальной микробиологической лаборатории (NML) при Агентстве общественного здравоохранения Канады, одобрены Канадским научным центром здоровья человека и животных и в соответствии с рекомендациями Канадского совета по уходу за животными. Все образцы сыворотки/плазмы крови человека были получены коммерческим путем для внутреннего тестирования или предоставлены клиническими сотрудниками NML для независимого тестирования в NML.

1. Проектирование и подготовка шаблонов линейной экспрессии антигена (ЛЭТ)

1. Разработайте бесклеточные экспрессионные ЛЭТ для целевого антигена на основе инструкций в Norouzi et ^al.7 и содержащих N/C-концевой SpyTag, как описано в Norouzi et ^al.5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы приводим подробную информацию о получении нуклеокапсидного белка SARS-CoV-2 (NP, аминокислоты 2-419).
   1. Убедитесь, что ЛЭТ для SARS-CoV-2 NP (рис. 1 и дополнительный файл 1) содержит сайты 5' и 3' Ter с буферной последовательностью из 50 пар оснований до промотора T7 и после стоп-кодона.
   2. Пометьте белок NP на N-конце с помощью His 6-SpyTag-TEV.
   3. Получить последовательность белка из базы данных UniProt (код присоединения P0DTC9) и оптимизировать ее кодонами для экспрессии на основе E. coli с помощью инструмента оптимизации кодонов IDT⁸. Закажите эту последовательность для коммерческого синтеза в виде одноцепочечного фрагмента ДНК, ресуспендированного в воде с концентрацией 10 нг/мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сайт расщепления протеазы TEV и метка His₆ не являются существенными особенностями в дизайне ЛЭТ.
2. ПЦР амплифицируют фрагмент ДНК с помощью универсального Ter FW (GGCTCCGAATAAGTATGTTGTAACTAAAGGTGCGGCC
   ACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCG) и Ter RV (CCGAGGCAATAAGTATGTTGTAACTAAAGGTGCTCAG
   CTTCCTTTCGGGGCTTTTTTAGCAGCC) с использованием высокоточного набора ДНК-полимеразы (см. Таблицу материалов)
   1. Организуйте реакцию объемом 100 мкл следующим образом: 75 мкл воды, не содержащей нуклеаз, 20 мкл 5x буфера ДНК-полимеразы, 2 мкл 10 мМ dNTP (конечная концентрация 200 мкМ), 0,5 мкл 100 мкМ праймера Ter-FW, 0,5 мкл 100 мкМ праймера Ter-RV, 1 мкл одноцепочечного LET 10 нг/μл, 1 мкл (2U) ДНК-полимеразы.
   2. Используйте следующие настройки ПЦР: начальная денатурация при 98 °С в течение 30 с; 35 циклов: 98 °C в течение 6 с, 60 °C в течение 15 с, 72 °C в течение 90 с; держать при температуре 4 °C.
3. Очистите продукт ПЦР с помощью коммерческого набора для очистки ПЦР, проверьте его качество, запустив образец в 1% агарозный гель, и измерьте его концентрацию на спектрофотометре UV-VIS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сырые продукты ПЦР также можно использовать непосредственно для бесклеточной экспрессии. Тем не менее, очистка позволяет проводить более стандартизированную процедуру.

Рисунок 1: Шаблон линейной экспрессии для SARS-CoV-2-NP. Схема, представляющая особенности линейного шаблона ДНК His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP. Ключевые элементы шаблона ДНК помечены. Кодирующая последовательность для представляющего интерес белка, в данном случае NP, помещается под транскрипционный контроль промотора Т7 для эффективной экспрессии. На N-конце к белку NP добавляется метка SpyTag для специфического детектирования с помощью реагента для детектирования SpyCatcher2-Apex2. Сайты протеаз x6His-tag и TEV, хотя и включены в общую конструкцию LET, не могут использоваться для целей CFDB. На концах линейной матрицы ДНК «восходящие» и «нисходящие» сайты Ter, каждому из которых предшествуют соответствующие 50 буферных последовательностей пар оснований, включены для Tus-опосредованной защиты от деградации экзонуклеолитической ДНК в бесклеточном лизате. Сокращения: NP = нуклеокапсидный белок; LET = шаблон линейного выражения; TEV = вирус травления табака; CFDB = бесклеточный точечный блоттинг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Очистка репортерного белка SpyCatcher2-Apex2

