אספקה תוך גולגולתית סטריאוטקסית של כימיקלים, חלבונים או וקטורים נגיפיים לחקר מחלת פרקינסון

אנו מתארים כיצד להזריק בהצלחה פתרונות לאזורים ספציפיים במוח של מכרסמים באמצעות מסגרת סטריאוטקסית. ניתוח הישרדות זה הוא שיטה מבוססת המשמשת לחיקוי היבטים שונים של מחלת פרקינסון.

מחלת פרקינסון (PD) היא הפרעה מתקדמת המוגדרת באופן מסורתי על ידי רעד במנוחה ואקינזיה, בעיקר עקב אובדן נוירונים דופמינרגיים בחומר השחור. אזורי המוח המושפעים מציגים תכלילים פיברילריים תוך-עצביים המורכבים בעיקר מחלבוני אלפא-סינוקלאין (אסין). אף מודל של בעלי חיים עד כה לא סיכם את כל המאפיינים של מחלה זו. כאן, אנו מתארים את השימוש בהזרקה סטריאוטקסית להעברת כימיקלים, חלבונים או וקטורים נגיפיים תוך גולגולתיים על מנת לחקות היבטים שונים של מחלת פרקינסון. שיטות אלו מבוססות היטב ונמצאות בשימוש נרחב בכל תחום PD. זריקות סטריאוטקסיות גמישות להפליא; ניתן להתאים אותם בריכוז, גיל החיה המשמשת להזרקה, אזור המוח הממוקד ובמיני בעלי חיים בשימוש. שילובים של חומרים מאפשרים וריאציות מהירות כדי להעריך טיפולים או לשנות את חומרת הפתולוגיה או הליקויים ההתנהגותיים. על ידי הזרקת רעלים למוח, אנו יכולים לחקות דלקת ו/או אובדן חמור של נוירונים דופמינרגיים וכתוצאה מכך פנוטיפים מוטוריים משמעותיים. ניתן להשתמש בווקטורים ויראליים כדי להמיר תאים כדי לחקות היבטים גנטיים או מכניסטיים. זריקות אסין פיברילריות מוכנות מראש מסכמות בצורה הטובה ביותר את הפנוטיפ המתקדם לאורך תקופה ממושכת. לאחר הקמת שיטות אלה, זה יכול להיות חסכוני ליצור מודל חדש בהשוואה ליצירת קו טרנסגני חדש. עם זאת, שיטה זו דורשת עבודה עתירת עבודה מכיוון שהיא דורשת 30 דקות עד ארבע שעות לכל בעל חיים בהתאם לדגם בו נעשה שימוש. לכל בעל חיים יהיה מיקוד מעט שונה ולכן תיצור קבוצה מגוונת שמצד אחד יכולה להיות מאתגרת לפרש את התוצאות; מצד שני, עזרו לחקות מגוון מציאותי יותר שנמצא בחולים. ניתן לזהות בעלי חיים שגויים באמצעות קריאות התנהגותיות או הדמיה, או רק לאחר הקרבה המובילה לגודל קטן יותר לאחר שהמחקר כבר הסתיים. בסך הכל, שיטה זו היא דרך בסיסית אך יעילה להעריך מערך מגוון של היבטים של מחלת פרקינסון.

מחלת פרקינסון (PD) היא מחלה ניוונית מתקדמת שכיחה יחסית המשפיעה על עד 1% מהאנשים מעל גיל 60^. מחלת פרקינסון היא הטרוגנית, אך מאופיין קלינית בעיקר בתסמינים מוטוריים הכוללים רעד במנוחה, ברדיקינזיה, אקינזיה, נוקשות, הפרעה בהליכה וחוסר יציבות יציבה. רוב התסמינים המוטוריים מופיעים בדרך כלל כאשר 60-70% מהדופמין הסטריאטלי (DA) אובד כתוצאה מניוון עצבי מתקדם ומובהק בחומר השחור (SN) pars compacta ^2,3. נוירונים דופמינרגיים ששרדו מכילים תכלילים תוך-תאיים הידועים כגופי לוי⁴. אגרגטים אלה מורכבים בעיקר מאלפא-סינוקלאין (asyn), חלבון קטן אך מתבטא מאוד בתאי עצב במוח⁵.

המנגנון הבסיסי של ניוון עצבי במחלת פרקינסון עדיין אינו ידוע. הזדקנות היא עדיין גורם הסיכון הגדול ביותר להפרעה זו⁶. יתר על כן, בני אדם הם המין היחיד שמפתח מחלת פרקינסון באופן טבעי. לכן, על מנת לחקור את הפתולוגיה של מחלת פרקינסון ולבדוק תרופות חדשות למניעת התקדמות המחלה, פותחו מגוון רחב של מודלים של בעלי חיים⁷. באופן אידיאלי, מודלים של בעלי חיים של מחלת פרקינסון צריכים להציג אובדן מתקדם תלוי גיל של נוירוני DA ב-SN, מלווה בתכלילים תוך-תאיים ואחריהם תפקוד מוטורי לקוי ולהיות מגיבים לטיפולים תחליפיים של DA. אף אחד מהמודלים הקיימים כיום בבעלי חיים אינו מסכם באופן מלא את כל התסמינים הקליניים והפתולוגיה של מחלת פרקינסון. מכיוון שכל מודל מציג היבטים שונים של המחלה, חשוב לשקול היטב את המודל המתאים לשימוש בניסוי על סמך השאלות שנשאלו.

מבחינה היסטורית, מודלים של בעלי חיים התבססו על חומרים רעילים, כולל 6-הידרוקסידופמין (6-OHDA) ו-1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-טטרה-הידרופירידין (MPTP), וחומרי הדברה, כגון רוטנון ופרקווט⁸. לכל חומר רעיל יש מנגנון פעולה שונה והוא נע בין נוירון DA ספציפי למזיק בדרך כלל לתאי המוח. ניתן לתת רעלים דרך הפה, להזריק תוך צפקית או ישירות למוח באמצעות זריקות סטריאוטקסיות בהתאם לחדירות מחסום הדם-מוח. בניגוד למודלים אחרים, מודלים של רעלנים מבטיחים רמה גבוהה של אובדן תאים דופמינרגיים ניגרוסטריאטליים ופנוטיפים התנהגותיים. דגמים מסוימים עשויים אפילו להציג פתולוגיה עדינה. המאפיינים הללו הופכים את המודלים של פרקינסון לרעלן לכלי נהדר לחקר טיפולים חלופיים וההשפעות של רעלנים סביבתיים על הופעת מחלת פרקינסון ^9,10.

