Стереотаксическая внутричерепная доставка химических веществ, белков или вирусных векторов для изучения болезни Паркинсона

Мы описываем, как успешно вводить растворы в определенные области мозга грызунов с помощью стереотаксической рамки. Эта операция по выживанию является хорошо зарекомендовавшим себя методом, используемым для имитации различных аспектов болезни Паркинсона.

Болезнь Паркинсона (БП) — это прогрессирующее заболевание, традиционно характеризующееся тремором покоя и акинезией, в первую очередь из-за потери дофаминергических нейронов в черной субстанции. Пораженные участки мозга демонстрируют внутринейрональные фибриллярные включения, состоящие в основном из белков альфа-синуклеина (асин). Ни одна животная модель до сих пор не повторила все характеристики этого заболевания. В этой статье мы описываем использование стереотаксической инъекции для доставки химических веществ, белков или вирусных векторов внутричерепно, чтобы имитировать различные аспекты БП. Эти методы хорошо зарекомендовали себя и широко используются в области ПД. Стереотаксические инъекции невероятно гибкие; Они могут быть отрегулированы по концентрации, возрасту животного, используемого для инъекции, целевой области мозга и виду используемых животных. Комбинации веществ позволяют быстро варьировать методы лечения или изменять тяжесть патологии или поведенческие нарушения. Вводя токсины в мозг, мы можем имитировать воспаление и/или серьезную потерю дофаминергических нейронов, что приводит к значительным моторным фенотипам. Вирусные векторы могут быть использованы для трансдукции клеток с целью имитации генетических или механистических аспектов. Предварительно сформированные фибриллярные инъекции азина лучше всего повторяют прогрессирующий фенотип в течение длительного периода времени. Как только эти методы будут разработаны, создание новой модели может быть экономически выгодным по сравнению с созданием новой трансгенной линии. Тем не менее, этот метод является трудоемким, так как требует от 30 минут до четырех часов на животное в зависимости от используемой модели. Каждое животное будет иметь немного разное нацеливание и, следовательно, создаст разнообразную когорту, результаты которой, с одной стороны, может быть сложно интерпретировать; С другой стороны, они помогают имитировать более реалистичное разнообразие, обнаруженное у пациентов. Неправильно нацеленные животные могут быть идентифицированы с помощью поведенческих или визуализирующих показаний или только после того, как они были принесены в жертву, что приводит к уменьшению размера когорты после того, как исследование уже было завершено. В целом, этот метод является рудиментарным, но эффективным способом оценки разнообразного набора аспектов БП.

Болезнь Паркинсона (БП) является относительно распространенным прогрессирующим нейродегенеративным заболеванием, поражающим до 1 % людей в возрасте старше 60^лет. БП является гетерогенным, но клинически характеризуется в основном двигательными симптомами, включая тремор в покое, брадикинезию, акинезию, ригидность, нарушение походки и постуральную нестабильность. Большинство моторных симптомов обычно появляются, когда 60-70% дофамина полосатого тела (DA) теряется в результате прогрессирующей и отчетливой нейродегенерации в черной субстанции (SN) pars compacta ^2,3. Выжившие дофаминергические нейроны содержат внутриклеточные включения, известные как тельца Леви⁴. Эти агрегаты в основном состоят из альфа-синуклеина (асина), небольшого, но высоко экспрессирующегося белка в нейронах мозга⁵.

Основной механизм нейродегенерации при БП до сих пор неизвестен. Старение по-прежнему является самым большим фактором риска развития этого расстройства⁶. Кроме того, люди являются единственным видом, у которого болезнь Паркинсона развивается естественным образом. Таким образом, для исследования патологии болезни Паркинсона и тестирования новых лекарств для предотвращения прогрессирования заболевания^{был разработан широкий} спектр животных моделей. В идеале животные модели БП должны демонстрировать возрастную прогрессирующую потерю нейронов DA в SN, сопровождающуюся внутриклеточными включениями с последующей двигательной дисфункцией, и быть чувствительными к заместительной терапии DA. Ни одна из имеющихся в настоящее время животных моделей не воспроизводит полностью все клинические симптомы и патологию БП. Поскольку каждая модель представляет различные аспекты заболевания, важно тщательно обдумать подходящую модель для использования в эксперименте на основе заданных вопросов.

Исторически сложилось так, что животные модели основывались на токсикантах, включая 6-гидроксидофамин (6-OHDA) и 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP), а также пестицидах, таких как ротенон и паракват⁸. Каждый токсикант имеет свой механизм действия и варьируется от специфических для нейронов DA до в целом вредных для клеток мозга. Токсины могут вводиться перорально, внутрибрюшинно или непосредственно в мозг с помощью стереотаксических инъекций в зависимости от проницаемости гематоэнцефалического барьера. В отличие от других моделей, токсинные модели гарантируют высокую степень нигростриарной потери дофаминергических клеток и поведенческие фенотипы. У некоторых моделей может даже проявляться малозаметная патология. Эти особенности делают модели токсинов PD отличным инструментом для изучения заместительной терапии и влияния токсинов окружающей среды на возникновение PD ^9,10.

