Идентификация генов, связанных с ферроптозом и гипоксией, в клетках-предшественниках олигодендроцитов, полученных из iPSC, у пациентов с рассеянным склерозом

Это исследование дает новое представление о взаимодействии между гипоксией, ферроптозом и иммунной инфильтрацией в патогенезе рассеянного склероза (РС) с помощью биоинформатического анализа. Используя взвешенный анализ сети коэкспрессии генов (WGCNA) и анализ белок-белковых взаимодействий (PPI), мы идентифицировали три ключевых гена-хаба (ITGB1, ITGB8 и VIM).

Рассеянный склероз (РС) — это хроническое воспалительное заболевание, характеризующееся демиелинизацией, при этом неудачная ремиелинизация приводит к прогрессирующей потере аксонов на хронических стадиях. Клетки-предшественники олигодендроцитов (ОПК) имеют решающее значение для ремиелинизации. Недавние исследования показывают, что как гипоксия, так и ферроптоз играют решающую роль в дисфункциональной дифференцировке OPC. Это исследование направлено на выявление ключевых генов, связанных с гипоксией и ферроптозом, а также характеристиками иммунной инфильтрации в OPC, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) пациентов с рассеянным склерозом, и на построение диагностической модели, основанной на этих ключевых генах.

Мы проанализировали данные экспрессии генов из наборов данных GSE196575 и GSE147315 и сравнили пациентов с рассеянным склерозом со здоровыми людьми. Используя взвешенный сетевой анализ коэкспрессии генов (WGCNA), мы точно определили гены первичного модуля и основные гены, связанные с гипоксией, ферроптозом и рассеянным склерозом. Z-балл ферроптоза и Z-балл гипоксии, рассчитанные с помощью анализа вариаций набора генов (GSVA), были выше в OPC пациентов с РС, полученных из iPSC, чем в контрольной группе. Вовлеченные гены преимущественно связаны с путем PI3K/Akt/mTOR, что было выявлено с помощью анализа обогащения пути Gene Ontology (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG).

Сеть белок-белковых взаимодействий (PPI) ключевых генов выявила 10 центральных узловых генов (COL4A1, COL4A2, ITGB5, ITGB1, ITGB8, ITGAV, VIM, FLNA, VCL и SPARC). Устойчивая экспрессия ITGB1, ITGB8 и VIM была подтверждена в наборе данных GSE151306, что подтверждает их роль в качестве ключевых генов-хабов. Кроме того, сеть взаимодействия между факторами транскрипции (TFs) и генами-хабами была установлена с помощью технологии Transcriptional Regulatory Relationships, Unraveled by Sentence-based Text (TRRUST), которая идентифицировала пять ключевых TF. Результаты этого исследования могут помочь пролить свет на новые биомаркеры или терапевтические мишени для лечения рассеянного склероза.

Рассеянный склероз (РС) — это хроническое воспалительное заболевание, характеризующееся демиелинизацией, которое поражает около 2,5 миллионов человек во всем мире. У большинства пациентов с диагнозом РС наблюдается рецидивирующе-ремиттирующее (RR) течение заболевания. Во время фазы рецидива острое воспаление приводит к неизбежной потере миелина и аксонов. И наоборот, во время ремиссии демиелинизированные поражения могут быть восстановлены путем ремиелинизации, обеспечивая трофическую поддержку аксонам и предотвращая прогрессирующую потерю аксонов¹. Сбой ремиелинизации возникает на хронических стадиях РС и приводит к прогрессирующей аксональной дегенерации².

Процесс ремиелинизации критически коррелирует с клетками-предшественниками олигодендроцитов (ОПК), включая пролиферацию и миграцию ОПК для дифференцировки в зрелые олигодендроциты (ОЛ), которые являются миелинобразующими клетками в центральной нервной системе (ЦНС)³. На начальных стадиях заболевания количество новых ОЛ, генерируемых OPC вокруг демиелинизированных поражений, относительно сохраняется и может успешно способствовать ремиелинизации4. Однако на поздних стадиях РС недостаточная миграция и дифференцировка ОПЦ приводят к снижению новых ОЛ и нарушению ремиелинизации5, что приводит к нервной дегенерации и накоплению инвалидности.

Были предложены две гипотезы для объяснения нейродегенерации при рассеянном склерозе. Внешняя гипотеза предполагает, что иммунный ответ, инициируемый активированными Т-клетками, вызывает демиелинизацию, а также^{нейродегенерацию}. Однако внутренняя модель предполагает, что внутренние аномалии в OPCs⁷, OLs⁸ и других клетках ЦНС могут способствовать нейродегенерации. Ранее считалось, что внутренняя модель применима только на более поздних стадиях РС, таких как первичный или вторичный прогрессирующий РС (PPMS и SPMS). Тем не менее, нейродегенерация, не зависящая от воспаления или рецидива, недавно наблюдалась при RRMS ^9,10, что позволяет предположить, что внутренние клеточные аномалии могут быть вовлечены на всех стадиях заболевания, включая RRMS.

