Определение профиля транскрипции псориазиформной кожи in vitro с использованием клеток HaCaT, стимулированных комбинацией цитокинов

В данной работе представлен метод создания in vitro псориазийной модели кожного воспаления на уровне транскрипции с использованием комбинации пяти цитокинов (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) на клеточной линии HaCaT.

Псориаз – распространенное хроническое воспалительное заболевание кожи, опосредованное врожденной и адаптивной иммунной системами, характеризующееся аномальной пролиферацией и дифференцировкой эпидермальных кератиноцитов и инфильтрацией воспалительных клеток. Кожно-специфические кератиноциты являются ключевыми участниками врожденного иммунитета, реагируя на иммунные клетки и стимуляцию окружающей среды, тем самым играя важную роль в иммунопатогенезе псориаза. В данной работе мы представляем метод индуцирования воспаления псориазиформных кератиноцитов на уровне транскрипции с помощью клеточной линии HaCaT с использованием комбинации пяти провоспалительных цитокинов (комбинация M5), включая IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α и онкостатин M. Результаты показывают, что индуцированные комбинацией M5 клетки HaCaT показали повышенные уровни антимикробных пептидов (BD2, S100A7, S100A8 и S100A9), хемокинов и цитокинов (CXCL1, CXCL2, CXCL8, CCL20, IL-1β, IL-6 и IL-18). Уровни мРНК маркеров дифференцировки кератиноцитов (Кератин1, Кератин10, Филаггрин и Лорикрин) были снижены, что согласуется с данными транскриптома, полученными из псориазоподобных кератиноцитов. Таким образом, описанный здесь метод устанавливает in vitro псориазиформное воспаление кожи на уровне транскрипции и вносит вклад в исследование молекулярного патогенеза псориаза.

Псориаз является распространенным незаразным хроническим воспалительным заболеванием кожи, вызванным нерегулируемым иммунным ответом, поражающим кератиноциты, которые преимущественно образуют эпидермис¹, характеризующимся аномально быстрым размножением кератиноцитов с гиперкератозом и паракератозом. Псориазом страдает около 3% мировой дикой популяции². Бремя болезней еще больше увеличивается из-за ряда сопутствующих заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания и метаболический синдром, вызванный синдромом³.

Эпидермис состоит из пяти слоев кератиноцитов и претерпевает морфологические изменения в процессе дифференцировки: базальный слой, слой колючий, слой гранулозный, слой люцидума (обнаруженный на ладонях и подошвах) и роговой слой, описанный здесь от внутренней к внешней поверхности⁴. Изменение дифференцировки эпидермиса приводит к нарушению кожного барьера, что важно для патогенеза воспалительных заболеваний кожи 5,6,7,8. Кератиноциты играют жизненно важную роль в поддержании неповрежденного эпидермального барьера для предотвращения потери воды и защиты от триггеров окружающей среды, таких как воздействие UVB, аллергены и патогенные микроорганизмы⁹. У здоровых людей наблюдается баланс между пролиферацией базальных клеток и шелушением рогового слоя, в то время как множественные кожные заболевания, включая псориаз, характеризуются дисбалансом этого^{сложного механизма}.

Помимо формирования барьерной функции, кератиноциты также являются важным компонентом иммунной системы кожи. При иммунопатогенезе псориаза активация кожно-резидентных хелперных Т-клеток 1-го типа (Th1) и хелперных Т-клеток 17-го типа (Th17) приводит к увеличению продукции ИФН-γ и IL-17A соответственно. Эти цитокины индуцируют повышенный синтез хемокинов (CCL20, CXCL1/2/8/9/10/11), антимикробных пептидов (BD2, LL37, S100A7/8/9/12) и других воспалительных факторов (TNF-α, IL-6, IFN-β) в кератиноцитах, что приводит к привлечению большего количества Th1, Th17 и нейтрофилов в кожу, что еще больше усиливает ось IL-17/IL23¹¹. Перекрестные помехи между кератиноцитами и иммунными клетками отвечают за индукцию и поддержание псориаза¹¹.

Сложные цитокиновые сети были описаны при псориазе, ^{и была} подчеркнута центральная роль провоспалительных цитокинов (таких как IL-23, IL-22, IL-17, IL-1α, онкостатин M(OSM) и TNF-α), продуцируемых инфильтрацией иммунных ^{клеток.} Действительно, предыдущие исследования показали, что повышенные уровни IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α и OSM индуцировали профиль псориазиформа на нормальных эпидермальных кератиноцитах человека in vitro¹⁴.