Кроме того, были созданы многочисленные трансгенные модели мышей с использованием различных промоторов и генов, связанных с болезнью Паркинсона¹¹. У большинства мышей наблюдается нигростриарная патология, но нет явных признаков нейродегенерации. Преимущество трансгенных моделей заключается в том, что они согласованы между животными и когортами, а после создания их легко поддерживать и распространять. Несмотря на то, что они не приводят к нейродегенерации, они, тем не менее, являются полезными моделями для исследования клеточных изменений, вызванных генетическими вариантами и возможными кандидатами в лекарства в комплексной системе in vivo¹².

В отличие от трансгенных моделей, опосредованная вирусным вектором экспрессия генов, связанных с болезнью Паркинсона, предлагает более^{гибкий подход.} Стереотаксические инъекции позволяют выбирать различные области мозга, типы клеток и уровни экспрессии для широкого спектра видов животных, таких как мыши, крысы, свиньи и приматы. Первоначально для трансдукции нейронов, расположенных в SN крысы, использовались рекомбинантные вирусные векторы, кодирующие asyn. Накопление белка и клеточная дисфункция предшествуют прогрессирующей дофаминергической потере клеток, что приводит к поведенческому дефициту. Различия в нацеливании могут привести к большой вариабельности потери клеток у разных животных (30-80%), что ответственно за вариабельный поведенческий дефицит, наблюдаемый только у примерно 25% инъекционных крыс¹⁴.

Недавно созданной моделью является внутричерепное введение предварительно сформированных азиновых фибрилл (PFF) или агрегатных экстрактов из тканей мозга мыши или пациента^15,16. Многочисленные исследования показывают, что инъекции PFF или экстрактов приводят к широко распространенной asyn-патологии в мозге животных, а также к потере дофаминергических нейронов в SN. Накопление азина появляется в нейронах, иннервирующих область введения. В отличие от моделей, основанных на вирусных векторах, модель PFF развивается медленно в течение нескольких месяцев с последующим моторным дефицитом через 6 месяцев. Данная модель имеет большой потенциал для изучения механизма или профилактики asyn-патологии^17,18.

Все упомянутые выше модели хорошо зарекомендовали себя и многократно использовались для изучения различных аспектов человеческого расстройства. Стереотаксические инъекции веществ непосредственно в мозг сыграли большую роль в развитии этих животных моделей не только в области БП, но и других неврологических расстройств. Несмотря на трудоемкость, стереотаксическая хирургия имеет преимущества в том, что она очень гибкая в зависимости от возраста используемых животных, целевой области мозга и вводимого вещества, а также может быть скорректирована в зависимости от заданного исследовательского вопроса. Например, вещества могут вводиться по отдельности или в комбинации (вектор + фибриллы или токсикант + вектор) для повторения большего количества аспектов заболевания или оценки методов лечения^19,20. Кроме того, вещества могут вводиться в одностороннем порядке, оставляя неинъекционную сторону в качестве внутреннего контроля для оценки поведения, а также нейродегенерации. Поэтому в данной рукописи будут подробно описаны шаги по созданию моделей ПД с использованием стереотаксических инжекций.

Все эксперименты в этом исследовании проводились в строгом соответствии с рекомендациями в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения и одобрены комитетами по уходу за животными и их использованию Национального института старения США.

Прежде чем начать, убедитесь, что вы прошли соответствующее обучение и получили этическое одобрение от вашего института, необходимое для выполнения этой процедуры. Кроме того, используемые анестетики (например, кетамин и бупренорфин или фентанил и медетомидин) должны быть приобретены и обработаны в соответствии с соответствующими правилами вашего учреждения.

1. Подготовка (продолжительность 1 час)