Кроме того, ферроптоз, особый путь гибели клеток, связанный с железо-опосредованными нарушениями метаболизма липидов, играет ключевую роль в нейродегенерации. Этот путь включает в себя дисбаланс внутриклеточных окислительно-восстановительных состояний, вызванный избытком железа, что приводит к накоплению перекиси липидов и производству активных форм кислорода (АФК), что в конечном итоге приводит^к окислительной гибели клеток. Нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона, часто возникают из-за окислительного повреждения нейрональных клеток, которое часто вызывается необычно высокими концентрациями железа в поражениях. При РС повышенная уязвимость к окислительному повреждению в сочетании с митохондриальной дисфункцией из-за высокого содержания липидов и потребления кислорода клетками ЦНС способствует перекисному окислению липидов, что является критическим фактором ферроптоза. ОЛ чувствительны к перекисному окислению липидов, что является существенным признаком ферроптоза¹². Отложение железа вблизи воспалительных поражений позвоночника¹³ и уязвимость ОЛ к перекисному окислению липидов¹⁴ и свободным радикалам¹⁵ подчеркивают восприимчивость МС к ферроптозу.

Гипоксия является еще одним критическим фактором патогенеза РС, способствующим потере олигодендроцитов. Данные о гипоксииподобном повреждении и образовании АФК и оксида азота (NO) при острых поражениях РС указывают на то, что такие стрессоры могут ускорять митохондриальную дисфункцию и последующий дефицит^{энергии.} Этот метаболический стресс не только влияет на ОЛ, но и ухудшает работу соседних аксонов из-за нарушения передачи^{энергии17}, поскольку миелиновые каналы передают энергию между миелиновой оболочкой и периаксональными пространствами.

Первичные человеческие OPC и OLs ЦНС чрезвычайно труднодоступны у пациентов с РС. Таким образом, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), полученные из человеческих ОПЦ и ОЛ, стали многообещающими инструментами для изучения внутренних нарушений РС. В свете решающей роли ферроптоза и гипоксии в патогенезе РС и их влияния на линию олигодендроцитов, в данном исследовании был использован взвешенный анализ сети коэкспрессии генов (WGCNA) для извлечения информации о модуле¹⁸ и выяснения паттернов экспрессии генов, связанных с этими явлениями при РС. Проводя скрининг коэффициентов корреляции между генами, мы можем идентифицировать одинаковые или похожие сети или модули коэкспрессии, проливая свет на новые биомаркеры или потенциальные терапевтические мишени для РС. Кроме того, сосредоточившись на факторах транскрипции (ТФ), которые регулируют критические гены, это исследование обеспечивает основу для дальнейшего изучения механизмов и потенциальных стратегий вмешательства при РС.

1. Загрузка и предварительная обработка данных

1. Загрузите наборы данных GSE196575 и GSE147315 из Омнибуса экспрессии генов (GEO).
2. Объедините два набора данных и удалите пакетные эффекты с помощью онлайн-платформы анализа (см. Таблицу материалов).
   1. Выберите модуль Выражение | модуль слияния данных. Загрузите два файла матрицы выражений в качестве входных файлов и нажмите кнопку Выполнить, чтобы автоматически вывести объединенную матрицу.
   2. Создайте образец файла аннотаций в виде электронной таблицы.
   3. Выберите модуль «Выражение» | Снимите модуль пакетного эффекта. Введите файл аннотации и объединенную матрицу и нажмите кнопку «Выполнить», чтобы создать объединенную матрицу с удаленным пакетным эффектом (объединенная матрица 2).
3. Нормализация данных выражений с помощью функций слияния наборов данных, пакетного эффекта и нормализации , доступных на платформе онлайн-анализа. Выберите модуль выражения и модуль нормализации. Входная объединенная матрица 2 создана на шаге 1.2.3. Нажмите кнопку «Выполнить ». (см. Таблицу материалов).
4. Выведите файл матрицы выражений после выполнения всего процесса, описанного выше. Извлеките информацию о группировке в соответствии с вмешательством, представленным на веб-сайте ГЕО. Введите приведенную выше информацию в документ в формате «.txt», чтобы создать файл сведений о группировании для объединенного набора данных.