Бессмертные клеточные линии кератиноцитов (HaCaT), которые легче получить и культивировать, чем первичные кератиноциты с лучшей воспроизводимостью, широко используются для изучения псориаза 15,16,17,18,19,20. В отличие от трансформированных клеток HEK001 и KerTr вируса папилломы человека16 E6/E7, клеточная линия HaCaT способна экспрессировать продукты дифференцировки генов, включая кератин1 (KRT1), кератин10 (KRT10), лорикрин и филаггрин 20,21,22, тем самым обеспечивая многообещающий инструмент, аналогичный первичным кератиноцитам, для изучения регуляции кератинизации и провоспалительных процессов.

KRT5/14 является основной парой кератинов I типа II, экспрессируемой в пролиферативных базальных кератиноцитах, в то время как дифференцированные кератиноциты в надбазальных слоях подавляют KRT5/14 и экспрессируют KRT1/10 в качестве основной кератиновой пары²³. При сравнении поражения псориазом со здоровой кожей изменения экспрессии кератина включали снижение KRT1/10^24,25 и увеличение KRT5/14 в псориатическом эпидермисе²⁶, характеризующемся гиперпролиферацией и паракератозом²⁷. Лорикрин является терминально дифференцированным структурным белком, составляющим более 70% ороговевшей оболочки, способствует защитной барьерной функции рогового слоя²⁸, регулируемого в коже пациентов с псориазом²⁹. Филаггрин экспрессируется на заключительных стадиях дифференцировки кератиноцитов и участвует в агрегации скаффолдообразной ороговевшей оболочки³⁰, сниженной экспрессии при псориазном поражении кожи²⁹.

В целом, наша цель состояла в том, чтобы создать модель воспалительных кератиноцитов в клетках HaCaT с использованием комбинации цитокинов, которая сможет синергетически повторять некоторые характеристики поражений кожи при псориазе, включая инициирование иммунного ответа, пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов.

Выполните шаги с 1 по 3 в стерильных условиях. Вся питательная среда содержала 0,1 мг/мл пенициллина и стрептомицина.

1. Подготовка клеток

1. Посадите 1 x 10⁶ клеток HaCaT в 10 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) в 100 мм чашке для клеточной культуры. Инкубировать питательную чашку при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% содержанием_CO2 в течение 2 дней.
2. Когда конфлюенция культуры достигнет примерно 80%, осторожно извлеките среду из чашки для культивирования и промойте клетки 5 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS). Аккуратно покачивайте форму для культуры вручную.
3. Удалите PBS и добавьте в клетки 2 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА. Осторожно встряхните чашку для культивирования, чтобы раствор полностью покрыл монослой клеток.
4. Инкубируйте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% содержанием_CO2 в течение 5 мин до тех пор, пока клетки не станут заметно отделены от поверхности чашки для культивирования с помощью фазово-контрастной микроскопии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Морфология клеток должна казаться круглой. Если клетки плохо отделились, инкубируйте в течение дополнительного периода 5 минут вместе с ручным перемешиванием.
5. После того, как клетки будут отделены, добавьте 5 мл DMEM плюс 10% FBS для инактивации трипсина и соберите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 50 мл с помощью пипетки.
6. Центрифугируйте пробирку, содержащую клеточную суспензию, при плотности 180 x g в течение 5 минут. Сцедите надосадочную жидкость.
7. Добавьте 10 мл DMEM плюс 10% FBS среды в гранулу и аккуратно пипетируйте среду вверх и вниз, чтобы привести клетки в состояние суспензии.

2. Затравка клеток в 6-луночный планшет

1. Засейте клетки с плотностью 2,0 х 10⁵ клеток/лунку в 6-луночный культуральный планшет.
2. Инкубируйте 6-луночный культуральный планшет при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% содержанием_CO2 в течение ночи перед комбинированной стимуляцией M5, чтобы клетки прилипли к планшету.

3. М5-стимуляция клеток HaCaT

1. Смесь цитокинов М5, содержащая 10 нг/мл рекомбинантного IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, и белок онкостатина М в DMEM, содержащем 2% FBS.
   Комбинация М5 состояла из рекомбинации IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α и онкостатина M. Синергическое действие комбинации M5 повторяет некоторые особенности псориаза, такие как повышение регуляции хемокинов и продукции антимикробных пептидов³¹.
2. После ночного культивирования клеток удалите надосадочную жидкость и пипеткой 2 мл комбинированной среды М5 в каждую лунку.
3. Продолжайте культивирование клеток; клеточные лизаты собирали через 24 ч для количественного определения мРНК (этап 4) или супернатанты культур собирали через 48-72 ч для определения уровней цитокинов методом иммуноферментного анализа 32,33,34,35,36,37 (этап 6).