בנוסף, מודלים רבים של עכברים טרנסגניים נוצרו באמצעות מגוון מקדמים וגנים הקשורים למחלת פרקינסון¹¹. רוב העכברים מציגים פתולוגיה ניגרוסטריאטלית אך ללא עדות ברורה לניוון עצבי. למודלים טרנסגניים יש יתרון בכך שהם עקביים בין בעלי חיים וקבוצות וברגע שהם נוצרים הם קלים לתחזוקה ולהפצה. למרות שהם אינם גורמים לניוון עצבי, הם בכל זאת מודלים שימושיים לחקירת שינויים תאיים הנגרמים על ידי וריאנטים גנטיים ומועמדים אפשריים לתרופות במערכת קומפלקס in vivo¹².

בניגוד למודלים טרנסגניים, ביטוי בתיווך וקטור ויראלי של גנים הקשורים למחלת פרקינסון מציע גישה גמישה יותר¹³. הזרקות סטריאוטקסיות מאפשרות לבחור אזורי מוח, סוגי תאים ורמות ביטוי שונות עבור מגוון רחב של מיני בעלי חיים כגון עכברים, חולדות, חזירים ופרימטים שאינם אנושיים. בתחילה, וקטורים נגיפיים רקומביננטיים המקודדים לאסין שימשו להתמרת נוירונים הממוקמים ב-SN של החולדה. הצטברות חלבון ותפקוד לקוי של התאים קודמים לאובדן תאים דופמינרגי מתקדם וכתוצאה מכך ליקוי התנהגותי. הבדלים במיקוד יכולים להוביל לשונות גדולה של אובדן תאים בין בעלי חיים (30-80%), מה שאחראי לליקויים התנהגותיים משתנים שנצפו רק בכ-25% מהחולדות שהוזרקו^.

מודל שהוקם לאחרונה הוא הזרקה תוך גולגולתית של סיבי אסין מוכנים מראש (PFFs) או תמציות מצטברות מרקמת מוח של עכבר או מטופל^15,16. מחקרים מרובים מצביעים על כך שהזרקת PFFs או תמציות גורמת לפתולוגיה אסינית נרחבת במוח החי כמו גם לאובדן נוירונים דופמינרגיים ב-SN. הצטברות של אסין מופיעה בתוך נוירונים המעצבנים את האזור המוזרק. בניגוד למודלים מבוססי וקטור ויראלי, מודל ה-PFF מתפתח לאט במשך מספר חודשים ואחריו ליקויים מוטוריים לאחר 6 חודשים. למודל זה יש פוטנציאל רב לחקר המנגנון או המניעה של פתולוגיה אסינית^17,18.

כל המודלים שהוזכרו לעיל היו מבוססים היטב ושימשו פעמים רבות לחקר היבטים שונים של ההפרעה האנושית. הזרקות סטריאוטקסיות של חומרים ישירות למוח מילאו תפקיד גדול בפיתוח מודלים של בעלי חיים אלה לא רק בתחום מחלת פרקינסון אלא גם בהפרעות נוירולוגיות אחרות. למרות שהוא עתיר עבודה, לניתוח סטריאוטקסי יש יתרונות בכך שהוא גמיש מאוד בגיל בעלי החיים המשמשים, אזור המוח הממוקד והחומר המוזרק, וניתן להתאים אותו בהתאם לשאלת המחקר שנשאלה. לדוגמה, ניתן להזריק חומרים בנפרד או בשילוב (וקטור + סיבים או רעיל + וקטור) כדי לסכם היבטים נוספים של המחלה או להעריך טיפולים ^19,20. בנוסף, ניתן להזריק חומרים באופן חד צדדי ולהשאיר את הצד הלא מוזרק כבקרה פנימית להערכת התנהגות כמו גם ניוון עצבי. לכן, כתב יד זה יתאר שלבים מפורטים ליצירת מודלים של מחלת פרקינסון באמצעות הזרקות סטריאוטקסיות.

כל הניסויים במחקר זה נערכו בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות ואושרו על ידי ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי להזדקנות בארה"ב.

לפני שמתחילים, אנא ודא שרכשת את ההכשרה המתאימה והאישור האתי מהמכון שלך הדרושים לביצוע הליך זה. בנוסף, יש לרכוש חומרי הרדמה (למשל, קטמין ובופרנורפין, או פנטניל ומדטומידין) המשמשים ולטפל בהם בהתאם לכללים הרלוונטיים של המוסד שלך.

1. הכנה (משך שעה)

