Использование гипербарического кислорода для повышения радиочувствительности клеток глиомы U251 человека

Этот протокол показывает, что гипербарическая оксигенация может усиливать пролиферацию, ингибирование и апоптоз клеток глиомы U251, обработанных рентгеновским облучением, путем блокирования клеток в фазе G2/M. Это улучшает радиочувствительность клеточных линий глиомы человека.

Целью данного исследования было изучение использования гипербарического кислорода для повышения радиочувствительности клеток глиомы человека. Субкультивируемые клетки глиомы человека U251 были случайным образом разделены на четыре группы: необработанная контрольная группа, клетки, обработанные только гипербарическим кислородом (ГБО), клетки, обработанные только рентгеновским облучением (рентгеновским излучением), и клетки, обработанные как ГБО, так и рентгеновским излучением. В этих группах наблюдались клеточная морфология, клеточная пролиферативная активность, распределение клеточного цикла и апоптоз для оценки роли ГБО в повышении радиочувствительности клеток глиомы. С увеличением доз рентгеновского излучения (0 Гр, 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр, 8 Гр) фракция выживаемости (СФ) клеток глиомы постепенно снижалась.

Достоверно более низкий SF наблюдался для клеток, обработанных HBO и рентгеном вместе, чем в рентгенологической группе для каждой дозы (все P < 0,05). Ингибирование пролиферации было достоверно выше в группе ГБО в сочетании с рентгенологической группой, чем в рентгенологической группе для каждой дозы (все P < 0,05) для клеточной линии U251. Процент G2/M фазовых клеток был достоверно выше в группе ГБО в сочетании с группой рентгенографии (2 Гр) (26,70% ± 2,46%) и группой ГБО (22,36% ± 0,91%), чем в контрольной группе (11,56% ± 2,01%) и группе рентгенографии (2 Гр) (10,35% ± 2,69%) (все группы P < 0,05). Апоптоз клеток U251 был достоверно выше в группе ГБО в сочетании с рентгенологией (2 Гр), чем в группе ГБО, группе рентгенографии (2 Гр) и контрольной группе (все P < 0,05). Мы пришли к выводу, что ГБО может усиливать ингибирование пролиферации и апоптоз клеток глиомы U251 путем блокирования клеток глиомы в фазе G2/M и улучшать радиочувствительность клеток глиомы U251.

Глиома является первичной внутричерепной опухолью, которая происходит из глиальных клеток центральной нервной системы¹. В настоящее время стратегия лечения глиомы заключается в хирургическом вмешательстве в сочетании с лучевой терапией и химиотерапией. Послеоперационная лучевая терапия глиомы может обеспечить преимущества в выживаемости (доказательства I степени), а ранняя послеоперационная лучевая терапия может эффективно продлить выживаемость пациента (доказательства II степени)². При глиомах высокой степени злокачественности (III или IV степени), особенно высокозлокачественной и инвазивной глиобластоме (доказательства III степени)³, послеоперационная лучевая терапия должна быть проведена как можно раньше (<6 недели). Однако, несмотря на раннее вмешательство, глиома все еще имеет высокую частоту рецидивов и плохой прогноз после комплексного лечения. Эти исходы в основном связаны с низкой радиочувствительностью глиомы. Факторы, связанные с радиочувствительностью опухоли, включают присущую опухолевым клеткам радиочувствительность, гипоксические или негипоксические опухолевые клетки, долю гипоксических опухолевых клеток и способность периопухолевой ткани восстанавливать радиационные повреждения⁴.

Среди этих факторов важное влияние на радиочувствительность опухоли оказывают гипоксические или негипоксические опухолевые клетки и доля гипоксических опухолевых клеток. Гипербарическая оксигенация (ГБО) может улучшить накопление кислорода в тканях за счет увеличения напряжения кислорода в тканях и диффузии кислорода в крови. ГБО также может оказывать ряд полезных биохимических, цитологических и физиологических эффектов⁵. Например, ГБО оказывает выраженное репаративное действие на радиационные повреждения, вызванные лучевой терапией. Несмотря на то, что ГБО в сочетании с лучевой терапией или химиотерапией повышает клиническую эффективность лучевой терапии или химиотерапии при глиоме^{6-го уровня}, ведутся значительные споры о том, как ГБО сам по себе влияет на рост злокачественной глиомы. Ding et ^al.7 и Wang et ^al.8 продемонстрировали, что HBO способствует росту глиомы in situ у мышей с помощью механизмов, которые включают ингибирование апоптоза и стимулирование ангиогенеза опухоли. Сообщается, что в физиологических условиях ГБО способствует ангиогенезу опухолей, вызывая окислительный стресс⁹.