4. Сбор мРНК стимулированных M5 клеток HaCaT

1. Отсадите смесь M5 и промойте один раз 1-2 мл холодной PBS.
2. Аспиратуйте PBS и добавьте 1 мл коммерчески доступного раствора изотиоцианата гуанидии непосредственно в чашку для культивирования для лизирования клеток.
3. Несколько раз пипеткой вверх и вниз для гомогенизации и переноса лизата клеток в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Оставить при комнатной температуре на 5 минут.
4. Добавьте 200 μл хлороформа, энергично встряхните пробирку в течение примерно 20 с и инкубируйте образец в течение 5 минут при комнатной температуре.
5. Центрифуга при 12 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
6. Перенесите водную фазу в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
7. Добавьте 500 мкл изопропанола в водную фазу и аккуратно перемешайте. Оставить при комнатной температуре на 5 минут.
8. Центрифуга при 10 000 x g в течение 15 мин при 4 °C.
9. Аспиратуйте изопропанол и добавьте 1 мл 75% этанола. Промойте гранулу один раз.
10. Центрифуга при 7 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Слейте этанол и дайте гранулам высохнуть на воздухе.
11. Добавьте 30 μл воды, обработанной DEPC, в гранулу РНК. Подготовьтесь к обнаружению методом ОТ-ПЦР.

5. Анализ экспрессии мРНК методом ПЦР в реальном времени

1. Выполните синтез кДНК с 1 мкг общей РНК с использованием коммерчески доступного набора, следуя инструкциям производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 1 г общей РНК для анализа SYBR Green RT-PCR.
2. Приготовьте реакционную смесь для ПЦР. 12,5 мкл премикса SYBR EX Taq II, 1 мкл прямого праймера для ПЦР (10 мкМ), 1 мкл обратного праймера для ПЦР (10 мкМ), 2 г кДНК и 8,5 мкл dH₂O. Конечный объем составляет 25 мкл на одну реакцию.
   Примечание: Список последовательностей праймеров генов, использованных для анализа методом ОТ-ПЦР в данном исследовании, приведен в таблице 1.
3. Инкубировать в термоамплификаторе. Условия циклирования включали стадию денатурации при 95 °C в течение 30 с, 40 циклов при 95 °C в течение 5 с, 60 °C в течение 30 с, 72°C в течение 20 с и анализ кривой плавления.
4. Анализируйте данные эксперимента ОТ-ПЦР путем вычисления относительных различий в экспрессии генов от значений Ct (порогового цикла) с использованием уравнений ^2-ΔΔCT. Используйте β-актин в качестве внутреннего контроля для стандартизации относительной количественной экспрессии генов ОТ-ПЦР.

6. Забор супернатанта клеточных культур для ИФА

1. Пипетируйте каждую среду для культивирования клеток в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
2. Центрифуга при 1500 x g в течение 10 мин при 4 °C.
3. Добавьте надосадочную жидкость и немедленно храните при температуре -80 °C.

7. Анализ экспрессии цитокинов методом ИФА

1. Следуйте инструкциям производителя, чтобы подготовить все реактивы, рабочий стандарт и образцы. Трехкратное серийное разведение стандартного с разбавителем образца в диапазоне от 2 000 до 2,74 пг/мл. Разбавьте образцы 1:2 разбавителем для пробы.
2. Добавьте 100 мкл стандарта и образца в лунку. Накройте лунки крышкой и заклейте пластину парафиновой пленкой. Выдерживать в течение 2,5 ч при комнатной температуре.
3. Через 2,5 ч раствор выбросить. Добавьте по 300 мкл промывочного буфера в каждую лунку планшета на 3 минуты и аспирируйте. Повторите процесс еще четыре раза. После последней стирки переверните пластину и постучите по впитывающей бумаге, чтобы удалить остатки жидкости.
4. Добавьте по 100 мкл раствора антитела для обнаружения в каждую лунку. Выдержите тарелку в шейкере в течение 2 ч при температуре 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор биотинилированных антител для обнаружения готовится в каждом наборе для ИФА.
5. Отсадите и промойте каждую лунку планшета пять раз, используя 300 μл буфера для промывки. После последней стирки переверните пластину и постучите по впитывающей бумаге, чтобы удалить остатки жидкости.
6. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл конъюгата HRP-стрептавидина. Выдерживать в течение 45 минут при комнатной температуре с легким встряхиванием.
7. Выбросьте раствор путем аспирации с помощью пипетки после инкубации. Промойте каждую лунку пластины пять раз, используя 300 μл буфера для промывки. После последней стирки переверните пластину и постучите по впитывающей бумаге, чтобы удалить остатки жидкости.
8. Выполните обнаружение, добавив 100 мкл субстрата TMB в каждую лунку. Выдерживать в течение 30 минут при температуре 37 °C в темноте.
9. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл стоп-раствора, когда цвет проявится. Аккуратно постучите по тарелке, чтобы обеспечить тщательное перемешивание. Считывание при 450 нм сразу.