1. הביאו בעלי חיים לחדר הניתוח ותנו להם להתאקלם תוך כדי הקמת אזור הניתוח. לבש ציוד מגן אישי מתאים (PPE).
   הערה: זה יכול להיות תלוי בתקנות הבטיחות המקומיות ובחומר המוזרק. וקטורים נגיפיים זקוקים בעיקר ל-PPE ברמת בטיחות ביולוגית 2. באופן כללי, לפחות ללבוש מסכה, כפפות וחלוק מעבדה חד פעמי. בנסיבות ספציפיות יש להשתמש בכפפות ומשקפי מגן נוספים.
2. עקר את כלי הניתוח באמצעות חיטוי או מעקר חרוזי זכוכית. למכרסמים אתה צריך ידית אזמל, מלקחיים המוסטטיים, פינצטה של דומונט, מלקחיים מעוקלים, ערכת סגירת פצעים (קליפסים) או מספריים ומלקחיים (לתפרים) וראש מקדחה.
3. יש לחטא את אזור הניתוח והמכשיר הסטריאוטקסי באתנול 70%, ולכסות את האזור הסמוך למכשיר הסטריאוטקסי במגבות נייר נקיות או בסדין סופג סטרילי.
4. הניחו את הדברים הבאים על מגבות: טיפות עיניים (למשל, Liquigel), גוזם שיער, צמר גפן, יודיקסאנול מדולל, להב כירורגי חד פעמי, מקדחה כירורגית עם מקדח מחוטא, טוש או קוצץ אוזניים, H₂O סטרילי בשפופרת של 1.5 מ"ל, צינור 1.5 מ"ל עם 3% H₂O₂ בסטרילי H₂O (1.35 מ"ל של H₂O + 0.15 מ"ל של 30% H₂O_2, הוכן טרי), מזרק של 1 מ"ל עם מחט 33G ו-PBS סטרילי או מי מלח, מזרק עם משכך כאבים ותרופת נגד אם נעשה שימוש בהרדמה להזרקה (למשל, אטיפמזול + בופרנורפין/קטופרופן; הוכן ואושר טרי בהיתר האתי) וכלי ניתוח חיטוי.
5. מלא איזופלורן ובדוק את הלחצים O₂ ו-N₂ , אם אתה משתמש בהרדמה בגז. הוסף מגבת נייר לתחתית תא השאיפה כדי לשמור עליו יבש ונקי.
   מערבבים ומכינים טרי את חומר ההרדמה (למשל, פנטניל + מדטומידין (לחולדות) או תמיסת קטמין + קסילזין (לעכברים)) אם משתמשים בהרדמה בהזרקה ואם אושר בהיתר האתי.
6. הרכיבו את מזרק הזכוכית של המילטון ונימי הזכוכית (איור 1A 1.).
   1. הניחו את נימי הזכוכית הנמשכים על השולחן. הנח את האצבע המורה במקום שבו הנימים נעשים דקים יותר עם קצה הציפורן במקום שבו יש לחתוך את הנימים.
      הערה: תלוי בעומק ההזרקה שלך בכל מקום בין 0.5 - 2 ס"מ.
   2. השתמש בקצה אריח קרמיקה כדי לגרד בזהירות את חלק המחט כמה פעמים. קח נימי זכוכית ביד אחת והשתמש באגודל ובאצבע המורה כדי לתפוס את חלק המחט הדק. משוך מהאמצע עד הסוף עד שהמחט מתנתקת בצורה בוטה.
      הערה: אם זה לא עובד או שהמחט מתנתקת מהקצה, חזור על הפעולה מספר פעמים. אם הוא עדיין לא מתנתק, חזור על גירוד אריחים. ודא שחלק המחט אינו דק מדי (קוטר >50 מיקרומטר) ואינו מתכופף בקלות.
7. אטום את נימי הזכוכית למזרק המילטון.
   1. חבר צינור כיווץ של 1 ס"מ מעל מחט המתכת הקהה המחוברת למזרק הזכוכית של המילטון. לאחר מכן הניחו את הקצה העבה של נימי הזכוכית מעל מחט המתכת של המילטון.
   2. הנח צינורות כיווץ מעל מחצית נימי הזכוכית, והבטיח מרווח של לפחות 1 ס"מ בין קצה מחט המתכת של המילטון למעבר החרוטי של הנימים. זה יהיה החלל המכיל את תמיסת ההזרקה הרצויה מאוחר יותר.
   3. השתמש במצית או בגפרור כדי לחמם את צינור הכיווץ ולאטום את מחט ההזרקה.
      הערה: ישנן מספר אפשרויות מחזיקים שונות המאפשרות לך לקבע את מזרק המילטון לזרוע הסטריאוטקסית משמאל. ודא שאתה עדיין יכול לקרוא את המספרים על מזרק המילטון. אם אתה משתמש במשאבה כדי להזריק את התמיסה, חבר את המשאבה לזרוע הסטריאוטקסית וקבע את מזרק המילטון על המשאבה.
8. הסר את בוכנת המתכת. הכנס מחט 27G המחוברת למזרק של 1 מ"ל מלא במי מלח או PBS בחלקו העליון של מזרק המילטון. שטפו את מזרק המילטון עם PBS כדי לבדוק אם הוא אטום ולשטוף את כל בועות האוויר.
   הערה: בועות אוויר יפריעו לקליטה והזרקה של התמיסה שלך מכיוון שהאוויר דוחס יותר מנוזל.
9. לאחר שהכל נבדק ומוכן, פתח את הבורג הקטן בזרוע ציר ה-z (איור 1A 2.) של המכשיר הסטריאוטקסי וסובב את הזרוע במרווחים של 90 מעלות בכיוון השעון כדי להזיז מזרק זכוכית/נימי מהדרך (כדי למנוע מהנימים להישבר בזמן קיבוע החיה למכשיר הסטריאוטקסי).
   הערה: בדוק שכל הזוויות וההגדרות של הסטריאוטקס מוגדרות לפרמטרים הרצויים (בדרך כלל 0°), מוט השיניים והאוזניות מוגדרים לקואורדינטות הרצויות והמזרק/נימי המילטון כולם ישרים.
10. הפעל את כרית החום בפלטפורמת הסטריאוטקס והשתמש בריפוד נוסף למעלה אם הוא חם מדי. הנח כלוב ריק ונקי עם כרית חום נוספת ליד אזור הניתוח.

2. ניתוח (משך הניתוח בממוצע שעה לבעל חיים)