1. Используйте плазмиду pET24b-SpyCatcher2-Apex2, первоначально созданную в Norouzi et ^al.5 (полная последовательность в Дополнительном файле 2 и плазмидная карта на Дополнительном рисунке S1), для получения репортерного белка SpyCatcher2-Apex-2.
2. Приготовьте агаровые тарелки и лизогенный бульон (LB), содержащий 50 мкг/мл канамицина. Трансформируйте клетки E. coli BL21 (DE3) с помощью плазмиды pET24b-SpyCatcher2-Apex2. Инокулируйте одну колонию в закваску LB объемом 15 мл и выращивайте в течение ночи при 37 °C с встряхиванием при 250 об/мин.
3. На следующий день добавьте 10 мл закваски в 500 мл свежей среды LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина. Инкубируют при 37 °C с встряхиванием при 250 об/мин до достижения культурой оптической плотности при 600 нм 0,6-0,8 (~3 ч).
4. Индуцировать экспрессию SpyCatcher2-Apex2 путем добавления в культуру 0,5 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида и 1 мМ гидрохлорида 5-аминолевулиновой кислоты. Снизьте температуру роста до 30 °C и дайте культуре инкубироваться еще 4 ч.
5. Соберите бактерии центрифугированием при температуре 8 000 × г в течение 15 минут. Перейдите к лизису клеток или храните гранулу при температуре -80 °C до использования.
6. Ресуспендируйте гранулу в 20 мл лизисного буфера, содержащего 50 мМ Tris-HCl (pH 7,8), 300 мМ NaCl, 1 мг/мл лизоцима, таблетку ингибитора протеазы без ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол (DTT). Лизируйте клетки с помощью ультразвука с амплитудой 50 % с интервалами 5 с ON и 10 s OFF с общим временем включения 3 мин.
7. Осветите лизат центрифугированием при 20 000 × г в течение 1 ч при 4 °C. Пропустите надосадочную жидкость через шприцевой фильтр 0,2 мкм.
8. Добавьте хлорид гемина до конечной концентрации 250 мкМ к осветленному лизату и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. Приступайте к очищению белка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация с хлоридом гемина максимизирует включение гема в пероксидазу Apex-2 для оптимальной активности фермента.
9. Добавьте 2,5 мл смолы Ni в осветленный лизат и инкубируйте при температуре 4 °C с легким встряхиванием в течение 45 минут. Нанесите смесь на колонку с гравитационным потоком и промойте смолу 50 мл трис-буфера (50 мМ Tris-HCl (pH 7,8), 300 мМ NaCl и 1 мМ DTT).
10. Разбавьте белок SpyCatcher2-Apex2 в 25 мл трис-буфера, содержащего 400 мМ имидазола. Концентрат и буфер обменивают элюат на трис-буфер с помощью центробежного фильтрующего блока, достигая конечного объема 0,5-1,0 мл.
11. Используйте молярный коэффициент экстинкции SpyCatcher2-Apex2 (27 390 ^{M-1 см-1}) для определения концентрации белка на УФ-ВИД спектрофотометре. Добавьте глицерин до конечной концентрации 40% и храните аликвоты при температуре -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что этот протокол даст примерно 40 мг высокочистого и активного SpyCatcher2-Apex2, что достаточно для 400 прогонов CFDB при стандартном размере 96 образцов.
12. Для обнаружения белков SpyTagged с помощью обычного вестерн-блот-9 и для экспериментов с CFDB всегда блокируйте мембраны в 5% обезжиренном сухом молоке в 1x Трис-буферном физрастворе, содержащем 0,05% Tween-20 (TBST). Используйте белок SpyCatcher2-Apex2 в конечной концентрации 10 мкг/мл в блокирующем растворе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для создания сигнала репортера SpyCatcher2-Apex2 требуется решение с улучшенной хемилюминесценцией (ECL). Раствор ECL может быть получен в промышленных масштабах или приготовлен на месте в соответствии с инструкциями в Mruk et ^al.10. Конечный раствор ECL здесь состоит из 0,4 мМ-кумаровой кислоты, 2,5 мМ люнола и 0,015%_Н2О2 в 100 мМ трис-HCl (рН 8,6).