2. Дифференциальный анализ экспрессических генов

1. Выполните дифференциальный анализ экспрессии генов с помощью пакета limma в R. Введите файл матрицы экспрессии и файл информации о группировке. Установите критерии фильтрации на |logFC| = 1 и p < 0,05 , чтобы идентифицировать дифференциально экспрессируемые гены (DEG), связанные с рассеянным склерозом.

3. Анализ функционального обогащения (GO и KEGG)

1. Проведение функционального анализа обогащения для DEG с помощью модулей GO и KEGG на онлайн-платформах.
   1. Модельный организм был установлен на Homo sapiens, с Ensemble_109 версией в качестве фонового файла генов и генами в качестве типа данных.
   2. Избегайте широких терминов GO; уточнить анализ с помощью ToppFun. Применяйте фильтры, чтобы ограничить термины до 500 и 1000 ассоциированных генов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты фильтрации 500 генов представлены в основной рукописи. Полные результаты GO доступны на дополнительном рисунке S2. Онлайн-платформа KEGG показана на дополнительном рисунке S3.

4. Анализ вариаций набора генов для ферроптоза и гипоксии (GSVA)

1. Получите в общей сложности 538 генов, связанных с ферроптозом, из FerrDb и 200 генов, связанных с гипоксией, из MsigDB.
2. Создание файлов в формате GMT для обоих наборов генов.
3. Используйте модуль GSVA для вычисления Z-оценки ферроптоза и Z-оценки гипоксии для каждой выборки в объединенном наборе данных, а также используйте файл матрицы выражений, файл группирующей информации и файлы GMT в качестве входных данных.
4. Сравните Z-баллы разных групп (дополнительный рисунок S4).

5. Взвешенный сетевой анализ коэкспрессии генов (WGCNA)

1. Извлеките Z-показатель ферроптоза и гипоксии каждого образца, рассчитанный на шаге 4.4. Используйте приведенные выше Z-показатели ферроптоза и гипоксии в качестве файлов признаков вместе с файлами матрицы экспрессии, чтобы определить ключевые модули генов, связанные с ферроптозом и гипоксией.
2. Используйте модуль WGCNA и установите R² = 0,9 и мягкий порог β = 18 для построения взвешенной сети коэкспрессии генов. Сосредоточьтесь на модулях, в значительной степени связанных как с ферроптозом, так и с гипоксией (дополнительный рисунок S4).

6. Идентификация дифференциально экспрессируемых генов, связанных с ферроптозом и гипоксией у пациентов с РС

1. Скрещивайте связанные с заболеванием ДЭГ с модулями генов, связанных с ферроптозом и гипоксией, с помощью инструмента диаграммы Венна на онлайн-платформе анализа (дополнительный рисунок S3). Определите гены, связанные как с ферроптозом, так и с гипоксией при рассеянном склерозе.

7. Анализ сети белок-белковых взаимодействий (ИПП)

1. Введите пересеченные гены в модуль Multiple Proteins базы данных STRING.
2. Установите для организма значение Homo sapiens и нажмите «Поиск».
3. Используйте опцию CONTINUE в центре веб-страницы, чтобы создать сеть PPI.
4. Экспортируйте информацию о сети взаимодействия в формат TSV и импортируйте ее в программное обеспечение для анализа биоинформационных сетей (дополнительный рисунок S5).
5. Используйте плагин Cytohubba для определения топ-10 генов-хабов на основе алгоритма MCC.

8. Валидация с помощью набора данных GSE151306

1. Скачайте набор данных GSE151306 из ГЕО.
2. Используйте пакет limma в программном обеспечении R studio (коды языка R предоставлены в GitHub: https://github.com/Drxiazhang/Identification-of-Ferroptosis--and-Hypoxia-Related-Genes-in-iPSC-Derived-OPCs-from-MS) для проверки экспрессии генов-концентратора в различных группах, а также введите файл матрицы экспрессии, файл группировки проверочного набора и список генов хаба.

9. Построение ROC-кривой для генов-хабов

1. Используйте пакет pROC в R для построения ROC-кривых для дифференциально экспрессируемых генов-хабов.
2. Проверьте диагностическую ценность этих генов-концентраторов в наборе данных для проверки (коды языка R предоставлены в GitHub: https://github.com/Drxiazhang/Identification-of-Ferroptosis--and-Hypoxia-Related-Genes-in-iPSC-Derived-OPCs-from-MS).

10. Прогнозирование регуляторных сетей генов фактор-хаб транскрипции

1. Получите доступ к базе данных TRRUST v2 по адресу https://www.grnpedia.org/trrust/.
2. Используйте модуль Поиск ключевых регуляторов для запроса генов для определения факторов транскрипции, регулирующих 10 генов-хабов.
   1. Установите человека для вида. Введите факторы транскрипции и гены-концентраторы в модуль STRING Multiple Proteins , установите Homo sapiens для организмов и нажмите CONTINUE , чтобы создать регуляторную сеть.