1. Приведите животных в операционную и дайте им акклиматизироваться, пока они обустраивают операционную зону. Наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это может зависеть от местных правил безопасности и введенного вещества. Вирусные векторы в основном нуждаются в СИЗ уровня биобезопасности 2. Как правило, как минимум надевайте маску, перчатки и одноразовый лабораторный халат. В определенных обстоятельствах следует использовать дополнительные перчатки и защитные очки.
2. Простерилизуйте хирургические инструменты с помощью автоклава или стерилизатора со стеклянными шариками. Для грызунов понадобится рукоятка скальпеля, кровоостанавливающие щипцы, пинцет Дюмона, изогнутые щипцы, набор для закрытия раны (клипсы) или ножницы и щипцы (для швов) и дрель-головка.
3. Продезинфицируйте операционную область и стереотаксический инструмент 70% этанолом и накройте область рядом со стереотаксическим инструментом либо чистыми бумажными полотенцами, либо стерильной абсорбирующей простыней.
4. Положите на полотенца: глазные капли (например, Liquigel), триммер для волос, ватные палочки, разведенный йодиксанол, одноразовое хирургическое лезвие, хирургическую дрель с продезинфицированным сверлом, маркер или машинку для стрижки ушей, стерильную H₂O в пробирке объемом 1,5 мл, пробирку объемом 1,5 мл с 3 % H₂O₂ в стерильной H₂O (1,35 мл H₂O + 0,15 мл 30 % H₂O_2, свежеприготовленный), шприц объемом 1 мл с иглой 33G и стерильным PBS или физиологическим раствором, шприц с анальгетиком и антидотом, если используется инъекционная анестезия (например, атипамезол + бупренорфин/кетопрофен; свежеприготовленный и одобренный в этическом разрешении) и автоклавные хирургические инструменты.
5. Залейте изофлуран и проверьте давление O₂ и N₂ , если используете газовую анестезию. Добавьте бумажное полотенце на дно ингаляционной камеры, чтобы она оставалась сухой и чистой.
   Смешайте и приготовьте анестетик (например, фентанил + медетомидин (для крыс) или раствор кетамин + ксилазин (для мышей)) при использовании инъекционной анестезии и если это одобрено в этическом разрешении.
6. Соберите стеклянный шприц Hamilton и стеклянный капилляр (Рисунок 1A 1.).
   1. Положите вытянутый стеклянный капилляр на стол. Поместите указательный палец там, где капилляр истончается, с окончанием ногтя там, где должен быть разрезан капилляр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от глубины инъекции от 0,5 до 2 см.
   2. Используйте край керамической плитки, чтобы несколько раз осторожно поцарапать игольчатую часть. Возьмите стеклянный капилляр в одну руку и большим и указательным пальцами возьмитесь за тонкую часть иглы. Тяните от середины до конца, пока игла не обломится тупо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если это не работает или игла отламывается с краями, повторите несколько раз. Если она все еще не отламывается, повторите процарапывание плитки. Следите за тем, чтобы игольная часть не была слишком тонкой (>50 мкм в диаметре) и не поддавалась легкому сгибанию.
7. Запечатайте стеклянный капилляр на шприце Гамильтона.
   1. Прикрепите термоусадочную трубку диаметром 1 см к тупой металлической игле, прикрепленной к стеклянному шприцу Hamilton. Затем наденьте толстый конец стеклянного капилляра на металлическую иглу Гамильтона.
   2. Поместите термоусадочную трубку на половину стеклянного капилляра, обеспечив расстояние не менее 1 см между концом металлической иглы Гамильтона и коническим переходом капилляра. Это будет пространство, в котором позже будет содержаться желаемый раствор для инъекций.
   3. Используйте зажигалку или спичку, чтобы нагреть термоусадочную трубку и запечатать иглу для инъекций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько различных вариантов держателей, которые позволяют закрепить шприц Hamilton на стереотаксическом кронштейне слева. Убедитесь, что вы все еще можете прочитать цифры на шприце Hamilton. Если вы используете насос для введения раствора, прикрепите насос к стереотаксическому кронштейну и закрепите шприц Гамильтона на насосе.
8. Снимите металлический поршень. Вставьте иглу 27G, прикрепленную к шприцу объемом 1 мл, наполненному физиологическим раствором или PBS, в верхнюю часть шприца Hamilton. Промойте шприц Hamilton с помощью PBS, чтобы проверить, запечатан ли он, и удалить все пузырьки воздуха.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки воздуха будут препятствовать всасыванию и впрыску раствора, поскольку воздух сжимает больше, чем жидкость.
9. Когда все будет проверено и готово, откройте маленький винтик на рычаге оси Z (Рисунок 1A 2.) стереотаксического инструмента и поверните рычаг с шагом 90° по часовой стрелке, чтобы отодвинуть стеклянный шприц/капилляр в сторону (чтобы избежать разрыва капилляра при фиксации животного к стереотаксическому инструменту).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все углы и настройки стереотаксиса установлены на желаемые параметры (обычно 0°), зубная дуга и ушные вкладыши установлены на нужные координаты, а шприц/капилляр Hamilton находятся в правильном положении.
10. Включите грелку на платформе стереотакс, используя сверху дополнительную набивку, если она слишком теплая. Поставьте пустую чистую клетку с дополнительной грелкой рядом с областью операции.

2. Хирургическое вмешательство (продолжительность в среднем 1 час на животное)