3. Бесклеточное производство и контроль качества антигенов

1. Приготовьте и соберите бесклеточный лизат экспрессии E. coli BL21 и компоненты реакции, следуя инструкциям в Levine et ^al.11 и Norouzi et ^al.5. Дополнить конечную реакционную смесь 5 мкМ белком Tus и 1,2 мкМ РНК-полимеразой T7 следующим образом для репрезентативной реакции объемом 100 мкл: 14,6 мкл раствора А, 14 мкл раствора В, 33,3 мкл лизата E. coli BL21, 2,5 мкл 200 мМ белка Tus, 1,2 мкл 100 мМ РНК-полимеразы Т7, 1 мкл 1,5 мкМ линейной матрицы ДНК, 33,4 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Основные инструкции по получению бесклеточного лизата E. coli BL21 см. в Дополнительном файле 3 и в Дополнительной таблице S1 для подробного рецепта растворов А и В. Система бесклеточной экспрессии E. coli также может быть получена с использованием альтернативных протоколов или получена коммерчески, при условии, что реакция дополнена Tus и РНК-полимеразой T7.
2. Проведите первоначальный тест экспрессии в масштабе 5 μл, добавив 10% (v/v) сырого продукта ПЦР в бесклеточную реакцию в пробирке для ПЦР. Выдерживать без встряхивания при 30 °C в течение 15 часов.
3. Проверьте качество экспрессии NP-антигена путем загрузки 1 мкл бесклеточной реакции на 12% полиакриламидный гель додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) и последующего переноса его на нитроцеллюлозную мембрану для вестерн-блоттинга, как описано в шаге 2.12. Используйте репортерный белок SpyCatcher2-Apex2 для блоттинга с помощью SpyTag и, при необходимости, специфическое коммерческое антитело (в данном случае анти-SARS-CoV-2-NP) против целевого антигена.
4. Соберите бесклеточную реакцию в масштабе 1 мл с очищенным продуктом LET 15 нМ для использования в анализе CFDB. Смесь для сцеживания инкубируют в конической пробирке объемом 15 мл с встряхиванием при 80 об/мин в течение 15 ч при 30 °C. Проверьте качество сцеживания с помощью вестерн-блоттинга и храните 50 мкл аликвот при температуре -20 °C.

4. Образцы сыворотки крови

1. Получение образцов сыворотки (или плазмы) человека/животного из коммерческих источников или у клинических сотрудников или внутри компании с использованием стандартных процедур и в соответствии с рекомендациями институционального комитета по этике исследований на людях или комитета по уходу за животными и их использованию. Убедитесь, что были приняты соответствующие меры по предварительной обработке проб для снижения рисков загрязнения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Меры предварительной обработки могут включать обработку растворителем и моющим средством, тепловую инактивацию и тестирование на маркеры вирусов, передающихся через кровь. Полезный протокол выделения сыворотки и плазмы из цельной крови доступен¹². Как и в случае с другими платформами иммуноферментного анализа, образцы сыворотки, собранные на ранних этапах (<3 недели) после первоначального инфицирования или начала заболевания, не должны содержать адекватных уровней ответа антител, и к их результатам следует относиться с осторожностью.
2. Для проверки качества реагентов SARS-CoV-2 NP CFDB используйте международную референс-панель Национального института биологических стандартов и контроля (NIBSC) Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по анти-SARS-CoV-2 иммуноглобулину, которая содержит x1 pre-COVID-19 и x4 SARS-CoV-2-положительных образца с различным уровнем анти-NP иммуноглобулинов¹³. В качестве альтернативы используйте предварительно охарактеризованные здоровые и положительные образцы сыворотки из других источников.
3. Для экспериментов с CFDB получение или подготовка отрицательного контрольного образца путем объединения нескольких (>3) здоровых образцов сыворотки для повышения точности и облегчения анализа и интерпретации результатов.

5. Процедура бесклеточного точечного блоттинга (CFDB)