Объединенный набор данных, состоящий из четырех здоровых людей в контрольной группе и девяти человек с рассеянным склерозом (PwMS), был проанализирован, а затем проверен в другом наборе данных из четырех PwMS и четырех здоровых контрольных групп. Протокол анализа показан на рисунке 1, а подробная информация обо всех образцах приведена в дополнительной таблице S1. В ходе анализа было идентифицировано 706 дифференциально экспрессируемых генов (DEGs, p < 0,01), 378 генов из которых были повышены и 328 генов были подавлены у пациентов с РС по сравнению с контрольной группой (рис. 2). Анализ функционального обогащения выявил значительное участие этих ДЭГ в различных биологических процессах. Примечательно, что наиболее обогащенные термины GO, уточненные 500 генами, включали фокальную адгезию, клеточно-субстратное соединение, интегрин-опосредованный сигнальный путь, связывание интегрина и связывание с кадгерином (рис. 3A-C). Анализ путей KEGG также показал, что эти гены преимущественно участвуют в сигнальном пути PI3K-Akt и сигнальном пути Hippo (рисунок 3D), которые имеют решающее значение в клеточных процессах, имеющих отношение к патогенезу рассеянного склероза.

Z-баллы ферроптоза и гипоксии, рассчитанные с помощью GSVA, были значительно выше в клетках-предшественниках олигодендроцитов (OPC), полученных из iPSC, у пациентов с рассеянным склерозом, чем у здоровых людей из контрольной группы (p = 0,0028 и 0,075 соответственно, рис. 4), что указывает на ключевую роль этих путей в этом заболевании. Этот вывод был поддержан WGCNA, которая идентифицировала два ключевых модуля гена (рис. 5A). Среди них бирюзовый модуль, состоящий из 3671 гена, был в значительной степени связан как с ферроптозом, так и с гипоксией (рис. 5B). Важно отметить, что 71 ген был идентифицирован на пересечении дифференциально экспрессируемых генов, связанных с заболеванием, и генов, входящих в модуль WGCNA, что свидетельствует о сильной корреляции с ферроптозом (бета=0,94, p=2e-06) и гипоксией (бета=0,92, p=7e-06) при РС (рис. 6).

Дальнейшее исследование сети ИПП выявило 10 генов центрального хаба, а именно: COL4A1, COL4A2, ITGB5, ITGB1, ITGB8, ITGAV, VIM, FLNA, VCL и SPARC (рис. 7). Эти гены-концентраторы были отмечены за их решающую роль в опосредовании клеточных процессов, связанных как с ферроптозом, так и с гипоксией.

Мы дополнительно проверили валидационный набор данных (GSE151306). Результаты показали, что три центральных гена (ITGAV, ITGB8 и VIM) были повышены в PwMS (рис. 8), что согласуется с результатами объединенного набора данных (дополнительный рисунок S1). Среди них ITGB8 был наиболее значительно повышенным геном. Эти результаты свидетельствуют о том, что ITGB8, член семейства интегринов, может быть критически вовлечен в патогенез рассеянного склероза, особенно в отношении механизмов ферроптоза и гипоксии. Кроме того, анализ кривой рабочих характеристик приемника (ROC) подтвердил, что ITGAV, ITGB8 и VIM обладают хорошей чувствительностью и специфичностью для диагностики заболевания (AUC=58,3%, 100% и 91,7% соответственно; Рисунок 9A-C), при этом ITGB8 демонстрирует AUC на уровне 100%, что демонстрирует его потенциал в качестве надежного биомаркера рассеянного склероза.

Наконец, была создана регуляторная сеть генов транскрипционного фактора и хаба, и три ключевых фактора транскрипции — HOXD3, SP1 и VHL — были идентифицированы как регуляторы генов-хаба (рис. 10). Эти факторы транскрипции могут играть важную роль в регуляции экспрессии генов в ответ на гипоксию и ферроптоз, что еще больше подчеркивает их потенциальное участие в прогрессировании РС.