Тем не менее, одно исследование показало, что кратковременное воздействие ГБО способствует пролиферации опухолевых клеток, в то время как длительное воздействие ГБО способствует апоптозу и ингибирует пролиферацию^. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить, способствует ли ГБО росту глиомы или подавляет его, и как ГБО в сочетании с лучевой терапией или химиотерапией может вызвать терапевтическую сенсибилизацию. В частности, необходимы механистические подробности о том, как ГБО улучшает радиочувствительность глиомы. Чтобы изучить, как ГБО улучшает радиочувствительность клеток глиомы U251 человека в этом исследовании, мы использовали ГБО в сочетании с рентгеновским облучением на пролиферацию клеток глиомы и наблюдали влияние на распределение клеточного цикла и апоптоз.

Все методы исследования были одобрены Институциональным наблюдательным советом и Комитетом по этике Второй больницы, аффилированной с Университетом Ланьчжоу, и проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами.

1. Лечение клеток глиомы

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте использовалась клеточная линия глиомы U251.

1. Культура клеток U251
   1. Семена клеток U251 в нескольких чашках с DMEM, содержащим 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), и культивируют их при 37 °C с 5%_CO2.
   2. При достижении 50%-60% конфлюенции диссоциируйте клетки с помощью раствора трипсина-ЭДТА (0,25%, без фенолового красного) и затем дайте им вырасти до 80% конфлюенции.
2. Рентгеновское облучение
   1. Накройте планшеты или колбы эквивалентным тканевым компенсатором толщиной до 1 см. Затем подвергните клетки рентгеновскому облучению, подаваемому из линейного ускорителя мощностью 6 МВ с расстоянием между источником и ячейкой 100 см, регулируемым нажатием кнопки вращения на плате дистанционного управления.
   2. Попросите физика измерить дозу облучения и сделать поправку на затухание. В качестве контроля поместите колбы с фильтрующими средами в детектор перед рентгеновским облучением.
3. Гипербарическая оксигенация (ГБО)
   1. Продезинфицируйте камеру ГБО, включив ультрафиолетовое излучение на 15 минут, а затем залите ее 0,02 МПа чистого кислорода на 5 минут.
   2. После помещения клеток в планшеты или колбы с культуральными культурами в камеру нажмите на кнопку регулятора давления на плате управления снаружи камеры, чтобы увеличить давление ГБО в камере до 0,2 МПа (2,0 АТА) в течение 30 мин облучения.
   3. Через тридцать минут нажмите на кнопку регулятора давления , чтобы снизить давление HBO до прежнего уровня давления (0,1 МПпа). Затем обрабатывайте флаконы или планшеты с бактериологией ГБО 1 раз в день в течение 3 дней подряд.

2. Клетки глиомы U251 в разных группах

1. Установите контрольную группу, рентгеновскую (2 Гр) группу и ГБО в сочетании с рентгеновской (2 Гр) группой для расчета кривых роста клеток.
2. Приготовьте одноклеточные суспензии из клеток глиомы U251, показывающих максимальные темпы роста (см. шаг 1.1.2). Отрегулируйте плотность клеток до 1 × 10⁶/мл, подсчитав клетки с помощью предметного стекла гемоцитометра. Затем добавьте 1 мл клеточной суспензии в культивальный флакон (плотность клеток: 1 × 10⁶ / флакон) с тремя отдельными флаконами для каждой группы.
3. Оцените морфологию клеток при 100-кратном увеличении с помощью светлопольного микроскопа, чтобы подсчитать адгезивные клетки через 24, 48 и 72 часа культивирования.