1. Загрузите и распечатайте файл изображения мастер-сетки (дополнительный рисунок S2). Основная сетка представляет собой узор размером 6 x 6 см, содержащий 12 x 12 кругов диаметром 2 мм каждый и обеспечивающий пятнистую способность, аналогичную 96-луночному планшету.
2. Плотно закрепите сетку между двумя слоями клейкой пленки для герметизации ПЦР-пластин и отрежьте по размеру вдоль внешних границ сетки. С помощью биопсийного перфоратора диаметром 2 мм выдолбите каждый отмеченный круг.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эту основную сетку можно использовать повторно несколько раз после протирания 70% этанолом.
3. Отрежьте кусок нитроцеллюлозной мембраны размером 6,5 x 6,5 см и расположите его под главной сеткой на чистой поверхности, закрепив установку с помощью клейкой ленты, как показано на рисунке 2 и дополнительном рисунке S3. С помощью маркера отметьте крайние положения кругов на нитроцеллюлозной мембране, которые будут использоваться в качестве ориентира для разрезания мембраны после выделения образца.
4. Разбавьте образцы сыворотки на 1/10 в 1x фосфатно-солевом буфере (pH 7,4). С помощью микропипетки распределите в три раза объем 0,4 мкл каждого образца на мембрану из нитроцеллюлозы в заданных положениях сетки. Для дозирования потребуется примерно 15 секунд на одну точку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно включайте как отрицательные, так и положительные контрольные образцы с каждым анализом, так как это потребуется для анализа результатов.
5. Дайте 10 минут при температуре окружающей среды, чтобы пятнистые образцы связались и высохли. С помощью пинцета аккуратно извлеките нитроцеллюлозную мембрану и разрежьте вдоль отмеченных наружных кругов.
6. Заблокируйте мембрану в 10 мл блокирующего раствора (5% обезжиренного сухого молока в TBST) в чашке Петри диаметром 10 см на 30 минут при комнатной температуре, осторожно встряхивая при 100 об/мин.
7. Разморозьте и добавьте аликвоту 50 мкл смеси экспрессии бесклеточного антигена к 5 мл блокирующего раствора в чашке Петри диаметром 10 см. Перенесите мембрану непосредственно в этот антигенсодержащий раствор и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч, встряхивая при 100 об/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет основной этап обнаружения, на котором антиген SpyTagged будет связываться с позициями пятен, содержащими антитела, если они присутствуют.
8. Промойте мембрану, промойте в течение 5 минут и снова промойте в TBST, прежде чем перейти к вторичному этапу обнаружения.
9. Инкубируйте мембрану в 10 мл блокирующего буфера, содержащего 10 мкг/мл очищенного белка SpyCatcher2-Apex2, в течение 1 ч при встряхивании при 100 об/мин.
10. Промойте мембрану и промойте 2 x 5 минут в TBST, с заключительным полосканием в TBS.
11. Приклейте и закрепите кусок парапленки на чистой рабочей площадке рядом с инструментом для блот-визуализации. Удалите лишнюю жидкость, постукивая по мембране с помощью пинцета, и поместите мембрану поверх парапленки.
12. Немедленно добавьте 3 мл (100 μл/^см2) раствора ECL поверх мембраны и инкубируйте при комнатной температуре ровно 90 с.
13. Немедленно высушите мембрану и перенесите ее на совместимый с хемилюминесценцией инструмент визуализации для визуализации результатов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время визуализации может варьироваться на разных инструментах. Рекомендуется использовать стандартные настройки времени автоматического сбора данных прибора, а при их отсутствии использовать предварительно характеризированные образцы сыворотки для оптимизации времени получения изображения.
14. Используйте функцию анализа изображений прибора для получения интенсивностей пятен, в том числе для трех пустых (фоновых) позиций на нитроцеллюлозной мембране; Поддерживайте постоянный объем измерения на каждую точку. Экспортируйте данные в электронную таблицу, не забывая правильно помечать каждую позицию спота.
15. Вычислите среднее значение и стандартное отклонение (SD) для тройной интенсивности пятен. Затем вычтите фон нитроцеллюлозной мембраны из всех образцов.
16. Используйте следующее уравнение для получения порогового значения для интерпретации результатов -/+:
    (Среднее значение отрицательных контрольных значений) + (3 x SD отрицательных контрольных значений). Сэмплы считаются положительными, если их средняя интенсивность падает выше порогового значения, и отрицательными, если их средняя интенсивность падает ниже порогового значения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Схема процедуры CFDB представлена на рисунке 3.

Рисунок 2: Сборка CFDB. Схема настройки главной сетки CFDB и сборки мембраны ЧПУ. Мастер-сетка накладывается на мембрану NC для обеспечения регулярной, адресной картины для пятнистости и иммобилизации образцов сыворотки. Сокращения: CFDB = бесклеточный точечный блот; NC = нитроцеллюлоза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Схематическое изображение рабочего процесса CFDB. При анализе CFDB небольшое количество (<0,4 мкл) из 10-кратно разбавленных образцов сыворотки вручную наносится на предварительно разрезанную нитроцеллюлозную мембрану (левая панель) в дискретных, адресуемых местах (средняя панель). Нанесение одного образца сыворотки на пятно в тройные пятна и иммобилизация содержания белка, включая общий резервуар антител сыворотки, на твердом субстрате NC (бежевые пятна на средней панели). В этом примере анти-NP антитела, содержащиеся в образцах сыворотки, могут быть сначала связаны с первичным реагентом детектирования CFDB SpyTag-NP и, наконец, детектированы реагентом вторичного детектирования CFDB SpyCatcher2-Apex2 (увеличенный пузырь на правой панели). Эта цифра была взята из Norouzi et ^al.5. Сокращения: CFDB = бесклеточный точечный блот; NP = нуклеокапсидный белок; LET = шаблон линейного выражения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

ПЦР-амплификация линейной экспрессии матрицы для целевого антигена
Для ПЦР-амплификации SARS-CoV-2 NP LET использовали универсальные прямые и обратные праймеры Ter, как описано в разделе 1.2 протокола, и проверяли 1 мкл продукта на агарозном геле (рис. 4) перед переходом к очистке продукта ПЦР.