Видео 1: Корональный снимок, полученный с помощью низкочастотного преобразователя, центрированного на правой гемидиафрагме, показывает качественно нормальный ход диафрагмы при дыхании при жизненной емкости легких. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Рисунок 1: Блок-схема, показывающая план исследования. Сокращения: РС = рассеянный склероз; GSVA = анализ вариаций набора генов; WGCNA = взвешенный анализ сети коэкспрессии генов; KEGG = Киотская энциклопедия генов и геномов; GO = Онтология генов; ИПП = белок-белковое взаимодействие; ROC = Рабочая характеристика ресивера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Вулканический график, иллюстрирующий дифференциально экспрессируемые гены между здоровой контрольной группой и группой с рассеянным склерозом. Сокращения: FC = критерии фильтрации; PEG3 = отцовски экспрессированный ген 3; NEBL = туманность; CRABP1 = клеточный белок, связывающий ретиноевую кислоту 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Анализ функционального обогащения дифференциально экспрессируемых генов. (А-С) Категории онтологии генов уточнены путем фильтрации 500 генов, включая (А) Молекулярную функцию, (Б) Биологический процесс и (В) Клеточный компонент. (D) Анализ обогащения путей KEGG с указанием путей, обогащенных за счет ДЭГ. Сокращения: DEGs = дифференциально экспрессируемые гены; GO = Онтология генов; MF = молекулярная функция; БП = биологический процесс; CC = клеточный компонент; KEGG = Киотская энциклопедия генов и геномов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Диаграмма блока, сравнивающая Z-показатели ферроптоза и гипоксии между здоровой контрольной группой и группой с рассеянным склерозом. Z-баллы ферроптоза и гипоксии рассчитывали с помощью GSVA. Контрольная группа показана синим цветом, а группа РС — красным. Статистические сравнения проводились с помощью теста Вилкоксона. ** обозначает значения p в диапазоне от 0 до 0,01. Сокращения: РС = рассеянный склероз; HC = здоровый контроль; GSVA = Анализ вариаций набора генов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Результаты взвешенного сетевого анализа коэкспрессии генов. (A) Кластерная дендрограмма генов, разделенных на модули. (B) Корреляции между модулями и признаками, связанными с гипоксией и ферроптозом. Сокращение: ADJ = скорректированный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Диаграмма Венна, показывающая 71 пересекающийся ген. Диаграмма иллюстрирует наложение ДЭГ у пациентов с рассеянным склерозом с генами из модулей, связанных с гипоксией и ферроптозом. Сокращения: WGCNA = взвешенный анализ сети коэкспрессии генов; ДЭГ = дифференциально экспрессируемые гены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7: Сетевая диаграмма белок-белковых взаимодействий между 10 идентифицированными генами-хабами. Сокращения: VCL = винкулин; FLNA = филамин А; ITGAV = субъединица интегрина альфа V; GOL4A2 = цепь альфа-2 коллагенового типа IV; COL4A1 = цепь альфа 1 коллагенового типа IV; ITGB5 = интегриновая субъединица бета 5; VIM = Виментин; SPARC = секретируемый белок, богатый кислотой и цистеином; ITGB8 = субъединица интегрина Beta 8; ITGB1 = Интегриновая субъединица бета 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 8: Гистограмма, показывающая уровни экспрессии генов-хабов в валидационном наборе данных (GSE151306). * обозначает значения p от 0,01 до 0,05, а # обозначает значения p от 0,05 до 0,2. ns обозначает значения p в диапазоне от 0,2 до 1. Сокращения: HC: здоровые контрольные группы; РС: рассеянный склероз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 9: ROC-кривые для оценки диагностической чувствительности и специфичности дифференциально экспрессируемых генов-хабов у GSE151306. (A) Кривая ROC для ITGAV. (B) ROC-кривая для ITGB8. (C) ROC-кривая для VIM. Сокращения: ROC = рабочая характеристика ресивера; ITGAV = интегриновая субъединица альфа V; ITGB8 = субъединица интегрина бета 8; VIM = виментин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 10: Диаграмма регуляторной сети гена-хаба транскрипционного фактора. Треугольники представляют факторы транскрипции; Квадраты представляют гены-концентраторы. Сокращения: ITGB1 = интегриновая субъединица бета 1; ITGAV = интегриновая субъединица альфа V; VIM = Виментин; SPARC = секретируемый белок, кислый и богатый цистеином; COL4A2 = цепь альфа 2 коллагенового типа IV; HOXD3 = гомеобокс D3; VHL = супрессор опухолей фон Хиппеля-Линдау; SP1 = Белок специфичности 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 11: Влияние интегрина β1 на путь PI3K-Akt. Форма расширения с открытой головкой (активное состояние, высокое сродство) интегрин β1 может образовывать «фокальную адгезию» и «фокальные комплексы» и взаимодействовать с FAK и Scr-киназой. Активный комплекс FAK/Src и рекрутирует молекулы-адаптеры для активации пути PI3K-Akt. Эта цифра была адаптирована из Янь и Цуй³⁷. Сокращения: PI3K = фосфатидилинозитид-3-киназа; FAK = киназа фокальной адгезии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок S1: Тренды экспрессии ключевых генов в объединенном наборе данных. Для статистического тестирования использовалась функция Wilcox.test из пакета R "limma". "*" обозначает p-значения от 0,01 до 0,05, а "#" указывает на p-значения от 0,05 до 0,2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот рисунок.