3. Радиочувствительность клеток глиомы U251 (анализ клонообразования) в течение 30 мин после ГБО

1. Одноклеточную суспензию U251 засевать во все лунки в концентрации 5 × 10² клеток/мл в 6-луночные планшеты, а затем подвергнуть их воздействию указанной дозы рентгеновского облучения (0 Гр, 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр и 8 Гр), исследуя три параллельных образца для каждой дозы рентгеновского излучения.
2. Для ГБО в сочетании с группой рентгеновского излучения (2 Гр) подвергнуть клетки рентгеновскому облучению в течение 30 минут после лечения ГБО. После обработки культивируют клетки при 37 °C с 5%_CO2 в течение 14 дней.
3. После того, как клоны станут видны, удалите среду и промойте клоны 2 раза PBS.
4. Зафиксируйте клетки в 1 мл 10% метанола на 15 минут перед окрашиванием 1 мл 0,1% кристаллического фиолетового на 20 минут.
5. После окрашивания промойте клетки 6 мл дистиллированной воды с помощью пипетки, а затем отсадите кристаллический фиолетовый раствор. Дайте клеткам высохнуть на воздухе.
6. Подсчитайте под микроскопом клоны диаметром от 0,3 мм до 1,0 мм, чтобы убедиться, что в одном клоне содержится >50 клеток.
7. Рассчитайте фракцию выживаемости (SF) с помощью уравнения (1):
   SF = × 100% (1)
8. Используя статистическое программное обеспечение, построить кривую доза облучения-выживаемость на основе модели множественной мишени одиночного поражения (SHMT) с помощью уравнения (2):
   S = 1 - (1 - )^N (2)
   где S = вероятность выживания; k = средняя смертельная доза (доза, вызывающая в среднем одно попадание на клетку); x = количество попаданий в ячейку; N = количество целей (количество попаданий для гибели клетки).
9. Для оценки влияния HBO на радиочувствительность клеток глиомы U251 необходимо рассчитать радиобиологические параметры, включая среднюю смертельную дозу (D₀), квазипороговую дозу (Dq), число экстраполяции (N), фракцию выживаемости при дозе облучения 2 Гр (SF₂), коэффициент усиления сенсибилизации (D₀) (SER = D₀ в контрольной группе/D₀ в опытной группе) и SER (Dq) (SER = Dq в контрольной группе/Dq в экспериментальной группе).
   где D₀ = величина, обратная наклону линейной части кривой выживаемости (доза, снижающая выживаемость на 63%)
   N = значение точки пересечения, образованное экстраполяцией линейной части на соответствие ординате (отражая способность клетки восстанавливать повреждения, вызванные радиацией)
   Dq = значение проективной точки пересечения на абсциссе и пересечения, образованного проведением линии через 1,0 по ординате и параллельно абсциссе для пересечения с линией экстраполяции.

4. Анализ подсчета клеток для оценки пролиферации клеток глиомы U251

1. Определите контрольную группу, группу ГБО и группы, получавшие рентгеновское излучение (0 Гр, 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр, 8 Гр) отдельно или в сочетании с ГБО.
2. Отрегулируйте плотность клеток до 1 ×^{10 4} клеток/мл с помощью клеток U251 в одноклеточных суспензиях.
3. Посев клеточных суспензий (100 μл, плотность: 1 × 10³/лунка) в 96-луночные планшеты (по пять лунок в группе). Проведите анализ подсчета клеток (см. Таблицу материалов), а затем определите оптическую плотность (OD) на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов после 48 ч культивирования реагентом.
4. Рассчитаем скорость ингибирования пролиферации клеток (IR) в соответствии с уравнением (3):
   IR = × 100% (3)