Рисунок 4: ПЦР шаблона линейного выражения. 1% агарозный гель, показанный на дорожке 1: 1 kb DNA Ladder и Lane 2: линейная матрица ДНК с ПЦР-амплификацией для His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP (1,630.н.). Сокращения: ПЦР = полимеразная цепная реакция; NP = нуклеокапсидный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Очистка репортерного белка SpyCatcher2-Apex2
Белок SpyCatcher2-Apex2 был получен в соответствии с описанием в разделе 2 протокола. Чтобы обеспечить адекватное включение гема в пероксидазу Apex2, во время синтеза белка и после лизиса клеток добавляли гидрохлорид 5-аминолевулиновой кислоты (предшественник гема) и хлорид гемина соответственно. Образцы со всех этапов очистки загружали в гель SDS-PAGE, чтобы обеспечить качество конечного продукта (Рисунок 5).

Рисунок 5: Очистка SpyCatcher2-Apex2. 12% гель SDS-PAGE, показывающий фракции от этапов очистки белка SpyCatcher2-Apex2. L: лизат (2 μL), FT: проточный (2 μL), W: промывка (10 μL), E1-3: элюирование 1-3 (10 μL) каждая. Отмечена ожидаемая полоса в 42 кДа. Аббревиатура: SDS-PAGE = электрофорез в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Бесклеточная экспрессия и проверка качества целевого антигена
После проведения пилотной экспрессии NP-белка в масштабе 5 мкл и проверки качества с помощью SDS-PAGE была проведена экспрессия в масштабе 1 мл, как описано в разделе 3 протокола. Образец объемом 1 мкл конечной бесклеточной экспрессионной смеси подвергали вестерн-блоттингу отдельно для обнаружения с помощью SpyCatcher2-Apex2 и коммерческого антитела против NP (рис. 6). Этот этап гарантирует, что антиген успешно экспрессируется и что он может специфически связываться как с анти-NP иммуноглобулинами, так и с репортерным белком SpyCatcher2-Apex2.

Рисунок 6: Проверка качества бесклеточных антигенов. Вестерн-блоттинг бесклеточного продуцируемого NP-белка с помощью SpyCatcher2-Apex2 (левая панель) и поликлонального антитела против NP кролика (правая панель). Маркируется ожидаемое полноразмерное изделие при мощности 50 кДа. Маркером размера в обоих гелях является Color Pre-stained Protein Standard, Broad Range. Этот рисунок был адаптирован из Norouzi et ^al.5. Сокращение: NP = нуклеокапсидный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Верификация реагентов CFDB с использованием предварительно охарактеризованных сывороток человека
Чтобы убедиться в высоком качестве реагентов CFDB и успешной реализации протоколов CFDB, мы использовали предварительно охарактеризованную сывороточную панель, предоставленную NISBC-международной референс-панелью ВОЗ по иммуноглобулину против SARS-CoV-2 20/268¹³. Эта панель состоит из 1 образца до COVID-19 (отрицательный) и 4 положительных образца SARS-CoV-2 с различными уровнями ответа антител (Дополнительная таблица S2). Мы также приобрели панель сыворотки крови от RayBiotech (CoV-PosSet), содержащую 10 образцов до COVID-19 (отрицательный) и 20 предполагаемых SARS-CoV-2-положительных. Мы объединили равные фракции из всех 10 отрицательных сывороток для использования в качестве отрицательного контроля во всех экспериментах, проведенных в нашей лаборатории. Такая стратегия объединения повышает точность и надежность результатов, поскольку отдельные отрицательные образцы могут демонстрировать тонкие уровни фонового сигнала, что может усложнить интерпретацию результатов.

В соответствии с разделом 5 протокола был проведен анализ CFDB на предварительно охарактеризованной референсной панели ВОЗ и наборе CoV-PosSet компании RayBiotech, а также была получена визуализация блоттинга. Инструмент громкости в программном обеспечении Image Lab использовался для рисования равномерных кругов в каждой позиции точки и экспорта интенсивности сигнала по отдельности. После вычитания фоновой интенсивности НК-мембраны из всех образцов пороговое значение ((Среднее значение отрицательных контролей) + (3 x SD отрицательного контроля)) также вычиталось из средней интенсивности сигнала. Образцы считаются анти-NP положительными, если интенсивность их сигнала падает выше порогового значения. Изображение блоттинга и соответствующего графика интенсивности сигнала представлено на рисунке 7. Результаты демонстрируют, что с помощью бесклеточного белка SARS-CoV-2 NP метод CFDB может правильно идентифицировать все отрицательные образцы и все положительные образцы, за исключением двух образцов из набора RayBiotech (RB P5, собранный через 34 дня после появления симптомов (dpso) и RB P10, собранный 4 dpso). Дальнейшая проверка спецификации поставщика подтвердила, что оба этих образца также имеют отрицательный результат на анти-S1RBD (Spike Receptor Binding Domain) IgG методом иммуноферментного анализа и анти-N IgG/M методом анализа бокового потока (Дополнительная таблица S3), что указывает на отсутствие определяемых уровней антител в этих образцах.