1. להרדמת גז
   1. הפעל איזופלורן ל-5% עם זרימת אוויר N₂ + O₂ (כ-1 ליטר לדקה) ופתח את השסתום לתא השאיפה. הכניסו את החיה לתא וודאו שהיא אטומה היטב. התבוננו בנשימה עד שהיא האטה במידה ניכרת (נשימה עמוקה).
   2. לאחר שהחיה מחוסרת הכרה, פתחו את השסתום למכשיר סטריאוטקסי וסגרו את שסתום החדר. הגדר איזופלורן ל-2%.
   3. פתחו את התא והוציאו את החיה שמחזיקה אותה בצוואר, פתחו את פיה עם המלקחיים והניחו את החיה על מוט השיניים (איור 1A 6.) כשהשיניים העליונות הקדמיות נכנסות לתוך החור.
      הערה: שלב זה רגיש לזמן מכיוון שהחיה יכולה להתעורר שוב על ידי אי נשימה של איזופלורן.
   4. הניחו את חרוט האף על החוטם והתבוננו בנשימה כדי להבטיח קצב קבוע ללא נשימה מאולצת. ודא שהחיה מורדמת עמוק על ידי בדיקת היעדר רפלקסים של נסיגת הדוושה של הגפיים האחוריות לפני שתמשיך.
      הערה: המשיכו לבדוק לאורך כל ההליך כדי שהחיה לא תפסיק לנשום או תתעורר. במידת הצורך, התאם את % האיזופלורן במרווחים קטנים. כדי לבדוק את רפלקס נסיגת הדוושה של הגפיים האחוריות, השתמש בזוג פינצטה וצבט את כף הרגל האחורית. אם החיה מושכת את הגפה (רפלקס להסרת גירויי כאב) ההרדמה נמוכה מדי.
   5. קבע את ראש החיה במקומו באמצעות שני מוטות האוזניים (איור 1A 7.). כאשר עושים זאת כהלכה, האוזניים צריכות להצביע הצידה מעל מוטות האוזניים. אם הראש עדיין זז, כוונן את מוטות האוזניים או חרוט האף כדי לקבע את הראש חזק יותר במקומו.
      הערה: היה עדיןכדי להימנע משבירת עור התוף של בעלי החיים על ידי הכנסת מוטות האוזניים עמוק מדי. חולדות נוטות למצמץ כאשר האוזן מוכנסת כהלכה.
2. להרדמה בהזרקה:
   1. יש להזריק לבעל החיים מינון מתאים/מומלץ של הרדמה (300 מיקרוגרם/ק"ג פנטניל ו-300 מיקרוגרם/ק"ג מדטומידין לחולדות; 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג קסילזין לעכברים) ולהחזיר אותו לכלוב הביתי.
   2. בדוק את רפלקסי נסיגת הדוושה של בעלי חיים 5 דקות לאחר ההזרקה. אם נעדר, קבע את ראש החיה במקומו באמצעות שני מוטות האוזניים (איור 1A 7.). כאשר עושים זאת כהלכה, האוזניים צריכות להצביע הצידה מעל מוטות האוזניים. לאחר מכן, הנח את החיה על מוט השיניים (איור 1A 6.) והברג את הידית. אם הראש עדיין זז, כוונן את מוטות האוזניים או חרוט הידית כדי לקבע את הראש חזק יותר במקומו.
      הערה: אפשר לשבור את עור התוף של בעל חיים כאשר מוטות האוזניים מוכנסים עמוק מדי. אל תבריג את הידית חזק מדי. זה יכול לשבור את האף של החיות.
   3. אם נצפים רפלקסים של נסיגת הדוושה, המתן עוד 5-10 דקות. אם עדיין נצפה, יש להזריק עוד 10% מההרדמה הקודמת.
      הערה: הגדילו את מינון ההרדמה לאט עם תקופת המתנה בין לבין כדי למנוע מוות של בעל החיים עקב חנק.
   4. ודא שהגולגולת שטוחה על ידי התאמת גובה מוט השיניים ו/או מוט האוזניים.
      הערה: היזהר בעת כוונון הסורגים מכיוון שהראש ישנה זווית וחרוט/ידית האף עלולים לשבור את האף של בעלי החיים.
3. יש למרוח טיפות עיניים על כל עין (למשל, Liquigel) כדי למנוע התייבשות במהלך הניתוח. לגלח את ראש החיה מהעיניים לאוזניים.
4. חיטוי אזור הניתוח באמצעות 10% יודופובידון. בנוסף, יש להזריק חומר הרדמה מקומי (למשל, 0.5% לידוקאין) תוך עורית במקום החתך. מומלץ להמתין 2-3 דקות עד שהוא יפעל לפני שממשיכים.
5. בעזרת האזמל יש לבצע חתך רציף אחד מבין העיניים לבין האוזניים.
   הערה: היזהר לא לחתוך יותר מדי לאחור מכיוון שקיצוץ שרירי הצוואר יסבך את ההתאוששות.
6. השתמש בקצות הכותנה כדי לפתוח את הפצע ולנקות את האזור מדם. עבור חולדות, השתמש במלקחיים ההמוסטטיים כדי לשמור על הפצע פתוח, על ידי הצמדתם לרקמה התת עורית ולתת להם לתלות בכל צד. עבור עכברים, במידת הצורך, השתמש במיקרו קליפסים.
   הערה: זהו החלק הכואב ביותר בהליך. הידוק הרקמה התת עורית במקום העור יגביר את הריפוי.
7. הזיזו את המזרק/נימי (איור 1A 1.) 180 מעלות נגד כיוון השעון על ציר ה-z (איור 1A 2.) והביאו אותו מעל ראשו של בעל החיים. הקפד לסגור את הכפתור לחלוטין כדי שזרוע ציר ה-z לא תתנדנד במהלך הניתוח.
8. השתמש במיקרוסקופ ובכפתורים בכל זרוע סטריאוטקסית (איור 1A 3.-5.) כדי להזיז את הקצה הקהה של נימי הזכוכית (המחובר למזרק הזכוכית של המילטון; איור 1א 1.) ממש על גבי ברגמה (נוגע אך לא לוחץ על העצם). הגדר את כל הערכים בתצוגה הדיגיטלית לאפס (איור 1A 8.).
   הערה: ברגמה (איור 1B) היא הנקודה שבה נפגשים התפרים הסגיטאליים והעטרתיים של העצמות הקודקודיות והקדמיות. זו תהיה נקודת המוצא.
9. במבט דרך המיקרוסקופ, הזז את הקצה הקהה של הנימים ימינה על גבי הלמבדה. אם ערך ציר ה-z (גבי/גחון = DV) נמצא בטווח של +/-0.1 מ"מ, ראש החיה מפולס. אם הוא גבוה או נמוך יותר, השתמש במוט השן כדי לכוונן את הראש בהתאם עד לטווח של +/- 0.1 מ"מ.
   הערה: למבדה (איור 1B) מוגדרת כנקודה שבה נפגשים התפרים הסגיטליים והעטרתיים של העצמות הקודקודיות והעורפיות. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי ליישר את הצד השמאלי והימני של הגולגולת אם ניתן לכוונן את מוטות האוזניים בנפרד. היזהר בעת כוונון הסורגים מכיוון שהראש ישנה זווית וחרוט / ידית האף עלולים לשבור את האף של בעלי החיים.
10. השתמשו באטלס המוח של אלן (איור 1C, D) כדי לזהות את הקואורדינטות עבור אזור המטרה הרצוי שלכם. השתמש בזרועות ציר ה-y (קדמי/אחורי = AP) וציר ה-x (מדיאלי/רוחבי = ML) כדי להזיז את המזרק/הנימים למיקום הנכון.
    הערה: יש לבצע הזרקות צבע (איור 2A-E) לפני פרוצדורות כירורגיות בבעלי חיים נפרדים כדי להבטיח שהקואורדינטות נכונות לזן/גיל של בעלי החיים שבהם נעשה שימוש.
11. הסתכל דרך המיקרוסקופ והתכונן לקדוח בזהירות חור שבו הקצה הקהה של הנימים פוגש את העצם. לפני שמתחילים, הזיזו את הנימים מספיק על ציר ה-y כדי שלא ייפגע בזמן הקידוח. התחל לקדוח במעגל גדול יותר וקטן ככל שאתה קודח עמוק יותר. בזמן הקידוח, הנח את היד על מוט אוזניים כדי לשמור על יציבותה.
    הערה: אין לקדוח עד לרקמת המוח. השאירו שכבה דקה של עצם כדי למנוע נזק לדורה. במקום זאת, השתמש בפינצטה כדי להסיר בזהירות את שכבת העצם הדקה שנותרה.
12. בעזרת המיקרוסקופ, בדוק שהקצה הקהה של המחט יכול לגעת ברקמת הדורה / המוח מבלי להיות מוסט על ידי חתיכות עצם.
13. נקה את המזרק / הנימים כדי למנוע זיהום של תמיסת ההזרקה.
    1. הזיזו את המזרק/הנימים עד הסוף, וטבלו אותו בצינור של 1.5 מ"ל המכיל 3% H₂O₂. הקפד להסיר את כל הפסולת והדם מהזכוכית. לאחר מכן, טבלו את הנימים בצינור ה-1.5 מ"ל המכיל H₂O כדי לשטוף את ה-H₂O₂.
    2. הסר את בוכנת המתכת ממזרק המילטון והנח גזה מתחת למזרק/נימי, על גבי ראש החיה. השתמש במזרק 1 מ"ל מלא ב-PBS כדי לשטוף את מזרק המילטון על ידי הכנסת המחט בחלק העליון והתזת PBS החוצה. לאחר מכן, הכנס את בוכנת המתכת למזרק המילטון.
14. שאב 1 מיקרוליטר אוויר. זה ימנע מה-PBS במזרק המילטון ומתמיסת ההזרקה להתערבב בנימי. לאחר מכן ערוך את הכמות הרצויה של תמיסת ההזרקה. מקסימום 1 מיקרוליטר ו-2 מיקרוליטר לכל פיקדון מומלץ לעכברים וחולדות בהתאמה.
    הערה: אין לחרוג מ-3 מיקרוליטר / 6 מיקרוליטר לחצי כדור מכיוון שהלחץ במוח יעלה יותר מדי. בעזרת עט ניתן לסמן מעט בזהירות רבה היכן נמצא המניסקוס של התמיסה. סימן זה יכול לשמש כנקודת ייחוס כדי לאמוד אם התמיסה נכנסת למוח.
15. עבור חולדות, השתמש במחט 25G כדי לנקב את הדורה. הכנס את הנימים למוח לקואורדינטת ה-DV הרצויה. הזיזו את המזרק/הנימים בעומק של 0.1 מ"מ מהמתוכנן ומשכו חזרה למעלה כדי לפנות מקום לתמיסה.
16. הזרקת תמיסה ביד (0.1 מיקרוליטר לכל 10-15 שניות) או עם משאבה (0.4-0.6 מיקרוליטר לדקה). בדוק את המניסקוס כדי לוודא שהתמיסה מוזרקת במלואה.
    הערה: אם התמיסה לא עוברת למוח, הזיזו את המזרק/הנימים למעלה ולמטה 0.2 מ"מ. אם הוא עדיין לא מזריק, חזור על שלבים 2.13-2.14. סביר להניח שהמחט סתומה בפסולת רקמת מוח.
17. החזיקו את המזרק/הנימים במקומם למשך 5 דקות נוספות כדי לאפשר לתמיסה המוזרקת להתפזר והלחץ לרדת. במהלך תקופת המתנה זו, הזריק את משכך הכאבים וסמן את בעל החיים במידת הצורך.
18. הזיזו את המזרק/הנימים כלפי מעלה ב-0.2 מ"מ והחזיקו במקומו למשך 2 דקות נוספות. משוך את המזרק/מחט החוצה לאט מאוד כדי להימנע ממשיכת תמיסה מוזרקת עקב הלחץ השלילי.
19. לאחר שהמזרק/הנימים יוצאים מהמוח, נקו אותו כמתואר בשלב 2.13 כדי למנוע מהרקמה להתייבש ולסתום את הנימים.
20. המשך להזריק אזורים נוספים במוח או סיים את הניתוח.
21. הזז את מחט המזרק הצידה על ידי סיבובה ב-180 מעלות על ציר ה-z כדי למנוע שבירה בזמן סגירת הפצע. לאחר מכן, סגור את הפצע בעזרת קליפסים, דבק רקמות או תפרים. אם נעשה שימוש בהרדמה להזרקה, הזריק לבעל החיים את התרופה.
    הערה: בעלי חיים שאינם שוכנים לבד נוטים לנקות זה את ראשו של זה ואולי להסיר קליפסים, דבק או תפרים.
22. הסר את החיה מהמסגרת הסטריאוטקסית והנח אותה בכלוב הנקי על גבי כרית החום. עקוב אחר החיה כדי לוודא שהיא מתעוררת ללא סיבוכים. ספק גישה נוחה למזון ומים במשך 24 השעות הראשונות.