1. Для газовой анестезии
   1. Включите изофлуран до 5% с потоком воздуха N₂ + O₂ (около 1 л/мин) и откройте клапан в камеру ингаляции. Поместите животное в камеру и убедитесь, что она хорошо закрыта. Наблюдайте за дыханием до тех пор, пока оно значительно не замедлится (глубокое дыхание).
   2. Как только животное потеряет сознание, откройте клапан стереотаксического инструмента и закройте клапан камеры. Установите изофлуран на 2%.
   3. Откройте камеру и выньте животное, держа его за шею, откройте его рот с помощью щипцов и положите животное на зубной брусок (Рисунок 1А 6.) так, чтобы передние верхние зубы вошли в отверстие.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг чувствителен ко времени, так как животное может проснуться, не вдыхая изофлуран.
   4. Поместите носовой конус на морду и наблюдайте за дыханием, чтобы обеспечить устойчивый ритм без форсированного дыхания. Убедитесь, что животное глубоко обезболито, проверив отсутствие рефлексов отвода педалей задних конечностей перед тем, как приступить к работе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте проверять на протяжении всей процедуры, чтобы животное не перестало дышать и не проснулось. При необходимости корректируйте % изофлурана с небольшим приращением. Чтобы проверить рефлекс отвода педали задних конечностей, используйте пинцет и ущипните заднюю лапу. Если животное втягивает конечность (рефлекс для снятия болевых раздражителей) анестезия оказывается слишком низкой.
   5. Зафиксируйте голову животного на месте с помощью двух ушных вкладышей (Рисунок 1А 7.). При правильном подходе уши должны быть направлены в сторону над ушными планками. Если голова все еще движется, отрегулируйте ушные планки или носовой конус, чтобы закрепить голову на месте покрепче.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не сломать барабанные перепонки животных, вставив их слишком глубоко. Крысы, как правило, моргают, когда наушники вставлены правильно.
2. Для инъекционной анестезии:
   1. Введите животному подходящую/рекомендуемую дозу анестезии в/(300 мкг/кг фентанила и 300 мкг/кг медетомидина для крыс; 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина для мышей) и поместите его обратно в домашнюю клетку.
   2. Проверьте рефлексы отвода педалей у животных через 5 минут после инъекции. Если отсутствует, зафиксируйте голову животного на месте с помощью двух амбушюр (рис. 1А, 7). При правильном подходе уши должны быть направлены в сторону над ушными планками. После этого поместите животное на зубной стержень (Рисунок 1А 6.) и закрутите рычаг. Если голова все еще движется, отрегулируйте ушные вкладыши или конус рычага, чтобы крепче зафиксировать голову на месте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно сломать барабанную перепонку животного, если ушные вкладыши вставлены слишком глубоко. Не закручивайте рычаг слишком сильно. Это может сломать животному нос.
   3. Если наблюдаются рефлексы отвода педали, подождите еще 5-10 минут. Если вы все еще наблюдаете, введите еще 10% от предыдущего анестетика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличивайте дозу анестетика медленно с периодом ожидания между ними, чтобы избежать смерти животного от удушья.
   4. Убедитесь, что череп плоский, отрегулировав высоту зубного бруса и/или ушного планки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при регулировке стержней, так как угол наклона головы изменится, а носовой конус/рычаг может сломать нос животного.
3. Нанесите глазные капли на каждый глаз (например, Liquigel), чтобы избежать их высыхания во время операции. Побрейте голову животного от глаз до ушей.
4. Продезинфицируйте операционную область с помощью 10% йодоповидона. Кроме того, введите местный анестетик (например, 0,5% лидокаин) внутрикожно в место разреза. Рекомендуется подождать 2-3 минуты, прежде чем продолжить.
5. С помощью скальпеля сделайте один непрерывный разрез от межглазных промежутков до межушных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны и не режьте слишком далеко назад, так как порез мышц шеи усложнит восстановление.
6. Ватными наконечниками вскройте рану и очистите область от крови. Для крыс используйте гемостатические щипцы, чтобы держать рану открытой, зажимая их в подкожной клетчатке и позволяя им свисать с каждой стороны. Для мышей, при необходимости, используйте микроклипсы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это самая болезненная часть процедуры. Пережатие подкожной клетчатки вместо кожи ускорит заживление.
7. Переместите шприц/капилляр (Рисунок 1А 1) на 180° против часовой стрелки по оси Z (Рисунок 1А 2) и поднесите его над головой животного. Обязательно полностью закройте ручку, чтобы рычаг оси Z не колебался во время операции.
8. С помощью микроскопа и ручек на каждой стереотаксической руке (рис. 1А 3.-5.) переместите тупой конец стеклянного капилляра (прикрепленного к стеклянному шприцу Гамильтона; Рисунок 1А 1.) прямо поверх брегмы (касаясь, но не надавливая на кость). Установите все значения на цифровом дисплее в ноль (Рисунок 1А 8.).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Брегма (рис. 1B) – это точка, где встречаются сагиттальный и корональный швы теменной и лобной костей. Это и будет точкой отсчета.
9. Глядя в микроскоп, переместите тупой конец капилляра прямо поверх лямбды. Если значение оси z (дорсальная/вентральная = DV) находится в пределах +/-0,1 мм, голова животного выравнивается. Если он выше или ниже, используйте зубчатый стержень, чтобы отрегулировать головку соответствующим образом с точностью до +/-0,1 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лямбда (рис. 1B) определяется как точка, где встречаются сагиттальный и корональный швы теменной и затылочной костей. Этот метод также может быть использован для выравнивания левой и правой стороны черепа, если ушные планки можно регулировать индивидуально. Будьте осторожны при регулировке рулей, так как угол наклона головы изменится, а носовой обтекатель / рычаг может сломать нос животного.
10. Используйте атлас мозга Аллена (рис. 1C, D) для определения координат желаемой целевой области. Используйте оси y (передний/задний = AP) и оси x (медиальный/латеральный = ML) рычаги, чтобы переместить шприц/капилляр в правильное положение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекции красителя (Рисунок 2A-E) должны быть выполнены перед хирургическими процедурами на отдельных животных, чтобы убедиться, что координаты правильны для штамма/возраста используемых животных.
11. Посмотрите в микроскоп и приготовьтесь тщательно просверлить отверстие там, где тупой конец капилляра встречается с костью. Прежде чем начать, переместите капилляр вверх по оси Y, чтобы он не был поврежден во время сверления. Начинайте бурение по большему кругу и становитесь меньше по мере углубления. Во время сверления положите руку на ушную планку, чтобы она оставалась устойчивой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не сверлите полностью до тканей мозга. Оставьте тонкий слой кости, чтобы избежать повреждения твердой мозговой оболочки. Вместо этого с помощью пинцета осторожно удалите оставшийся тонкий слой кости.
12. С помощью микроскопа убедитесь, что тупой конец иглы может касаться твердой мозговой оболочки / мозговой ткани, не отвлекаясь на кусочки кости.
13. Очистите шприц/капилляр во избежание загрязнения раствора для инъекций.
    1. Переместите шприц/капилляр до упора вверх и опустите его в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 3% H₂O₂. Обязательно удалите весь мусор и кровь со стекла. Затем опустите капилляр в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую H₂O, чтобы смыть H₂O₂.
    2. Извлеките металлический поршень из шприца Гамильтона и поместите марлю под шприц/капилляр на макушку головы животного. Используйте шприц объемом 1 мл, наполненный PBS, чтобы промыть шприц Hamilton, вставив иглу в верхнюю часть и выдавив PBS. После этого вставьте металлический поршень в шприц Гамильтона.
14. Наберите 1 мкл воздуха. Это предотвратит смешивание PBS в шприце Hamilton и раствора для инъекций в капилляре. Затем наберите нужное количество раствора для инъекций. Для мышей и крыс рекомендуется не более 1 мкл и 2 мкл на один слой соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В общей сложности не следует превышать 3 мкл / 6 мкл на полушарие, так как давление в мозге будет слишком сильно повышаться. С помощью ручки можно очень аккуратно сделать небольшую отметку, где находится мениск раствора. Эта метка затем может быть использована в качестве точки отсчета для оценки того, попадает ли раствор в мозг.
15. Для крыс используйте иглу 25G для прокола твердой мозговой оболочки. Вставьте капилляр в мозг в нужную координату DV. Переместите шприц/капилляр на 0,1 мм глубже, чем предполагалось, и втяните его обратно, чтобы освободить место для раствора.
16. Вводите раствор вручную (0,1 мкл в 10-15 сек) или с помощью насоса (0,4-0,6 мкл/мин). Проверьте мениск, чтобы убедиться, что раствор полностью введен внутрь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если раствор не проникает в мозг, переместите шприц/капилляр вверх и вниз на 0,2 мм. Если он все еще не внедряется, повторите шаги 2.13-2.14. Скорее всего игла забита остатками мозговой ткани.
17. Удерживайте шприц/капилляр на месте еще 5 минут, чтобы введенный раствор распределился и давление снизилось. В течение этого периода ожидания введите обезболивающее средство и при необходимости пометьте животное.
18. Переместите шприц/капилляр вверх на 0,2 мм и удерживайте на месте еще 2 минуты. Вытаскивайте шприц/иглу очень медленно, чтобы избежать вытягивания введенного раствора из-за отрицательного давления.
19. После того, как шприц/капилляр будет выведен из головного мозга, очистите его, как описано в шаге 2.13 , чтобы предотвратить высыхание ткани и закупорку капилляра.
20. Продолжайте вводить дополнительные участки мозга или завершите операцию.
21. Отодвиньте иглу шприца в сторону, повернув ее на 180° по оси z, чтобы избежать поломки при закрытии раны. Затем закройте рану либо зажимами, тканевым клеем, либо швами. Если применялась инъекционная анестезия, введите животному антидот.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, которых не содержат поодиночке, как правило, чистят головы друг друга и, возможно, удаляют зажимы, клей или швы.
22. Извлеките животное из стереотаксической рамки и поместите его в чистую клетку поверх грелки. Следите за тем, чтобы животное проснулось без осложнений. Обеспечьте легкий доступ к еде и воде в течение первых 24 часов.