Комбинированная стимуляция M5 индуцировала воспалительную реакцию клеток HaCaT.
Клетки HaCaT стимулировали комбинацией цитокинов M5 или без нее в течение 24 ч. Оценивали экспрессию мРНК генов, связанных с псориазом, которые участвуют в регуляции иммунных и воспалительных хемокинов и антимикробных пептидов. Нейтрофильные хемокины CXCL1³⁸, CXCL2³⁹, CXCL8⁴⁰ и Т-клеточные хемокины CCL20^41,42 были значительно увеличены в комбинированных М5 клетках HaCaT по сравнению с необработанными клетками HaCaT в зависимости от времени (рис. 1A). Экспрессия BD2⁴³, S100A7^44,45, S100A8⁴⁶, S100A9⁴⁶ и S100A12^47,48 в виде антимикробных пептидов была едва обнаружена в нестимулированных клетках HaCaT и сильно экспрессировалась после комбинированной стимуляции M5 с независящим от времени паттерном экспрессии (рис. 2A). Кроме того, микроматричную экспрессию псориазиформного кожного воспаления при HaCaT также проводили с использованием Human Expr 12x135K Arr^{Del 49}. Было обнаружено, что цитокины, хемокины (рисунок 1B) и антимикробные пептиды (рисунок 2B) активируются в комбинированном сочетании M5 HaCaT. Уровни белков IL-6, IL-1β, IL-18 и CXCL8 20,50,51,52,53,54 были изучены с помощью ИФА в качестве подтверждения. Более высокие уровни белка наблюдались в супернатанте комбинационных клеток HaCaT, стимулированных комбинацией M5, по сравнению с контрольными клетками (рис. 1C). Между тем, для оценки патофизиологической корреляции индуцированного комбинацией M5 псориазиформного кожного воспаления на клетках HaCaT, набор данных микрочипов (GDS4602)⁵⁵ из образца биопсии пораженной кожи нормальных пациентов и пациентов с псориазом был загружен из омнибуса экспрессии генов (GEO). Мы исследовали уровни экспрессии нескольких провоспалительных хемокинов, цитокинов и антимикробных пептидов. Результаты показали, что провоспалительные хемокины CXCL1, CXCL2, CXCL8 и CCL20 и антимикробные пептиды BD2, S100A7, S100A8, S100A9 и S100A12 чрезмерно экспрессируются в псориатической коже по сравнению с нормальной кожей (Дополнительная таблица 1). В совокупности эти результаты указывают на то, что комбинированная стимуляция M5 в клетках HaCaT способствовала возникновению псориазиформного воспаления in vitro, с увеличением провоспалительных хемокинов и продукции антимикробных пептидов на уровне транскрипции. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить это в качестве модели для модели псориазиформного воспаления.

Комбинированная стимуляция M5 снижает уровень дифференцировки кератиноцитов в клетках HaCaT
HaCaT как бессмертная клеточная линия кератиноцитов, сохранил свойства функциональной дифференцировки нормальных кератиноцитов, показал нормальную кератинизацию и стратификацию, выращенные в органотипических культурах^56,57, и нормальную трансформацию морфогенеза до особенностей дифференцировки в культуральной среде с высокой концентрацией кальция 57,58,59. Уровни мРНК KRT5 и KRT14 в качестве цитокератина, связанного с пролиферирующими кератиноцитами, были повышены при стимулированном М5 HaCaT (рис. 3A). Для дальнейшего изучения влияния комбинированной стимуляции М5 на уровень дифференцировки кератиноцитов была проведена оценка экспрессии мРНК маркеров дифференцировки кератиноцитов. KRT1 и KRT10, которые одними из первых экспрессировались во время ороговения в качестве ранних создателей дифференцировки, были значительно подавлены (рис. 3A). Между тем, уровни мРНК лорикрина и филаггрина в качестве маркеров поздней дифференцировки, которые являются основными компонентами эпидермальной ороговевшей оболочки, были значительно снижены (рис. 3A). Профилирование экспрессии микрочипов также повышает регуляцию маркеров пролиферации кератиноцитов KRT5 и KRT6, в то время как маркеры дифференцировки KRT1, KRT10, лорикрин и филаггрин подавляются (рис. 3B). Это похоже на исследования, проведенные в биопсии человека, где по сравнению с нормальной кожей, профиль GEO пациентов с псориатическим поражением кожи (GDS4602)⁶⁰ показал снижение экспрессии KRT10, филаггрина и лорикрина (дополнительная таблица 1). Таким образом, комбинация M5 снижает экспрессию маркера дифференцировки кератиноцитов в клеточной линии HaCaT.