5. Выявление апоптоза клеток глиомы U251

1. Набор контрольных, ГБО, рентгеновских (2 Гр) и ГБО в сочетании с рентгеновскими (2 Гр) группами.
2. Удалите среду после посева и промойте клетки 1x PBS.
3. Отделите клетки с помощью трипсина, а затем деактивируйте трипсин путем добавления DMEM, когда под микроскопом будет наблюдаться округлая морфология клеток.
4. Переложите ячейки в центрифужную пробирку и центрифугуйте на 5 мин при давлении 200 × г.
5. Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте 3 мл 1x PBS в гранулу и аккуратно пипеткой, чтобы восстановить суспендию клеток.
6. Снова центрифугируйте клетки при 200 × г в течение 5 минут. Затем аспирируйте надосадочную жидкость PBS и промойте клетки 2 раза, прежде чем повторно суспендировать их с помощью щадящего пипетирования в 50 мкл связывающего буфера.
7. Добавьте 5 мкл аннексина V-FITC в клетки при 4 °C и инкубируйте клетки в темноте при 4 °C в течение 15 мин перед добавлением 400 мкл связывающего буфера. Переложите смесь в проточную цитометрическую пробирку, содержащую 5 мкл раствора красителя пропидия йодида (PI) (10 мг/мл). Обнаружить апоптотические клетки через 5 мин с помощью проточной цитометрии¹¹.
8. Запишите красную флуоресценцию на волне возбуждения 488 нм, введите их в компьютер для анализа процента каждого клеточного цикла в 5000 клетках, а затем распечатайте пики апоптотических клеток.
9. Соберите красную и зеленую флуоресценцию с помощью двойной маркировки аннексина V и PI, введите их в компьютер для анализа, а затем распечатайте точечную диаграмму.

6. Определение распределения клеточного цикла глиомы U251

1. Промойте вышеупомянутые клетки 2 раза 1 мл PBS перед обработкой их трипсином.
2. Когда с помощью световой микроскопии обнаружена округлая морфология клеток, добавьте DMEM, содержащий 10% FBS.
3. Центрифугируйте клетки в течение 5 мин при 200 × г при комнатной температуре.
4. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте эти элементы в 1 мл PBS перед добавлением предварительно охлажденного 75% раствора этанола.
5. Смесь выдерживают не менее 4 ч или в течение ночи при температуре −20 °C.
6. Промойте клетки 2 раза ледяным PBS и 180 μл ЭДТА (0,1 мМ, 3,7 мг ЭДТА + 100 мл PBS), 20 μл РНКазы А (10 мг/мл), 35 μл Triton X-100 (2%, 2 мл Triton + 98 мл FBS) и 96,5 μл PBS. Затем добавьте 17,5 мкл раствора PI (1 мг/мл).
7. Выдержать смесь при температуре 4 °C в темноте в течение 10 минут.
8. Промойте клетки в 200 мкл PBS, а затем поместите их в проточный цитометр для оценки распределения клеточного цикла, как описано ранее¹².
9. Работа с проточным цитометром в двойном лазере, трехмерном пространстве, в режиме возбуждения с размером пятна 22 мкм x 66 мкм и размером пятна 13 мкм x 66 мкм. Используйте проточную комнату размером 430 мкм x 180 мкм, спектром 300-1 100 нм, обнаруживаемостью ≤100 MESF и разрешением CV <2%. Затем подвергните клетки воздействию возбуждающего света с длиной волны 488 нм, а также обнаруживите и измерьте сигналы флуоресценции с помощью программного обеспечения прибора для определения распределения клеточного цикла¹³.
10. Определите содержание ДНК, а затем по содержанию ДНК проанализируйте клеточный цикл.

7. Статистический анализ

1. Выполнение статистического анализа.
2. Представьте данные в виде среднего значения ± стандартного отклонения.
3. Используйте t-критерий Стьюдента для сравнения групп со статистической значимостью, установленной как P < 0,05.

Посев клеток глиомы U251
Клетки глиомы U251 имели веретеновидную форму через 24–48 ч после культивирования в DMEM и были адгезированы. Эти клетки были использованы для дальнейшего изучения (рис. 1).

Морфология и количество клеток глиомы
Количество клеток глиомы U251 в группе ГБО в сочетании с группой рентгенографии (2 Гр) было значительно ниже, чем в группе рентгенографии (2 Гр) после 24 ч, 48 ч и 72 ч культивирования клеток (все P < 0,05) (Таблица 1). При культивировании в течение 24 ч необработанные клетки U251 в контрольной группе хорошо росли с длинной веретенообразной морфологией. В рентгеновской группе (2 Гр) плотность клеток U251 снизилась, при этом было видно небольшое количество взвешенных мертвых клеток. В группе ГБО в сочетании с рентгеновскими лучами (2 Гр) плотность клеток снизилась, а взвешенных мертвых клеток стало больше. При культивировании в течение 48 ч плотность клеток непрерывно снижалась в рентгеновской (2 Гр) и ГБО в сочетании с рентгеновской (2 Гр) группами, в то время как в контрольной группе плотность увеличивалась. При культивировании в течение 72 ч плотность клеток еще больше снизилась в группе рентгеновского излучения (2 Гр), особенно в группе ГБО в сочетании с группой рентгеновского излучения (2 Гр) (рис. 2).