3. טיפול לאחר OP (משך 3-7 ימים)

1. בדוק את המשקל (ירידה של 10% במשקל מקובלת), פרווה, צואה וצריכת מזון/מים של בעל החיים במהלך 2-3 הימים הבאים (עד 10 ימים להזרקת חומרים רעילים) כדי להבטיח התאוששות תקינה. במידת הצורך, בודדו את בעל החיים וספקו מזון רטוב, זריקות מי מלח וכרית חימום, החיוניים לזריקות רעילות מסוימות מכיוון שלבעלי חיים עלולות להיות בעיות מערכתיות נוספות.
2. יש להזריק לבעלי חיים משכך כאבים למשך 1-2 ימים נוספים לאחר הניתוח כדי להבטיח הקלה בכאב בהתאם לתקנות המקומיות. אם תפרים, קליפסים או דבק אינם יורדים מעצמם, השתמשו באיזופלורן כדי להרדים את החיה ולהסיר תפרים, קליפסים או דבק שבוע לאחר הניתוח.

כדי למנוע מיקוד שגוי, לפני כל ניסוי, ודא את הקואורדינטות באמצעות הזרקות צבע. לבעלי חיים הוזרקו 0.2-0.5 מיקרוליטר טריפטופן כחול באותו פרוטוקול, הנימים הוסרו במהירות לאחר ההזרקה והמוח הוקפא במהירות כדי למנוע דיפוזיה. אחרי החיתוך על המיקרוטום, אפשר לראות את אתר ההזרקה בכחול (איור 2 C,E). כדי להבטיח מיקוד יעיל, הזרקות צבע צריכות להתבצע בהצלחה על 2-3 בעלי חיים לפני הניסוי בפועל.

ניתן להשתמש בזריקות סטריאוטקסיות ליצירת שלושה מודלים עיקריים של מחלת פרקינסון בדרגות שונות של פתולוגיה וניוון עצבי. בדרך כלל, בתחום מחלת פרקינסון, ניוון עצבי מוערך על ידי כימות טירוזין הידרוקסילאז (TH), סמן לנוירונים דופמינרגיים, כמו גם סמן עצבי כללי (למשל, גרעינים עצביים [NeuN] או HuC) שכן ויסות נמוך של TH עקב סביבה רעילה יכול ליצור אשליה של מוות של תאי ניגרל.