3. Послеоперационный уход (продолжительность 3-7 дней)

1. Проверьте вес (допустима потеря 10% веса), шерсть, фекалии и потребление пищи/воды животным в течение следующих 2-3 дней (до 10 дней для введения токсиканта), чтобы обеспечить надлежащее восстановление. При необходимости изолируйте животное и дайте ему влажный корм, физраствор и грелку, что необходимо для некоторых инъекций токсикантов, поскольку у животных могут быть дополнительные системные проблемы.
2. Вводите животным анальгетик в течение еще 1-2 дней после операции, чтобы обеспечить облегчение боли в соответствии с местными правилами. Если швы, клипсы или клей не сходят сами по себе, используйте изофлуран для обезболивания животного и удалите швы, клипсы или клей через 1 неделю после операции.

Чтобы избежать неправильного нацеливания, перед каждым экспериментом проверяйте координаты с помощью инъекций красителя. Животным вводили 0,2-0,5 мкл триптофана синего по тому же протоколу, капилляры быстро удалялись после инъекции, а мозг быстро замораживался, чтобы избежать диффузии. После разреза на микротоме место инъекции можно увидеть синим цветом (рис. 2 C,E). Чтобы обеспечить эффективное нацеливание, инъекции красителя должны быть успешно проведены на 2-3 животных до начала эксперимента.

Стереотаксические инъекции могут быть использованы для создания трех основных моделей болезни Паркинсона с разной степенью патологии и нейродегенерации. Как правило, в области БП нейродегенерацию оценивают путем количественного определения тирозингидроксилазы (ТГ), маркера дофаминергических нейронов, а также общего маркера нейронов (например, нейрональных ядер [NeuN] или HuC), поскольку подавление ТГ из-за токсичной окружающей среды может создать иллюзию гибели нигральных клеток.