Влияние лечения ГБО на радиочувствительность клеток глиомы U251
Доза СФ уменьшалась в зависимости от увеличения дозы облучения (0 Гр, 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр и 8 Гр) в рентгеноструктурных и ГБО в сочетании с рентгенологическими группами. SF был значительно ниже в группе ГБО в сочетании с рентгенологической группой по сравнению с рентгенологической группой для всех протестированных доз облучения (все P < 0,05) (Таблица 2). В совокупности эти результаты показывают, что лечение ГБО увеличивает радиочувствительность клеток глиомы U251.

D₀, Dq, N и_SF2 были обратно связаны с радиочувствительностью и были ниже в группе HBO в сочетании с рентгеновской группой, чем в рентгеновской группе для клеток U251. Эти результаты показывают, что ГБО повышает радиочувствительность клеток глиомы U251 (табл. 3).

Влияние лечения ГБО на радиационно-индуцированное ингибирование пролиферации клеток глиомы U251
С увеличением дозы облучения (0 Гр, 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр и 8 Гр) ингибирование пролиферации клеток постепенно увеличивалось как в рентгеновских группах, так и в группах, получавших ГБО в сочетании с рентгеновским излучением. Скорость пролиферации была значительно ингибирована для ГБО в сочетании с группой рентгеновского излучения по сравнению с группой, получавшей только рентгеновское излучение, при всех испытанных дозах облучения (все P < 0,05). Эти результаты указывают на то, что ГБО усиливает ингибирующее действие рентгеновского излучения на пролиферацию клеток глиомы U251 (Таблица 4).

Влияние ГБО на распределение клеточного цикла глиомы U251 и апоптоз
Процент клеток в G2/M фазе клеточного цикла был достоверно выше в группе ГБО в сочетании с группой рентгенографии (2 Гр) (26,70% ± 2,46%) и группой ГБО (22,36% ± 0,91%) по сравнению с контрольной группой (11,56% ± 2,01%) и рентгенологической (2 Гр) группой (10,35% ± 2,69%) (все группы P < 0,05). Тем не менее, не было существенных различий в процентном соотношении G2/M фазовых клеток между контрольной группой и группой, получавшей только рентген (2 Гр), или между группой ГБО и группой ГБО в сочетании с группой рентгеновского излучения (2 Гр) (все P > 0,05) (Таблица 5, Рисунок 3 и Рисунок 4). Таким образом, HBO, вероятно, арестовал клетки глиомы U251 в фазе G2/M, способствуя синхронизации клеточного цикла глиомы U251.

Количество апоптотических клеток U251 было достоверно выше в группах ГБО и рентгенографии (2 Гр), чем в контрольной группе (все P < 0,05) и в группе HBO в сочетании с рентгенологией (2 Гр) по сравнению с группами HBO, рентгенологической (2 Гр) и контрольной группами (все P < 0,05) (рис. 5 и табл. 5). Из приведенных выше результатов следует, что как ГБО, так и рентгеновские лучи, по-видимому, индуцируют апоптоз клеток U251, но способность ГБО в сочетании с рентгеновскими лучами индуцировать апоптоз клеток U251 была более выраженной.