כאשר מזריקים חומרים רעילים כמו 6-OHDA המטרה היא למגר כמה שיותר תאים דופמינרגיים ניגרליים. 6-OHDA נקלט על ידי מובילי מונואמין וחוסם את הנשימה המיטוכונדריאלית²¹. דזיפרמין ניתן לפני כל ניתוח כדי להבטיח שהחומר הרעיל ייקלט רק על ידי נוירונים של דופמין ולא על ידי תאים נוראדרנרגיים או סרוטונרגיים. כדי להעריך את ההצלחה של כל זריקה, חלקים קבועים במוח התיכון צריכים להיות בעלי תווית חיסונית עבור TH ו-NeuN. מכיוון שרעלנים פועלים במהירות, למודל זה לוקח רק 2-3 שבועות לאחר ההזרקה להתפתח במלואו. אם הזרקות 6-OHDA לצרור המוח הקדמי המדיאלי (MFB) היו מוצלחות, אובדן תאים דופמינרגיים אמור להיות 80% ויותר בהשוואה לבקרות שהוזרקו PBS (איור 2 F-G). ה-MFB הוא אזור שבו הקרנות ניגרוסטריאטליות מתאגדות יחד ולכן מאפשרות למקד נוירונים דופמינרגיים רבים בזריקה אחת. ניתן גם להזריק חומרים רעילים ישירות לתוך הניגרה או הסטריאטום למוות תאים פחות חמור.

מודלים מבוססי וקטור ויראלי תלויים מאוד בסוג (sero-) של הווקטור בו נעשה שימוש. AAV2 היה המוזרק הנפוץ ביותר מכיוון שהיה קל לייצר אותו ויש לו זיקה גבוהה לתאי עצב דופמינרגיים. הנדסת מקדמי ביטוי, קפסידים נגיפיים וחלבוני מעטפת פתחה דלתות למיקוד ספציפי יותר של אזורי מוח ואוכלוסיות תאים. רוב הווקטורים הוויראליים במודלים של מחלת פרקינסון מוזרקים ישירות לתוך ה-SN כדי להמיר נוירונים דופמינרגיים ב-pars compacta. הביטוי של רוב הווקטורים מתייצב 3 שבועות לאחר ההזרקה וניתן להמחיש אותו על ידי תיוג חיסוני לחלבון האקסוגני. בדרך כלל, GFP מתבטא כבקרה בטיטרים שאינם גורמים לניוון עצבי (איור 2H). גנים הקשורים למחלת פרקינסון משמשים לחיקוי ההיבט הגנטי של המחלה, למשל כפילויות או שילוש של אסין. ביטוי יתר של asyn בתאי עצב ניגרליים גורם למוות של תאים דופמינרגיים (איור 2I).

דגם ה-PFF הוא התוספת החדשה ביותר לערכת הכלים PD. ניתן לרכוש אסין מצטבר במבחנה על ידי ניעור של שבוע של חלבון אסין רקומביננטי ליצירת PFFs או על ידי בידוד אגרגטים ממודלים של בעלי חיים או מוחות חולים. PFFs או תמציות מוח מוזרקות גורמות לאחר מכן להצטברות בתאי עצב המוקרנים לאתר ההזרקה. מודל זה ייחודי בכך שהוא מסתמך על הפעלת אסין אנדוגני רגיל לזרחן ולהצטבר במקום להניע צבירה באמצעות העלאת אסין אנדוגני. PFF Asyn מוזרקים בדרך כלל לסטריאטום. מספר שבועות לאחר הזריקות, ניתן לדמיין פתולוגיה של אסין בקליפת המוח הקדם-מצחית, סטריאטום, קליפת המוח ו-SN על ידי תיוג חיסוני עבור אסין זרחני (איור 2K). זריקות בקרה של PBS או אלבומין בסרום אינן גורמות להצטברות תוך-עצבית אופיינית למחלת פרקינסון (איור 2J).

שיטת ההזרקה הסטריאוטקסית יכולה להיות מאתגרת ויקרה, ובדרך כלל ניתן לזהות טעויות נפוצות רק לאחר הקרבת בעלי החיים. עובי הנימים של הקצה הקהה יכול לנוע בין 10-100 מיקרומטר בהתאם לשיטת המשיכה. אם הנימים דקים מדי, הם יכולים להיסתם בזמן הכניסה למוח ולהוביל לכשל בהזרקה (איור 2L). במקרה הספציפי הזה, ניתן לזהות את דרכי המחט על ידי רקמת צלקת ותאי דם לא מנוקים בעוד שלא נראית השפעה של ההזרקה. שגיאה נפוצה נוספת היא מיקוד שגוי (איור 2M). עם הגיל, ברגמה יכולה להיות קשה לקביעה, קואורדינטות שגויות או שגיאות קריאה עלולות להוביל לזריקות שגויות. בעוד שהמיקוד פחות מסובך בחיות גדולות יותר (למשל, חולדות) ואזורי מוח גדולים יותר (למשל, סטריאטום), הם הופכים מאתגרים יותר ויותר בהזרקות SN של עכברים למשל. טעות נפוצה נוספת היא המינון. חומרי בקרה לא צריכים לגרום ליותר מ-10-15% מוות תאים בעצמם. אם ביטוי של GFP (איור 2N) או הזרקת PBS רעיל, יש לשנות פרמטרים כדי להבטיח שהפתולוגיה ומוות התאים הם ספציפיים לחומר המוזרק.