Дополнительный рисунок S2: Исходная схема анализа дифференциально экспрессируемых генов с помощью онтологии генов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот рисунок.

Дополнительный рисунок S3: Домашняя страница онлайн-аналитической платформы Omicshare. Этот веб-сайт является китайским биоинформационным хабом, на котором был выполнен KEGG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот рисунок.

Дополнительный рисунок S4: Домашняя страница онлайн-аналитической платформы Biowinford, на которой проводился WGCNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот рисунок.

Дополнительный рисунок S5: Домашняя страница базы данных STRING, на которой был выполнен PPI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот рисунок.

Дополнительная таблица S1: Характеристики объединенных и проанализированных образцов и наборов данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Учитывая его ключевую роль в процессе ремиелинизации, миграция, дифференцировка и гибель ОПК уже давно определены как решающие факторы патогенеза РС и терапевтические мишени РС. Независимая от воспаления прогрессирующая нервная дегенерация наблюдалась при всех трех типах РС¹⁹, а в центре демиелинизированных поражений была отмечена выраженная потеря олигодендроцитов²⁰, предполагая, что первичные нарушения клеток линии олигодендроцитов могут ускорить прогрессирование РС.

В этом исследовании мы провели биоинформатический анализ целевых последовательностей мРНК, сосредоточившись на генах, связанных с ферроптозом и гипоксией в iPSC-индуцированных OPC от PwMS и здоровых контрольных групп с помощью объединенных наборов данных из четырех здоровых контрольных групп и девяти PwMS. Мы обнаружили 706 DEG, 378 из которых были повышены, а 328 — понижены. Кроме того, мы идентифицировали гены, связанные с ферроптозом и гипоксией, и сравнили их экспрессию в индуцированных iPSC OPC пациентов с рассеянным склерозом и здоровой контрольной группы, рассчитав Z-оценку каждого образца. Z-баллы ферроптоза и гипоксии были значительно выше у PwMS, чем у здоровых контрольных групп.

Гипоксия играет значительную роль в олигодендроглиопатии при РС. Патологоанатомические исследования продемонстрировали дистальную олигодендроглиопатию при поражениях РС III типа, напоминающих ишемический инсульт белого вещества¹⁶ , а также гипоксические травмы наряду с повышенными уровнями АФК и NO при острых поражениях РС²¹. Нарушение комплекса IV митохондриальной дыхательной цепи ухудшает образование и жизнеспособность OPC и зрелых олигодендроцитов¹⁵, хотя точные механизмы, лежащие в основе этого нарушения, еще предстоит выяснить.

Кроме того, было обнаружено, что ферроптоз, железозависимая форма запрограммированной клеточной смерти, опосредует потерю олигодендроцитов и прогрессирование демиелинизации в^{животных моделях} с РС, индуцированным купризоном. Секвенирование одиночных клеток выявило снижение экспрессии генов антиферроптоза в OPC и OL в тканях мозга из PwMS²³. В хронической фазе рассеянного склероза дефицит железа в олигодендроцитах может нарушить ремиелинизацию и нарушить целостность аксонов в белом веществе, что приводит к прогрессированию заболевания²⁴. Более того, snRNA-seq поражений РС в белом веществе позволяет предположить, что ферроптоз преимущественно активен в поражениях белого вещества у пациентов с РС и связан с активацией фагоцитарной системы²⁵. У экспериментальных мышей с аутоиммунным энцефаломиелитом (ЭАЭ) уровни GPX4, важного регулятора ферроптоза, снижены на²⁶. Прогрессирование заболевания EAE может быть ускорено ферроптозом, индуцированным ACSL4, который усиливает передачу сигналов Т-клеточного рецептора (TCR). Блокирование ферроптоза и ACSL4 значительно замедляет прогрессирование инвалидности при EAE²⁷.

Ферроптоз участвует в снижении когнитивных функций, вызванном гипоксией, на крысовых моделях²⁸. Гипоксия и индуцируемый гипоксией фактор-1α способствуют пролиферации и миграции ганглиев дорсальных корешков²⁹. Таким образом, ферроптоз и гипоксия могут действовать синергетически в патогенезе РС. С помощью WGCNA наше исследование выявило два важных модуля; бирюзовый модуль, в частности, сильно коррелировал со статусом РС, гипоксией и ферроптозом. На основании результатов WGCNA и ДЭГ мы идентифицировали 71 ключевой ген, которые одновременно коррелировали с ферроптозом, гипоксией и РС.