Рисунок 1: Морфология клеток глиомы U251. (A) клетки U251 (20x); (В) клетки глиомы U251 (100x). Масштабная линейка = 10 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Морфология клеток в различных группах через 24 ч, 48 ч и 72 ч после культивирования клеток. Контрольная группа, 20 раз; ГБО в сочетании с рентгеновским излучением, 20-кратное; Рентген (2 Гр), 20х; Группа HBO, 100x. Сокращения: ГБО = гипербарический кислород. Масштабная линейка = 10 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Распределение клеточного цикла глиомы U251 в каждой группе (n = 3). Сокращение: HBO = гипербарический кислород. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Распределение клеточного цикла глиомы U251 в каждой группе (n = 3). (A) группа HBO; (Б) рентгенологическая (2 Гр) группа; (В) ГБО в сочетании с группой рентгеновского излучения (2 Гр); (D) Контрольная группа. Сокращения: ГБО = гипербарический кислород; PE-A = площадь пика фикоэритрина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Апоптоз клеток глиомы U251 в каждой группе (n = 3). (A) рентгенологическая (2 Гр) группа; (В) Контрольная группа; (В) ГБО в сочетании с группой рентгеновского излучения (2 Гр); (D) Группа ГБО. Сокращения: ГБО = гипербарический кислород; PE-A = площадь фикоэритринового пика; FITC-A = площадь пика изотиоцианата флуоресцеина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Количество клеток U251 для каждой группы. Количество клеток: 1 × 10⁶. P — для ГБО в сочетании с рентгеновскими (2 Гр) и рентгеновскими (2 Гр). Сокращение: HBO = гипербарический кислород.

Таблица 2: Фракция выживаемости клеток U251 для каждой группы. Сокращение: HBO = гипербарический кислород.

Таблица 3: Радиобиологические параметры клеток U251 в рентгеновском и ГБО в сочетании с рентгеновскими группами. n = 3. Сокращения: ГБО = гипербарический кислород; D₀ = средняя смертельная доза; Dq = квазипороговая доза; N = число экстраполяции; SF₂ = доля выживаемости при дозе облучения 2 Гр; SER = коэффициент усиления сенсибилизации; SER (D₀) = D₀ в контрольной группе/D₀ в экспериментальной группе; SER (Dq) = Dq в контрольной группе/Dq в экспериментальной группе.

Таблица 4: Ингибирование пролиферации клеток глиомы U251 в каждой группе. n = 5. Сокращение: HBO = гипербарический кислород.

Таблица 5: Распределение клеточного цикла и апоптоз клеток U251 в каждой группе. n = 3, %. Сокращения: ГБО = гипербарический кислород. * указывает на P < 0,05 по сравнению с контрольной группой. # указывает на P < 0,05 по сравнению с рентгенологической группой. & указывает на P < 0,05 по сравнению с ГБО в сочетании с рентгеновским излучением.

Клеточная линия глиомы U251 является одной из самых классических клеточных линий глиомы человека и широко используется в качестве модели глиомы во многих исследованиях.

Влияние ГБО на пролиферацию клеток глиомы U251
ГБО обычно относится к вдыханию чистого кислорода (100% концентрация кислорода) в герметичной камере с давлением, в 1,5-3 раза превышающим обычное атмосферное давление, что может увеличить содержание кислорода в микрососудистой плазме¹⁴. Сообщается, что у пациентов с глиомой сочетание лучевой терапии или химиотерапии с ГБО повышает клиническую эффективность этих методов лечения. У детей или молодых людей с новообразованиями центральной нервной системы ГБО в сочетании с лучевой терапией может улучшить клинические симптомы и результаты визуализации опухоли. Несмотря на то, что применение ГБО безопасно⁶, ведутся значительные споры о влиянии только ГБО на рост злокачественной глиомы. Ding et ^al.7 показали, что ГБО ингибирует апоптоз и увеличивает плотность микрососудов в опухолевых тканях, способствуя экспрессии фактора роста эндотелия сосудов и индуцируемого гипоксией фактора-1а, предполагая, что чистый ГБО не будет полезен для лечения глиомы. Сообщалось, что ГБО способствует росту клеток глиомы в модели глиомы на крысах⁸ и способствует ангиогенезу опухоли путем индуцирования окислительного стресса в физиологических условиях⁹. Кратковременное воздействие ГБО способствует пролиферации опухолевых клеток, в то время как длительное воздействие подавляет пролиферацию опухолевых клеток¹⁰. ГБО ингибирует апоптоз и снижает плотность микрососудов опухоли при подкожно трансплантированных глиомах; Тем не менее, эти эффекты не наблюдаются при внутричерепной трансплантированной глиоме^15,16. Данное исследование показало, что ингибирование скорости пролиферации клеток было достоверно выше для ГБО в сочетании с рентгенологической группой, чем для рентгенологической группы при каждой дозе (все P < 0,05), а также для группы HBO по сравнению с контрольной группой (P < 0,05). Этот результат позволяет предположить, что ГБО может усиливать ингибирующее действие рентгеновских лучей на пролиферацию клеток глиомы U251 и что сам по себе ГБО не способствует пролиферации этих клеток глиомы. Влияние ГБО на рост опухоли может быть связано с различными факторами, такими как локализация опухоли и статус дифференцировки, а также давление ГБО и продолжительность ГБО. В этом исследовании ГБО в дозе 0,2 МПа (2,0 АТА) использовали в течение 90 минут, а лечение ГБО повторяли три раза. Взаимосвязь продолжительности, частоты и давления HBO с пролиферацией клеток глиомы U251 потребует дальнейшего изучения. Эти результаты показали, что с увеличением дозы облучения (0 Гр, 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр и 8 Гр) ингибирование пролиферации клеток постепенно увеличивалось в рентгеновских группах и ГБО в сочетании с рентгеновскими группами, и скорость пролиферации была значительно ниже для ГБО в сочетании с рентгеновской группой, чем для рентгеновской группы для каждой дозы облучения. Этот результат демонстрирует, что ГБО может усиливать ингибирующее действие рентгеновских лучей на пролиферацию клеток глиомы U251.