איור 1. הגדרה לניתוח סטריאוטקסי. (A) סכמטי של מערך סטריאוטקסי במהלך ניתוח הישרדות כולל קורא דיגיטלי ומזרק זכוכית המפורט יותר מימין. (B) אנטומיה של גולגולת של מכרסם שמראה לוחות עצם (עצמות קדמיות, קודקודיות ועורפיות) עם תפרים תואמים וכתוצאה מכך ברגמה ולמבדה. (ג,ד) תמונות מותאמות מדף האינטרנט של אטלס המוח של אלן המציגות מקטעים עטרתיים של סטריאטום עכבר (C) ומוח אמצעי (D) עם רשת קואורדינטות מתאימה במ"מ. התמונות נלקחו מ-biorender. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2. דוגמאות היסטולוגיות למודלים של בעלי חיים של מחלת פרקינסון. (A) סכמטי של הכיוון של מוח עכבר. קו כחול מציין את המיקום של החלק הסטריאטלי העטרתי עבור B ו-C. קו ירוק מציין את המיקום של החלק של המוח התיכון העטרתי ב-D ו-E. (B,D) איורים של קטע מוח עטרה של עכבר שמראה את אזור הסטריאטלי ב-B ואת אזור המוח התיכון ב-D. קופסה שחורה מייצגת את אזור המוח התיכון הגחוני המוגדל (substantia nigra) ב-F-N. (C,E) הקואורדינטות נבדקו לדיוקן לפני הניסוי על ידי הזרקת 0.2 מיקרוליטר טריפטופן כחול. המוח הוצא מיד לאחר הניתוח, הוקפא ונחתך על מיקרוטום כדי לנתח את המטרה. דוגמאות למיקוד נכון של סטריאטום וחומר שחור מוצגות ב-C ו-E, בהתאמה. (ו,ז) תמונות מייצגות של מודל 6-הידרוקסידופמין (6-OHDA) מוצגות על ידי תיוג חיסוני עבור הסמן הדופמינרגי טירוזין הידרוקסילאז (TH) בחתכים ניגרליים. 6-OHDA (4 מיקרוליטר של 3 מיקרוגרם/מיקרוליטר; G) או PBS כביקורת (F) הוזרק לצרור המוח הקדמי המדיאלי (MFB) והחולדות הוקרבו 6 שבועות לאחר הניתוח. חצי שעה לפני ההזרקה ניתן 25 מ"ג/ק"ג דזיפרמין i.p. למניעת מוות של תאים נוראדרנרגיים. (ח,י) דוגמה למודל בעלי חיים מבוסס וקטור ויראלי מראה תאים מותמרים בירוק (תווית חיסונית כנגד טרנסגן GFP [וקטור בקרה], H) או אדום (תווית חיסונית עבור asyn, I), ונוירונים DA בלבן. AAVs עם סרוטיפ 6 (1 מיקרוליטר של 7 x^{10 13} גנומים נגיפיים / מ"ל כל אחד) הוזרקו ישירות לחומר השחור (SN) ועכברים הוקרבו 4 שבועות לאחר הניתוח. (י,ק) תמונות מייצגות של חולדות שהוזרקו עם 8 מיקרוגרם של עכבר asyn PFF (K) או עם PBS כביקורת (J) סומנו עם תווית חיסונית עבור אסין זרחני (חום) וגרעיני תאים עם סגול קרזיל (סגול). חולדות הוזרקו לסטריאטום (משקעים של 2 x 2 מיקרוליטר) והוקרבו 8 שבועות לאחר ההזרקה. התמונות נלקחו מ-Duffy et ^al.21. (ל,מ,נ) טעויות נפוצות בניסויים סטריאוטקסיים הן הזרקת תמיסה ויראלית (L, דרכי מחט מסומנות על ידי חיצים), מיקוד שגוי (M, במקרה זה לרוחב מדי) והזרקת בקרה גורמת למוות תאים (N, תאים חסרים מסומנים בעיגול אדום). נוירונים מותמרים מסומנים בירוק עבור GFP ולבן עבור TH. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

להזרקה סטריאוטקסית, כמו לכל הליך כירורגי, יש את הקושי העיקרי להבטיח את רווחתו והישרדותו של בעל החיים. לכן, חיוני לעקוב מקרוב אחר בעל החיים לאורך כל ההליך. שמירה על אי סדרים בנשימה, אובדן נשימה או הישנות של רפלקסים ותנועות צריכה להיות המוקד העיקרי, במיוחד עבור מנתחים חסרי ניסיון. בנוסף, יישום משככי כאבים הוא חיוני כדי לסייע בתהליך ההחלמה. ניתוחים הכוללים חומרים רעילים יכולים להיות קשים במיוחד להתאוששות ויש לספק מזון רטוב נוסף.

מלבד רווחת בעלי חיים, הסיבוך הטכני העיקרי של הזרקה סטריאוטקסית הוא מיקוד שגוי. לכן, לפני תחילת כל ניסוי, יש להשתמש בחיות פיילוט כדי לאמת את הקואורדינטות, גם אם הן נכונות בניסויים קודמים. רבייה, תזונה וגיל יכולים להשפיע על צורת וגודל הראש והמוח ויכולים להוביל להערכת יתר/הערכת חסר של קואורדינטות. מכיוון שהמיקוד בבעלי חיים קטנים יותר מאתגר יותר, חיוני ליישר את הראש כראוי כדי להבטיח תוצאות הזרקה הניתנות לשחזור. טכנולוגיה חדשה שבה המכשיר הסטריאוטקסי מחובר לתוכנת מחשב יכולה לסייע בהתאמת הקואורדינטות עבור כל בעל חיים על ידי מדידת נקודות ספציפיות על גבי הגולגולת והפחתת שגיאות. טעויות בקריאת קואורדינטות, במיוחד לאחר שעות ארוכות של ניתוח, ניתנות להפחתה גם על ידי כלים דיגיטליים ושוות את ההשקעה הכספית. בבעלי חיים גדולים יותר כמו חזירים ופרימטים, סריקות MRI או CT משמשות לחישוב קואורדינטות מדויקות יותר ולהפחתת הסיכוי למטרה שגויה.

מכשול מאתגר נוסף יכול להיות נימים סתומים במהלך ההזרקה. הצורה, הגודל והעובי של כל נימים יכולים להשתנות, במיוחד אם נמשכים ביד. אם הזכוכית דקה מדי, הנימים עלולים להישבר או להתכופף במהלך הניתוח, או להיסתם על ידי תפיסת רקמה בדרך ההזרקה. אם הנימים עבים מדי, הם יכולים לשבש ולהרוס מבנים רבים תוך כדי כניסה למוח ולהשאיר רקמת צלקת מאחור. לכן Sutter Inc. מספקת ספר בישול (https://www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf) להכנת נימים בצורות וגדלים שונים, אם כי מותאם בעיקר לאלקטרופיזיולוגיה. יש להפעיל מכונות משיכה חדשות יותר באופן ידני עבור נימים ארוכים יותר כפי שמשתמשים בניתוחים. אלטרנטיבה מצוינת נוספת היא להזמין נימים שנשלפו מראש עם המפרט המדויק הדרוש להזרקות שלך. באופן אידיאלי, הקוטר של נימי זכוכית קהה יכול להגיע עד 80-100 מיקרומטר אך לא צריך להיות קטן מ-20 מיקרומטר בעוד שהאורך תלוי בעומק ההזרקה שלך (קואורדינטות DV). חשוב להשתמש בזכוכית כחומר לנימי ההזרקה שלך. ניתן להשתמש בזכוכית עם מד עדין יותר מאשר מחטי מתכת וחומרים הניתנים להזרקה נוטים פחות לקיים אינטראקציה עם זכוכית או להיקשר אליה.