Рисунок 7: Верификация CFDB с использованием предварительно охарактеризованных коммерческих сывороток человека. (A) Блот-изображение, представляющее анти-SARS-CoV-2 NP CFDB на международной референсной панели ВОЗ и образцах сыворотки RayBiotech PosSet. Образцы были выделены в трех столбцах и идентифицированы по этикеткам. (B) График, представляющий количественные значения интенсивности сигнала хемилюминесценции для блоттинга на панели А. Для установки порогового значения использовался отрицательный контроль, а все измерения являются средствами тройных пятен ± стандартных отклонений (SD). Эта цифра была взята из Norouzi et al.⁵. Сокращения: Neg Cont = образец отрицательного контроля, полученный путем объединения всех 10 образцов до COVID-19 от RayBiotech; RB N1 - N10 = предположительно отрицательные образцы RayBiotech от 1 до 10; RB P1 - P20 = RayBiotech предполагаемые положительные образцы от 1 до 20; CFDB = безклеточный точечный блоттинг; NP = нуклеокапсидный белок; ВОЗ = Всемирная организация здравоохранения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Независимое тестирование анализа CFDB с использованием сыворотки крови пациента
Чтобы продемонстрировать применимость анализа CFDB, мы предоставили материалы и инструкции CFDB независимой сотрудничающей лаборатории в другом месте (Национальная микробиологическая лаборатория (NML), Виннипег). Цель состояла в том, чтобы провести независимое тестирование платформы с использованием образцов пациентов, собранных в клинике группой полевых исследований в NML. В общей сложности 24 образца (x12 отрицательных и x12 положительных, подтвержденных методом ИФА на антитела к NP (Дополнительная таблица S4)) были подвергнуты CFDB, и результаты были проанализированы, как описано выше. Как видно на рисунке 8, CFDB правильно идентифицировала все x12 отрицательные и x12 положительные образцы, подтвердив надежность и практичность анализа в независимом тесте.

Рисунок 8: Независимое тестирование CFDB с использованием сывороток пациентов человека в NML. (A) Блот-изображение, представляющее анти-SARS-CoV-2 NP CFDB на 12 COVID-19-отрицательных (от N1 до N12) или 12 положительных (P1-P12) образцах пациентов. Сыворотки были пятны в трех экземплярах по столбцам, как и помечено. (B) Количественные значения интенсивности хемилюминесцентного сигнала из блота на панели А. Все измерения являются средними значениями тройных пятен ± стандартными отклонениями (SD). Эта цифра была взята из Norouzi et al.⁵. Сокращения: CFDB = бесклеточный точечный блот; NML = национальная микробиологическая лаборатория; NP = нуклеокапсидный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Независимое тестирование анализа CFDB с использованием сывороток хомяков, инфицированных SARS-CoV-2
Используя те же реагенты и инструкции CFDB, команда NML затем провела анализ CFDB на сыворотках хомяков, инфицированных SARS-CoV-2, чтобы проверить, можно ли использовать этот анализ для выявления ответа антител в образцах животных. Всего было протестировано 36 образцов, х12 прединфекционных и 24 постинфекционных сывороток. Предполагаемые положительные сыворотки крови были получены от животных, инфицированных 10-5-50% инфицирующими дозами культуры тканей (ТЦД₅₀) SARS-CoV-2, которые были отобраны через 140 дней после заражения (dpi 140, n = 3); или повторно инфицированы на DPI 140 и отобраны через 5 дней (dpi 5, n = 21). Как показано на рисунке 9, все сыворотки до заражения имели интенсивность сигнала ниже порогового значения, и 18 из 24 сывороток после инфекции (все через 5 дней после повторного заражения) вызывали дискретную положительную интенсивность сигнала. Интересно, что из шести предполагаемых положительных образцов, пропущенных CFDB, три образца (все с начальным разрешением 140 dpi) также не были обнаружены при использовании стандартного анти-NP ELISA (Дополнительная таблица S5), что указывает на потерю или снижение уровня антител с течением времени.