Лучевая терапия может производить активные формы кислорода (АФК), которые вызывают повреждение ДНК в опухолевых клетках. Однако гипоксия в опухолевых тканях напрямую снижает выработку АФК, что может снизить терапевтический эффект лучевой терапии на опухолевые клетки. В бескислородном микроокружении опухолевые клетки, вероятно, связываются с атомами водорода из сульфгидрильных соединений, и это связывание нейтрализует свободные радикалы, генерируемые ионизирующим излучением, и уменьшает повреждение ДНК опухолевых клеток. Однако в среде, обогащенной кислородом, свободные радикалы, образующиеся под действием ионизирующего излучения, быстро окисляются и способны повреждать ДНК опухолевых клеток. Это может быть потенциальным механизмом, с помощью которого ГБО может усиливать ингибирующее действие рентгеновских лучей на пролиферацию клеток глиомы U251.

Влияние ГБО на радиочувствительность клеток глиомы U251
Анализ образования клонов прост и подходит для адгезивных клеток. Для этого анализа важны приготовление клеточных суспензий и плотность посева. Клетки должны быть хорошо диспергированы без клеточных кластеров, а плотность инокуляции не должна быть слишком высокой. Ограничением этого анализа клонообразования является то, что только адгезивные клетки могут быть исследованы на предмет влияния HBO на пролиферацию.

В этом исследовании SF был значительно ниже в группе HBO (0,750 ± 0,023), чем в контрольной группе (1,000 ± 0,000) (P = 0,019), что свидетельствует о том, что HBO не способствует росту клеток глиомы U251. Этот результат согласуется с результатами анализа подсчета клеток. С увеличением дозы облучения (0 Гр, 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр и 8 Гр) СФ постепенно снижалась и была достоверно ниже для ГБО в сочетании с рентгенологической группой, чем для рентгеновской группы при каждой дозе облучения (все P < 0,05), что свидетельствует о повышении радиочувствительности клеток глиомы U251 после лечения ГБО. Кроме того, кривые выживаемости клеток глиомы U251, а также все радиобиологические параметры показали, что SF₂,_D0 и Dq были значительно ниже для HBO в сочетании с рентгеновской группой, чем для рентгеновской группы, что позволяет предположить, что HBO может улучшать радиочувствительность клеток глиомы. Сообщается, что SF₂ тесно связан с 2-летней выживаемостью опухоли после лучевой терапии, частотой местного контроля и частотой рецидивов 17,18,19.