מכיוון שכל בעל חיים שונה במקצת זה מזה, המיקוד ישתנה גם מבעל חיים לחיה ויוצר קבוצה מגוונת עם מגוון של מוות תאים ופתולוגיה. קבוצה מגוונת זו יכולה להקשות על פירוש תוצאות או השגת מספר N טוב. כתוצאה מכך, כל מחקר צריך להיות מופעל כראוי כדי להצליח. אסטרטגיות עקביות יותר לפיתוח מודלים in vivo כוללות שינויים גנטיים ליצירת בעלי חיים טרנסגניים. שיטה זו יקרה וקשה יותר בשלביה הראשונים, אפילו עם טכנולוגיית CRISPR, אך יכולה להשתלם בהמשך מכיוון שלדגמים אלה יש מעט מאוד שונות בתוך בעלי חיים ודורשים עבודה נוספת מינימלית. יתר על כן, זה די לא מסובך להעביר חיות טרנסגניות ממעבדה למעבדה, מה שהופך אותו לכלי שיכול להיות זמין בקלות למדענים רבים. חולשות של הגישה הטרנסגנית, לפחות בתחום מחלת הפרקינסון, הן היעדר מוות תאי דופמינרגי¹¹, קווי בקרה מתאימים באופן כללי וגמישות לשנות ולהתאים את המודל על סמך ההשערה שלך או ראיות חדשות. בנוסף, הכלאה תייצר הרבה יותר בעלי חיים ממה שנדרש לניסוי מוגדר. לאחר ההתקנה, מודלים של בעלי חיים סטריאוטקסיים יכולים להיות חסכוניים וגמישים יותר מכיוון שניתן לשנות בקלות רבה יותר חומרים רעילים, וקטורים נגיפיים וזני סיבים. לשתי השיטות יש מקום תקף בתחום הניוון העצבי ויש לבחור אותן על פי התאמתן לענות על השאלה המדעית שנשאלה.

השימוש בחומרים רעילים במודלים של בעלי חיים עם פרקינסון יכול לגרום לניוון דופמינרגי עקבי, חמור וניתן לשחזור. טעויות בשימוש בחומרים רעילים מתרחשות בעיקר בעת טיפול בחומרים אלה. רוב החומרים הרעילים, כגון 6-OHDA, רגישים לאור ולטמפרטורה ונוטים לחמצון. זה יהפוך את החומר ללא יעיל עוד לפני ההזרקה ויכול לגרום לרעילות נמוכה עד אפסית. לכן, יש להכין תמיסות טריות ולהוסיף חומצה אסקורבית למניעת חמצון ויש להגן עליהן מפני חשיפה לאור לפני ובמהלך ההזרקה²². MPTP יכול להינתן באופן סיסטמי לבעלי חיים הגורם לאובדן משמעותי של תאי DA ב-SN כאשר הוא ניתן במינונים חריפים במשך מספר ימים²³. מודל זה יביא גם לליקויים התנהגותיים אך לרוב חסר היבטים פתולוגיים. החיסרון בשימוש ב-MPTP הוא חוסר הרעילות שלו בחולדות ובכמה קווי עכברים, והסיכון שלו לרעילות עצבית בקרב חוקרים ומטפלים בבעלי חיים. בגלל סיכון זה, הכרחי לחלוטין לקבוע נוהל עבודה תקין לפני השימוש ב-MPTP במעבדות. בעוד שחומרים רעילים הם כלי פשוט יותר, יש לשכפל וקטורים נגיפיים ולייצר אותם בצורה נכונה כדי לתפקד ביעילות. שיבוט יכול להיות מסובך מכיוון שהפלסמידים מכילים שני רצפים חוזרים הנחוצים לאריזת הנגיף שעלולים ללכת לאיבוד באופן רקומביננטי במהלך השכפול. בנוסף, מגבלות האריזה מאפשרות רק לקלטת ביטוי להיות 4.5 או 11 kbp עבור AAV או Lentivirus, בהתאמה. לפעמים ניתן לעקוף מגבלה זו על ידי שימוש בווקטורים מרובים או עריכה יצירתית. הנדסת וקטור עתידית תתמקד ללא ספק בהרחבת גודל הגנום הווקטורי. ייצור חלקיקים נגיפיים יכול להיות קשה מכיוון שהתוצר הסופי צריך להיות טהור אך גם בעל טיטר גבוה²⁴. בקרת איכות נחוצה לפני שניתן להשתמש בכל אצווה של וקטור ויראלי כדי למנוע דלקת מוגברת או ביטוי נמוך. יתר על כן, יש ליצור עקומת מינון-תגובה מכיוון שהווקטורים המבטאים GFP יכולים גם לגרום לחריגות בתפקוד התא ולמוות תאים²⁵. בדומה למודלים הווקטוריים, בקרת איכות של PFF היא בעלת חשיבות עליונה. ייצור סיבים מוכנים מראש נתון זה מכבר לוויכוח רב מכיוון שפרוטוקולים שונים מביאים לזנים שונים של אגרגטים סיביים ועלולים לגרום לדפוסים פתולוגיים מגוונים^26,27. הזרקות של סיבים שהורכבו בצורה גרועה לא יביאו לפנוטיפ הפתולוגי הרצוי. ראוי גם להזכיר שרוב המעבדות משתמשות ב-PBS כבקרה שכן הזרקת אסין מונומרי יכולה גם לגרום למספר אגרגטים תוך-תאיים בנקודות זמן ארוכות יותר²⁸. כדי למנוע מלכודות ראשוניות באמצעות כלים אלה, יש לרכוש וקטורים ויראליים או PFF מחוקרים או חברות מנוסים. זה יכול להפחית באופן דרסטי את שיעור הכישלון הראשוני ולספק זמן לצבור ניסיון בשימוש בהזרקות סטריאוטקסיות.

מכיוון שהזרקות סטריאוטקסיות הן שיטה כה רב-תכליתית, טכנולוגיה חדשה מפותחת כל הזמן כדי להפוך את הטכניקה הזו לקלה ויעילה יותר; מזרועות הזרקה רובוטיות ממונעות, מעל קידוחים אוטומטיים ועד לשחזור תלת מימדי של ראש החיה. זה יאפשר זריקות מהירות ומדויקות יותר בעתיד. יתר על כן, וקטורים נגיפיים חדשים מפותחים כל הזמן כדי לשפר את ההתפשטות והספציפיות תוך הגדלת יכולת הגנום שלהם. נוסף על כך, תובנות חדשות על מחלת פרקינסון, אך גם על ניוון עצבי באופן כללי, יסייעו לנו לשפר את כלי ההזרקה שלנו כדי ליצור את המודלים האלה. ממצאים מדעיים אחרונים אפשרו לנו לפתח את מודל ה-PFF ותגליות עתידיות, גנטיות או מכניסטיות, יעזרו לנו לקדם מודלים של מחלת פרקינסון וידריכו אותנו במסע שלנו למציאת תרופה.

למחברים אין מה לחשוף.

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר התוך-כיתתית של המכון הלאומי לבריאות, המכון הלאומי להזדקנות. CES נתמך על ידי NS099416. המחברים מבקשים להכיר בתמיכה של הליבה ההתנהגותית של מכרסמים של NIMH IRP (ZIC MH002952 ו-MH002952 ל-Yogita Chudasama) ועל ידי ליבת המיקרוסקופיה וההדמיה של NICHD IRP.