Рисунок 9: Независимое тестирование CFDB с использованием зараженных SARS-CoV-2 сывороток хомяков в NML. (A) Блот-изображение с изображением анти-SARS-CoV-2 NP CFDB на сыворотке крови хомяка до инфицирования (dpi 0, n = 12) через 140 дней после инфицирования (dpi 140, n = 3) и через 5 дней после повторного заражения (dpi 5, n = 21) с 10⁵ TCID₅₀ SARS-CoV-2. Каждый образец был нанесен в виде тройных пятен по столбцу и помечен в соответствии со схемой в оригинальном исследовании NML. (B) Количественные значения интенсивности хемилюминесцентного сигнала из блота на панели А. Все измерения являются средними значениями тройных пятен ± стандартными отклонениями (SD). Эта цифра была взята из Norouzi et al.⁵. Сокращения: CFDB = бесклеточный точечный блот; NML = национальная микробиологическая лаборатория; NP = нуклеокапсидный белок; dpi = дни после заражения; ТЦИД₅₀ = 50% инфекционная доза культуры тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный файл 1: Нуклеотидная последовательность для шаблона линейной экспрессии His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP. Сокращение: NP = нуклеокапсидный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Полная нуклеотидная последовательность плазмиды pET24b SpyCatcher2-Apex2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Обзор основных этапов приготовления бесклеточного лизата экспрессии белка E. coli BL21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S1: Построение карты для плазмиды pET24b SpyCatcher2-Apex2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Печатная копия основной сетки CFDB. Аббревиатура: CFDB = бесклеточный точечный блот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S3: Изображение мембраны CFDB NC и сборки главной сетки. Мембрана ЧПУ зажата между стеклянной пластиной внизу и шаблоном основной сетки сверху, фиксируя сборку с помощью стационарной ленты. Эта цифра была взята из Norouzi et al.⁵. Сокращения: CFDB = бесклеточный точечный блот; NC = нитроцеллюлоза Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S1: Полные рецепты компонентов раствора А и раствора В бесклеточной реакционной смеси. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S2: Образец информации для Справочной панели ВОЗ NIBSC 20/268 (также см. Рисунок 7). Сокращения: NISBC = Национальный институт биологических стандартов и контроля; ВОЗ = Всемирная организация здравоохранения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S3: Информация о образце RayBiotech CoV-PosSet (также см. рисунок 7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S4: Результаты NP ИФА для образцов сыворотки крови пациента (выполнено в NML). Смотрите также Рисунок 8. Сокращения: NP = нуклеокапсидный белок; ИФА = иммуноферментный анализ; NML = национальная микробиологическая лаборатория. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S5: Результаты NP ИФА для сыворотки хомяков, инфицированных SARS-CoV-2 (выполнено в NML). Смотрите также Рисунок 9. Сокращения: NP = нуклеокапсидный белок; ИФА = иммуноферментный анализ; NML = национальная микробиологическая лаборатория. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

COVID-19 подчеркнул важность доступной и надежной диагностики для борьбы со вспышками инфекций и оптимизации глобальных стратегий здравоохранения. Серологическое тестирование, позволяющее выявлять защитные антитела, оказалось необходимым для отслеживания трансмиссивности новых вариантов, выявления горячих точек, руководства разработкой вакцин, сортировки подозрительных случаев и защиты уязвимых групп населения¹⁴. Пандемия также выявила неравенство в доступе к тестированию, усугубляемое отставанием и требованиями к объектам со сложным оборудованием¹⁵. Таким образом, в настоящее время основное внимание уделяется укреплению наших глобальных мер реагирования на будущие вспышки, что потребует новых инноваций, снижающих барьеры для тестирования и способных быстро адаптироваться к непредсказуемым угрозам.

CFDB — это бумажный иммуноферментный анализ, который упрощает серологическое тестирование, обычно выполняемое с помощью ИФА или анализа бокового потока, путем иммобилизации образцов пациента в твердой фазе и доставки бесклеточных антигенов в мобильной фазе для обнаружения противовирусных антител⁵. Анализ может быть проведен в базовых лабораторных условиях с возможностями вестерн-блоттинга. Между тем, реагенты для CFDB могут производиться локально в условиях фундаментальных исследований и легко заменяться для перепрофилирования анализа на новые патогены. Химерный универсальный реагент для обнаружения SpyCatcher2-Apex2 является полезной функцией, которая устраняет необходимость в поиске коммерческих конъюгатов вторичных антител и эффективно производится в системе экспрессии E. coli . CFDB также обеспечивает высокую пропускную способность, позволяющую проводить параллельные клинические анализы за небольшую часть стоимости, всего 3 доллара США за набор для анализа по сравнению с примерно 300 долларами США за коммерческий 96-луночный ИФА.