Влияние ГБО на клеточный цикл глиомы U251 и апоптоз
Характеристики ДНК варьируются в зависимости от фазы клеточного цикла. Например, клеточная ДНК состоит из 2N в фазе G0/G1 и 4N в фазе G2/M. Йодид пропидия (PI) может связываться с ДНК, а интенсивность флуоресценции комплекса напрямую отражает состояние внутриклеточной ДНК. Таким образом, для определения клеточного цикла можно использовать проточную цитометрию и PI-окрашивание. Ключом к этой экспериментальной технологии является увеличение проницаемости клеточных мембран, что снижает адгезию клеток. В клетках, обработанных этанолом, Triton X-100 и ЭДТА, конечная концентрация PI должна достигать 50 мкг/мл, чтобы обеспечить точное определение распределения клеточного цикла.

Клеточный цикл состоит из фаз G0/G1, S и G2/M, которые играют важную роль в регуляции роста опухолевых клеток. Фаза G0/G1 является подготовительной стадией синтеза ДНК или начальной стадией пролиферации клеток, тогда как S-фаза является активной стадией пролиферации клеток, в которой репликация ДНК завершается. Фаза G2/M — это стадия, на которой распределяется генетический материал и формируются новые дочерние клетки. Любой фактор, блокирующий ту или иную фазу клеточного цикла, может индуцировать клеточную синхронизацию и, в свою очередь, относительное увеличение доли клеток в определенной фазе²⁰. Клетки в разных фазах клеточного цикла имеют разную радиочувствительность. Например, клетки в ранней фазе G1 проявляют радиоантагонизм, в то время как клетки в фазе G1/S имеют несколько повышенную радиочувствительность. Клетки в S-фазе имеют умеренное повышение радиочувствительности, а клетки G2/M-фазы имеют самую высокую радиочувствительность. Это исследование показало, что процент G2/M фазовых клеток был значительно выше в группе HBO в сочетании с рентгенологией, чем в рентгенологической и контрольной группах. Тем не менее, не было существенной разницы в процентном соотношении клеток фазы G2/M между HBO и HBO в сочетании с рентгеновскими группами, что позволяет предположить, что HBO может вызывать остановку клеток глиомы U251 в фазе G2/M. Этот вывод согласуется с выводами, опубликованными Kalns and Piepmeier²¹. Таким образом, синхронизация клеточного цикла в фазе G2/M не только подавляет пролиферацию опухолевых клеток, но и повышает чувствительность опухолевых клеток к лучевой терапии.

Апоптоз играет важную роль в развитии эмбриона человека, восстановлении тканей и стабилизации внутренней среды. Это исследование показало, что апоптоз клеток U251 был значительно выше в группах HBO и рентгеновских лучей, чем в контрольной группе, а также в группе HBO в сочетании с рентгенологической группой по сравнению с группами HBO, рентгена и контрольной группой, что позволяет предположить, что HBO и рентгеновские лучи вместе могут индуцировать апоптоз клеток U251 и что HBO может усиливать апоптоз, индуцированный рентгеновскими лучами. Апоптоз тесно связан с ростом и развитием опухоли. Сообщается, что рентген и ГБО индуцируют апоптоз опухолевых клеток 10,15,16, что согласуется с результатами данного исследования. ГБО может способствовать апоптозу, регулируя экспрессию генов, связанных с апоптозом, таких как аспартатпротеингидролаза (каспазы), В-клеточная лимфома-2 (Bcl-2) и В-лимфома (Bax)²². Белки семейства генов Bcl-2 играют важную роль в регуляции радиочувствительности опухолей. Например, повышенная экспрессия гена Bcl-2 может противодействовать радиационно-индуцированному апоптозу, в то время как гиперэкспрессия гена Bax может усиливать радиочувствительность опухоли^23,24. ГБО может улучшить радиочувствительность опухоли за счет подавления экспрессии Bcl-2 и Bcl-xl при одновременном повышении экспрессии Bax^25,26.

Таким образом, ГБО может быть использован для лечения глиомы, поскольку он может усиливать апоптоз, ингибирование пролиферации и радиочувствительность клеток глиомы U251 путем блокирования клеток в фазе G2/M. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, чтобы подробно охарактеризовать молекулярные механизмы, участвующие в способности HBO повышать радиочувствительность клеток глиомы и индуцировать апоптоз.

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Никакой.