Анализ функционального обогащения 706 DEG с помощью GO и KEGG показал, что сигнальный путь PI3K-Akt является ключевым в развитии РС. Ингибирование CXCR2 усиливает дифференцировку OPC и способствует ремиелинизации в моделях мышей с рассеянным склерозом путем активации передачи сигналов PI3K/AKT/mTOR³⁰. Дисбаланс в снабжении кислородом может влиять на сигнальные пути MAPK/PI3K-Akt, запуская ключевые механизмы, участвующие в окислительном стрессе³¹.

Анализ ИПП показал, что 10 генов-хабов, а именно COL4A1, COL4A2, ITGB5, ITGB1, ITGB8, ITGAV, VIM, FLNA, VCL и SPARC, одновременно коррелировали с гипоксией, ферроптозом и рассеянным склерозом, с заметной гиперэкспрессией у пациентов с рассеянным склерозом по сравнению с контрольной группой. Эти гены были дополнительно проверены в GSE151306, базе данных индуцированных iPSC линий OPC, полученных от пациентов с SPMS. Мы обнаружили, что ITGAV, ITGB8 и VIM также были повышены в валидационном наборе. В частности, ITGB8 — часть семейства интегринов — был значительно сверхэкспрессирован при МС, что согласуется с комбинированными тестовыми наборами GSE147315 и GSE196575.

Ген ITGB8 является членом семейства интегринов (ITG) и кодирует интегрин бета 8, который, как сообщалось ранее, является регулятором роста опухоли и метастазирования^32,33. Интегрин бета 8 сильно экспрессируется OPC и зрелыми олигодендроцитами. Одно исследование показало, что остеопонтин защищает OPC от H2O2-индуцированного апоптоза путем повышения регуляции интегринов, включая ITGB8³⁴. Эти результаты указывают на то, что ITGB8 играет роль в выживании клеток в условиях окислительного стресса. При рассеянном склерозе, где преобладает окислительный стресс, ITGB8 может помочь OPC выжить и дифференцироваться в олигодендроциты для увеличения ремиелинизации.

ITGAV кодирует субъединицу интегрина альфа V, которая регулирует ангиогенез и прогрессирование рака. ITGAV в сочетании с бета-5 (образующим интегрин αvβ5) опосредует активацию микроглии в ответ на отложение фибронектина и витронектина, которые повышены при поражениях РС. В модели EAE на крысах с рассеянным склерозом интегрин avβ5 активировал микроглию, что привело к увеличению экспрессии матриксной металлопротеиназы-9 (MMP-9), фермента, который разрушает внеклеточный матрикс и белки миелина, способствуя демиелинизации³⁵.

Примечательно, что один из центральных генов, который был дифференциально экспрессирован в нашем объединенном наборе, ITGB1, был обнаружен повышенным в CD4+ Т-клетках, выделенных из спинномозговой жидкости пациентов с рассеянным склерозом³⁶. Интегрин β1 оказал заметное влияние на сигнальный путь PI3K-Akt, что согласуется с нашими выводами (рис. 11)³⁷. Кроме того, повышенная экспрессия β1-интегрина была обнаружена на клетках Th17 у пациентов с рассеянным склерозом по сравнению со здоровыми контрольными группами. Активация β1-интегрина в клетках Th17 может значительно повысить уровень глутамата и способствовать развитию нейровоспаления³⁸.

Мы провели анализ ROC-кривой для оценки потенциала экспрессии ITGAV, ITGB8 и VIM в OPC в качестве биомаркеров для прогнозирования риска РС. AUC ITGB8 составил 100%, за ним следуют 91,7% для VIM и 58,3% для ITGAV. В настоящее время нет исследований, сообщающих о связи экспрессии ITGB8 в олигодендроцитах с РС. Необходимо провести дальнейшие исследования для изучения использования ITGB8 в качестве биомаркера для прогнозирования РС.

Наконец, мы построили сеть генов транскрипционного фактора-хаба и определили три ключевых фактора транскрипции: HOXD3, SP1 и VHL. SP1 — это транскрипционный фактор, который связывается со многими промоторами. Было показано, что SP1, известный своим широким связыванием с промоторами, регулирует экспрессию Prdx6, ингибирует АФК и устраняет ферроптоз в средах с высоким содержанием глюкозы^. Экспрессия SP1 также связана с активностью фактора некроза опухоли (TNF), который играет решающую роль в развитии RRMS⁴⁰. Андрогенный рецептор (АР), еще один идентифицированный фактор транскрипции, активируется стероидными гормонами и обнаруживается в астроцитах в зонах ремиелинизации, что подчеркивает его потенциальное участие в функции олигодендроцитов⁴¹.