Настройка CFDB для серологического тестирования на COVID-19 была достигнута путем разработки линейных шаблонов ДНК, которые предписывали бесклеточной системе транскрипции-трансляции производить целевой антиген SARS-CoV-2 NP. Затем сыворотки крови человека и животных были обнаружены на сетках нитроцеллюлозных мембран, и инкубация проводилась с использованием смеси экспрессии антигенов без клеток, за которой следовал репортерный белок SpyCatcher2-Apex2. В этом исследовании CFDB проводился на сыворотках крови от COVID-19 отрицательных и положительных субъектов, как в нашей лаборатории, так и в независимых условиях (NML), и в целом была достигнута хорошая корреляция с ИФА для различения положительных и отрицательных образцов. Используя объединенные здоровые сыворотки в качестве отрицательного контроля CFDB и рассчитывая пороговое значение анализа на основе этого образца, риск ложноотрицательной/положительной идентификации был сведен к минимуму.

Высокая чувствительность анализа CFDB проявляется в его способности четко различать все образцы в широко охарактеризованной Справочной панели ВОЗ NIBSC 20/268¹³, особенно образец с самым низким титром антител (Образец 20/140 низкий, см. Дополнительную таблицу S2 и Рисунок 7). Аналогичным образом, высокая специфичность CFDB проявляется в отсутствии ложноположительной идентификации любой из 35 здоровых сывороток, протестированных в этой работе. Важно отметить, что клиническая валидация на нескольких центрах подтвердила, что протокол CFDB достаточно прост для широкого использования и поддерживает высокую производительность, сравнимую со стандартными ИФА, при выполнении разными пользователями. По нашему опыту и как^{показано в других} исследованиях, бесклеточные антигены, продуцируемые в лизатах E. coli , стабильны в течение как минимум 3 месяцев при -20 °С, а несколько бесклеточных антигенных препаратов действуют неотличимо друг от друга.

Прежде чем широко внедрять платформу CFDB и перестраивать конструкцию системы в сторону новых патогенов, необходимо учесть несколько соображений. Платформа CFDB требует, чтобы вирусный антиген или фрагмент антигена был надлежащим образом синтезирован с помощью бесклеточной системы экспрессии, чтобы антигенные фрагменты присутствовали и были доступны для связывания антител. Например, изначально мы планировали также включить рецептор-связывающий домен (RBD) Spike (RBD) SARS-CoV-2 в наши анализы CFDB. Однако, несмотря на высокую экспрессию и потребность в сложных дисульфидных связях (в отличие от антигена NP, в котором отсутствуют аминокислоты цистеин), продукт RBD легко агрегировался и оказался нерастворимым в экстракте E. coli , что исключает его использование в качестве надежного зонда CFDB. В таких сценариях, когда для правильного сворачивания и антигенной функции требуются сложные посттрансляционные модификации, рекомендуется использовать бесклеточные системы на основе эукариот. Как и в случае с другими иммуноферментными анализами на основе пероксидазы, также крайне важно, чтобы образцы сыворотки с видимым гемолизом были исключены из-за потенциальной активности гемоглобинпероксидазы, искажающей результаты. Наконец, CFDB предназначен для обнаружения общего ответа антител и не сообщает о конкретном классе иммуноглобулинов, участвующих во взаимодействиях антител-антигенов.

В заключение, CFDB — это новый диагностический метод, который объединяет элементы бесклеточной синтетической биологии и точечного блоттинга для оптимизации серологического тестирования. CFDB предлагает экономически эффективную альтернативу традиционным ИФА, которые могут быть легко развернуты в исследовательских лабораториях по всему миру, когда требуются дополнительные мощности для тестирования, как это часто бывает во время пандемии. Таким образом, CFDB может служить передовым инструментом в следующих глобальных ответных мерах на пандемию, которые могут быть быстро адаптированы к возникающим угрозам и укрепят потенциал тестирования в странах с низким и средним уровнем дохода.

М.Н. и К.. являются соавторами метода бесклеточного точечного блоттинга. В связи с этим произведением подана предварительная патентная заявка (PCT/CA2024/050097, подана в январе 2024 года).

S.S. и R.Z. поддерживаются финансированием от Агентства перспективных оборонных исследовательских проектов (DARPA), контракт No N66001-23-2-4042. Выраженные взгляды, мнения и/или выводы принадлежат авторам и не должны толковаться как представляющие официальные взгляды или политику Министерства обороны или правительства США. Эта работа была поддержана средствами К.. из грантовой программы Фонда CIHR (201610FDN-375469), Канадской исследовательской программы CIHR (950-231075 и 950-233107), Инициативы Университета Торонто «Медицина по дизайну», которая получает финансирование от Канадского фонда передового опыта в области исследований и разработок и средств К.., от Министерства оборонных исследований и разработок Канады, Канадской программы безопасности и охраны (контракт 39903-200137). Рисунок 1 и дополнительный рисунок S1 были созданы с помощью SnapGene Viewer.