При введении токсикантов, таких как 6-ОХДА, цель состоит в том, чтобы уничтожить как можно больше нигральных дофаминергических клеток. 6-OHDA поглощается транспортерами моноаминов и блокирует митохондриальное дыхание²¹. Дезипрамин вводят перед каждой операцией, чтобы убедиться, что токсикант поглощается только дофаминовыми нейронами, а не норадренергическими или серотонинергическими клетками. Чтобы оценить успешность каждой инъекции, фиксированные участки среднего мозга должны быть иммуномаркированы на TH и NeuN. Поскольку токсины действуют быстро, для полного развития этой модели требуется всего 2-3 недели после инъекции. Если инъекции 6-OHDA в медиальный пучок переднего мозга (MFB) были успешными, потеря дофаминергических клеток должна составлять 80% и больше по сравнению с контрольной группой, введенной PBS (рис. 2 F-G). MFB — это область, в которой нигростриарные проекции объединяются и, следовательно, позволяют нацеливаться на многие дофаминергические нейроны с помощью одной инъекции. Токсиканты также могут быть введены непосредственно в черную или стриатумную ленту для менее тяжелой гибели клеток.

Модели, основанные на вирусных векторах, в значительной степени зависят от (серо-)типа используемого вектора. AAV2 был наиболее часто вводимым, так как он был прост в производстве и имел высокое сродство к дофаминергическим нейронам. Инженерия промоторов экспрессии, вирусных капсидов и оболочечных белков открыла двери для более специфического нацеливания на области мозга и клеточные популяции. Большинство вирусных векторов в моделях БП вводятся непосредственно в SN для трансдукции дофаминергических нейронов в pars compacta. Экспрессия большинства векторов стабилизируется через 3 недели после инъекции и может быть визуализирована с помощью иммуномечения для экзогенного белка. Обычно GFP экспрессируется в виде контроля в титрах, не вызывающих нейродегенерацию (Рисунок 2H). Гены, связанные с болезнью Паркинсона, используются для имитации генетического аспекта заболевания, например, дупликации или трипликации асина. Сверхэкспрессия азина в нейронах нигральных клеток вызывает гибель дофаминергических клеток (рис. 2I).

Модель PFF является новейшим дополнением к набору инструментов PD. Агрегированный азин может быть получен либо in vitro путем недельного встряхивания рекомбинантного белка азина для получения PFF, либо путем выделения агрегатов из животных моделей или мозга пациентов. Введенные PFF или экстракты мозга затем вызывают накопление в нейронах, проецируемых к месту инъекции. Эта модель уникальна тем, что она основана на стимулировании нормального эндогенного азина к фосфорилированию и накоплению, а не на стимулировании агрегации за счет повышения эндогенного асина. Asyn PFF обычно вводят в стриатум. Через несколько недель после инъекций азинпатия может быть визуализирована в префронтальной коре, стриатуме, коре и SN путем иммуномаркирования фосфорилированного азина (рис. 2K). Контрольные инъекции PBS или сывороточного альбумина не приводят к типичному внутринейрональному накоплению БП (рис. 2J).

Метод стереотаксической инъекции может быть сложным и дорогостоящим, а распространенные ошибки обычно могут быть обнаружены только после того, как животные были принесены в жертву. Толщина капилляра тупого конца может варьироваться от 10 до 100 мкм в зависимости от способа вытягивания. Если капилляр слишком тонкий, он может закупориться при поступлении в мозг и привести к сбою в инъекции (рисунок 2L). В этом конкретном случае игольчатый тракт может быть идентифицирован по рубцовой ткани и неочищенным клеткам крови, при этом эффект от инъекции не виден. Еще одна распространенная ошибка — неправильное нацеливание (рис. 2M). С возрастом брегму может быть трудно определить, неправильные координаты или ошибки чтения могут привести к неправильно размещенным инъекциям. В то время как нацеливание менее сложно у крупных животных (например, крыс) и больших областей мозга (например, стриатума), оно становится все более сложным, например, у мышей с инъекциями SN. Еще одна распространенная ошибка – дозировка. Контрольные вещества сами по себе не должны вызывать более 10-15% гибели клеток. Если экспрессия GFP (рис. 2N) или инъекция PBS токсична, необходимо изменить параметры, чтобы гарантировать, что патология и гибель клеток специфичны для введенного вещества.