Иммунные пути и клетки играют важную роль в патогенезе и нейродегенерации РС и, возможно, связаны с ферроптозом, гипоксией и OPC. Наблюдения за мышами, интоксикаторзовавшими купризоном, а также за прогрессирующими поражениями РС показали высокую распространенность и скорость пролиферации CD8⁺ Т-клеток с гиперэкспрессией цитотоксических гранул⁴². Достаточно активированные Т-клетки способны взаимодействовать с антигенпрезентирующими олигодендроцитами, что потенциально приводит к CD8⁺ Т-клеточному разрушению олигодендроцитов. В опухолевом микроокружении интерферон-γ, секретируемый CD8⁺ Т-клетками, снижает экспрессию цистеина глутаматита (xCT), усиливая ферроптоз⁴³. Кроме того, было высказано предположение, что ферроптоз активирует Т-клетки через передачу сигналов Т-клеточных рецепторов в моделях EAE²⁴.

Текущие исследования OPC значительно ограничены из-за дефицита этих клеток. Это ограничение может быть частично устранено с помощью iPSC-индуцированных OPC. Тем не менее, в большинстве исследований OPC, индуцированных iPSC, используются небольшие размеры выборки, обычно менее 10 доноров, из-за трудоемкого и дорогостоящего процесса индукции клеток. Наше исследование дает более надежные результаты за счет интеграции образцов из нескольких исследований.

Мы дополнительно усовершенствовали биоинформатический конвейер, разделив доступный набор данных на обучающий и валидационный наборы. Такой подход сводит к минимуму потенциальные погрешности, вызванные различиями в методах индукции клеток и методах секвенирования в разных лабораториях. Большинство существующих исследований рассеянного склероза либо сосредоточены на нейродегенерации, вызванной воспалением, либо используют изолированный анализ ферроптоза. Традиционный анализ экспрессии генов полезен для идентификации отдельных дифференциально экспрессируемых генов, но часто не позволяет выявить сложные сети взаимодействия и паттерны коэкспрессии, связанные с прогрессированием РС. В отличие от этого, наша методология использует WGCNA для создания сети коэкспрессии генов, позволяющей идентифицировать генные модули, сильно коррелирующие как с ферроптозом, так и с гипоксией. Это обеспечивает системное понимание того, как эти пути взаимодействуют в рамках патологии РС, что не достижимо только с помощью стандартных методов дифференциальной экспрессии.

Этот метод может быть применен к новым методам лечения рассеянного склероза путем выявления генов-мишеней для терапии, направленной на снижение нейродегенерации. Он также может быть использован при других нейродегенеративных заболеваниях, связанных с ферроптозом и гипоксией, таких как болезнь Паркинсона или Альцгеймера, для разработки индивидуальных вмешательств и прогнозирования терапевтических реакций.

Наше исследование имеет несколько ограничений. Во-первых, далее необходима валидация in vivo и in vitro . Во-вторых, наши результаты получены из двух баз данных и были проверены в одной базе данных, охватывающей ограниченное число пациентов. Для дальнейшего исследования следует собрать более крупные когорты. В-третьих, учитывая сложность доступа к человеческим OPC, база данных, которую мы приняли, была основана на индуцированных iPSC OPC, которые могут не полностью напоминать человеческие ткани. В будущем следует провести дополнительные исследования, направленные на изучение влияния гипоксии и ферроптоза на дифференцировку и гибель клеток линии олигодендроцитов при РС.

Еще одним ограничением данного исследования является невозможность анализа взаимодействий иммунных клеток из-за использования OPC, полученных из iPSCs, в которых отсутствуют иммунные клетки, присутствующие при поражениях при рассеянном склерозе. В то время как иммунные клетки имеют решающее значение в патогенезе РС, это ограничение отражает проблемы использования культур, полученных из ИПСК. Будущие исследования должны быть сосредоточены на перекрестных помехах между OPC-иммунными клетками через системы кокультур или органоиды, которые могут лучше моделировать клеточные взаимодействия в среде рассеянного склероза.

Авторы не имеют конкурирующих интересов, которые имеют отношение к содержанию данной статьи.

Это исследование было поддержано и профинансировано Национальным финансированием клинических исследований больниц высокого уровня (2022-PUMCH-B-103). Авторы хотели бы поблагодарить доктора Шуан Сонг (Shuang Song), факультет биостатистики, Гарвардская школа общественного здравоохранения им. Т. Х. Чана, Гарвардского университета, за ее ценные советы и рекомендации на этапе редактирования этой статьи.