Рисунок 1. Установка для стереотаксической хирургии. (A) Схема стереотаксической установки во время операции по выживанию, включая цифровой считыватель и стеклянный шприц, которая более подробно описана справа. (Б) Анатомия черепа грызуна, показывающая костные пластины (лобные, теменные и затылочные кости) с соответствующими швами, приводящими к брегме и лямбде. (К,Г) Адаптированные изображения с веб-страницы атласа мозга Аллена, показывающие корональные срезы стриатума мыши (C) и среднего мозга (D) с соответствующей координатной сеткой в мм. Изображения адаптированы из биорендера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2. Гистологические примеры животных моделей болезни Паркинсона. (А) Схема ориентации мозга мыши. Синяя линия указывает на расположение коронального полосатого отдела мозга в B и C. Зеленая линия указывает на расположение коронального отдела среднего мозга в D и E. (B,D) Иллюстрации коронального участка мозга мыши, показывающие полосатую область в B и область среднего мозга в D. Черная рамка представляет увеличенную вентральную область среднего мозга (substantia nigra) в F-N. (С,Е) Точность координат была проверена до начала эксперимента путем введения 0,2 мкл триптофанового синего. Мозг был немедленно извлечен после операции, заморожен и разрезан на микротоме для анализа целеуказания. Примеры правильного нацеливания на стриатум и черную субстанцию показаны в C и E соответственно. (Ф,Г) Репрезентативные изображения модели 6-гидроксидофамина (6-OHDA) представлены с помощью иммуномаркировки дофаминергического маркера тирозингидроксилазы (ТГ) на срезах ниграла. 6-OHDA (4 мкл 3 мкг/мкл; G) или PBS в качестве контрольной группы (F) вводили в медиальный пучок переднего мозга (MFB), а крыс умерщвляли через 6 недель после операции. За полчаса до инъекции 25 мг/кг дезипрамина вводили внутримышечно для предотвращения гибели норадренергических клеток. (Х,И) Пример животной модели на основе вирусного вектора показывает трансдуцированные клетки зеленым цветом (Immunolabeled against GFP transgene [control vector], H) или красным (Immunolabeled for asyn, I), а нейроны DA — белым. AAV с серотипом 6 (1 мкл 7 x^{10, 13} вирусных геномов/мл каждый) вводили непосредственно в субстанцию черной массы pars compacta (SN), а мышей умерщвляли через 4 недели после операции. (Дж,К) Репрезентативные изображения крыс, которым вводили 8 мкг мышиного асина PFF (K) или с PBS в качестве контроля (J), были иммуномечены фосфорилированным асином (коричневый) и ядрами клеток с крезилфиолетовым (фиолетовым). Крысам вводили в стриатум (2 x 2 мкл отложений) и умерщвляли через 8 недель после инъекции. Изображения адаптированы из Duffy et ^al.21. (Л,М,Н) Распространенными ошибками стереотаксических экспериментов являются отсутствие введенного вирусного раствора (L, игольчатый тракт обозначен стрелками), неправильное нацеливание (M, в данном случае слишком латерально) и контрольная инъекция вызывает гибель клеток (N, отсутствующие клетки обозначены красным кружком). Трансдуцированные нейроны маркируются зеленым цветом для GFP и белым для TH. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Стереотаксическая инъекция, как и любая хирургическая процедура, имеет основную сложность – гарантировать благополучие и выживание животного. Поэтому очень важно внимательно следить за животным на протяжении всей процедуры. Основное внимание должно уделяться нерегулярному дыханию, потере дыхания или повторению рефлексов и движений, особенно для неопытных хирургов. Кроме того, применение анальгетиков имеет решающее значение для помощи в процессе восстановления. После операций с использованием токсикантов может быть особенно трудно восстановиться, поэтому необходимо давать дополнительный влажный корм.

Помимо благополучия животных, основным техническим сложностью стереотаксических инъекций является неправильное нацеливание. Таким образом, перед началом каждого эксперимента пилотные животные должны быть использованы для проверки координат, даже если они были верны в предыдущих экспериментах. Размножение, диета и возраст могут влиять на форму и размер головы и мозга и могут привести к грубому завышению/недооценке координат. Поскольку нацеливание на мелких животных является более сложной задачей, крайне важно правильно выровнять головку, чтобы гарантировать воспроизводимые результаты инъекции. Новая технология, при которой стереотаксический инструмент подключен к компьютерной программе, может помочь скорректировать координаты для каждого животного путем измерения определенных точек на верхней части черепа и уменьшить погрешность. Ошибки при чтении координат, особенно после долгих часов операции, также могут быть уменьшены с помощью цифровых инструментов и стоят финансовых вложений. У более крупных животных, таких как свиньи и приматы, МРТ или КТ используются для вычисления более точных координат и снижения вероятности неправильного нацеливания.

Еще одним сложным препятствием может стать закупорка капилляров во время инъекций. Форма, размер и толщина каждого капилляра могут варьироваться, особенно при ручном вытягивании. Если стекло слишком тонкое, капилляр может сломаться или согнуться во время операции, или закупориться, захватывая ткань на пути инъекции. Если капилляр слишком толстый, он может нарушить и разрушить многие структуры, попадая в мозг, и оставить рубцовую ткань. Поэтому компания Sutter Inc. предоставляет поваренную книгу (https://www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf) для изготовления капилляров различной формы и размера, хотя в основном она оптимизирована для электрофизиологии. Новые тяговые аппараты должны управляться вручную для увеличения длины капилляров, как это делается в хирургических операциях. Еще одна отличная альтернатива — заказать предварительно оттянутые капилляры с точными характеристиками, необходимыми для ваших инъекций. В идеале диаметр капилляра из тупого стекла может достигать 80-100 мкм, но не должен быть меньше 20 мкм, а длина зависит от глубины инъекции (координаты DV). Важно использовать стекло в качестве материала для инъекционных капилляров. Стекло можно использовать с более тонким калибром, чем металлические иглы, а инъекционные вещества менее склонны взаимодействовать со стеклом или связываться с ним.

Поскольку каждое животное немного отличается друг от друга, таргетирование также будет варьироваться от животного к животному, создавая разнообразную когорту с диапазоном клеточной гибели и патологии. Такая разнообразная когорта может затруднить интерпретацию результатов или достижение хорошего числа N. Следовательно, каждое исследование должно быть соответствующим образом обеспечено для того, чтобы быть успешным. Более последовательные стратегии разработки моделей in vivo включают генетические модификации для создания трансгенных животных. Этот метод является более дорогим и сложным на начальных стадиях, даже с технологией CRISPR, но может окупиться позже, поскольку эти модели имеют очень мало внутриживотных вариаций и требуют минимальной дополнительной работы. Кроме того, перенос трансгенных животных из лаборатории в лабораторию довольно прост, что делает его инструментом, который может быть легко доступен многим ученым. Слабыми сторонами трансгенного подхода, по крайней мере, в области болезни Паркинсона, являются отсутствие дофаминергической^{гибели клеток}, соответствующие контрольные линии в целом и гибкость для изменения и корректировки модели на основе вашей гипотезы или новых данных. Кроме того, скрещивание позволит получить гораздо больше животных, чем необходимо для заданного эксперимента. После настройки стереотаксические животные модели могут быть более экономичными и гибкими, поскольку токсиканты, вирусные векторы и фибрилловые штаммы могут быть изменены более легко. Оба метода занимают достойное место в области нейродегенерации и должны быть выбраны по их пригодности для решения поставленного научного вопроса.

Использование токсикантов на животных моделях БП может привести к последовательной, тяжелой и воспроизводимой дофаминергической дегенерации. Ошибки при использовании токсикантов возникают в основном при работе с этими веществами. Большинство токсикантов, таких как 6-OHDA, чувствительны к свету и температуре и склонны к окислению. Это сделает вещество неэффективным еще до инъекции и может привести к низкой токсичности или ее отсутствию. Поэтому растворы должны быть свежеприготовлены с добавлением аскорбиновой кислоты для предотвращения окисления и должны быть защищены от воздействия света до и во время инъекции^. МФТП можно назначать системно животным, вызывающим значительную потерю клеток DA в СН, при введении в острых дозах в течение нескольких дней²³. Эта модель также приводит к поведенческим дефицитам, но в основном не имеет патологических аспектов. Недостатком использования МФТП является его недостаточная токсичность для крыс и некоторых линий мышей, а также риск нейротоксической токсичности среди исследователей и лиц, ухаживающих за животными. Из-за этого риска абсолютно необходимо установить надлежащую рабочую процедуру перед использованием MPTP в лабораториях. В то время как токсиканты являются более простым инструментом, вирусные векторы должны быть клонированы и произведены правильно, чтобы функционировать эффективно. Клонирование может быть затруднено, поскольку плазмиды содержат две повторяющиеся последовательности, необходимые для упаковки вируса, которые могут быть потеряны рекомбинантно во время репликации. Кроме того, ограничения по упаковке допускают только 4,5 или 11 кбит/с кассеты для AAV или Lentivirus соответственно. Иногда это ограничение можно обойти, используя несколько векторов или творческое редактирование. Будущая векторная инженерия, несомненно, будет сосредоточена на увеличении размеров векторных геномов. Производство вирусных частиц может быть затруднено, так как конечный продукт должен быть чистым, но при этом иметь высокий титр²⁴. Перед использованием каждой партии вирусного вектора необходим контроль качества, чтобы избежать усиления воспаления или низкой экспрессии. Кроме того, должна быть построена кривая «доза-ответ», поскольку векторы, экспрессирующие GFP, также могут приводить к нарушениям функции клеток и их гибели²⁵. Как и в случае с векторными моделями, контроль качества PFF имеет первостепенное значение. Производство преформированных фибрилл уже давно является предметом больших споров, поскольку различные протоколы приводят к различным штаммам фибриллярных агрегатов и могут вызывать различные патологические паттерны^26,27. Инъекции плохо собранных фибрилл не приведут к желаемому патологическому фенотипу. Стоит также упомянуть, что большинство лабораторий используют PBS в качестве контроля, поскольку инъекция мономерного азина также может вызывать несколько внутриклеточных агрегатов в более длительные моменты времени²⁸. Чтобы предотвратить первоначальные подводные камни при использовании этих инструментов, вирусные векторы или PFF следует приобретать у опытных исследователей или компаний. Это может значительно снизить первоначальную частоту отказов и дать время для приобретения опыта использования стереотаксических инъекций.

Поскольку стереотаксические инъекции являются таким универсальным методом, постоянно разрабатываются новые технологии, чтобы сделать эту технику более простой и упорядоченной; от моторизованных роботизированных инъекционных рук до автоматизированного сверления и 3D-реконструкции головы животного. Это позволит в будущем проводить более быстрые и точные инъекции. Кроме того, постоянно разрабатываются новые вирусные векторы, которые улучшают распространение и специфичность при одновременном увеличении емкости их генома. Кроме того, новое понимание БП, а также нейродегенерации в целом поможет нам усовершенствовать наши инъекционные инструменты для создания этих моделей. Недавние научные открытия позволили нам разработать модель БПФ, а будущие открытия, генетические или механистические, помогут нам усовершенствовать модели БП и направят нас в поисках лекарства.

Авторам нечего раскрывать.

Это исследование было частично поддержано Программой внутренних исследований Национального института здравоохранения, Национальным институтом по проблемам старения. CES поддерживается компанией NS099416. Авторы выражают признательность за поддержку со стороны NIMH IRP Rodent Behavioral Core (ZIC MH002952 и MH002952 Yogita Chudasama) и NICHD IRP Microscopy and Imaging Core.