Рисунок 1: Гены хемокинов устойчиво увеличиваются в клетках HaCaT, культивируемых комбинацией IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α и OSM (комбинация M5). Клетки HaCaT культивировали в комбинации M5 в течение 6, 12 и 24 часов. Проводили анализ QRT-ПЦР и нормализовали уровни экспрессии мРНК для CXCL1, CXCL2, CXCL8 и CCL20 с помощью гена β-актинового домовладения и экспрессировали по мере увеличения кратности по сравнению с нестимулированным контролем (A), Анализ тепловой карты профилей экспрессии цитокинов и хемокинов между контролем и M5-стимулированным HaCaT (B). Уровни IL-6, IL-1β, IL-18 и CXCL8 в супернатанте культур клеток HaCaT, стимулированных M5 в течение 96 ч, определяли методом иммуноферментного анализа (C). Среднее значение ± SD. *P < 0,05; **P < 0,01; Р < 0,001. Двуххвостый t-критерий Стьюдента. Данные представляют собой три независимых эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Устойчивое увеличение генов антимикробного пептида в клетках HaCaT, культивируемых комбинацией M5. Клетки HaCaT культивировали в комбинации M5 в течение 6, 12 и 24 часов. Проводили анализ QRT-ПЦР и нормализовали уровни экспрессии мРНК для BD2, S100A7, S100A8, S100A9 и S100A12 с использованием гена β-актинового домохозяйки и экспрессировали по мере увеличения кратности по сравнению с нестимулированным контролем (А), Анализ тепловой карты профилей экспрессии антимикробных пептидов между контролем и М5-стимулированным HaCaT (B). Среднее значение ± SD. *P < 0,05; **P < 0,01; Р < 0,001. Двуххвостый t-критерий Стьюдента. Данные представляют собой три независимых эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Поддерживаемое снижение генов дифференцировки кератиноцитов в клетках HaCaT, культивируемых комбинацией M5. Клетки HaCaT культивировали в комбинации M5 в течение 6, 12 и 24 часов. Проводили анализ QRT-ПЦР и нормализовали уровни экспрессии мРНК для KRT1, KRT10, филаггрина и лорикрина с помощью гена β-актинового домовладения и экспрессировали по мере увеличения кратности по сравнению с нестимулированным контролем (А), анализ тепловой карты профилей пролиферации и дифференцировки маркеров кератиноцитов между контролем и М5-стимулированным HaCaT (В). Среднее значение ± SD. *P < 0,05; **P < 0,01; Р < 0,001. Двуххвостый t-критерий Стьюдента. Данные представляют собой три независимых эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Список последовательностей праймеров генов, используемых для анализа ОТ-ПЦР

Дополнительная таблица 1: GEO-профиль кожи при псориатических поражениях по сравнению с нормальной кожей. Данные профиля GEO (GSD4602) были получены из биопсии кожи 58 здоровых и 64 с псориазными поражениями. Соотношение между кожей при псориазном поражении и нормальной кожей было рассчитано с помощью программного обеспечения Prism 8. Значения p были проанализированы с помощью U-критерия Манна-Уитни.

В данной работе описан способ с использованием комбинации пяти цитокинов (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) в клеточную линию HaCaT для установления in vitro псориазиформного кожного воспалительного профиля на уровне транскрипции. Данный протокол может быть адаптирован для изучения механизма действия генов в патогенезе псориаза, а также для скрининга терапевтических препаратов для лечения псориаза. Недавние исследования показали, что гиперэкспрессия CD8 Т-клеток IL-17A и IL22, продуцирующих CD8 в пораженной коже, предполагает их участие в патогенезе псориаза⁶¹. IL-1α, IL-22 и IL-17A могут вызывать воспаление кожи у животных моделей 62,63,64,65. Цитокины, способные индуцировать специфические паттерны экспрессии, связанные с продуцируемыми антимикробными пептидами, такими как IL-17 и IL-22⁶⁶ или врожденным иммунным ответом, таким как IL-17, IL-1α и TNF-α 11,62,67, или программы дифференцировки кератиноцитов, такие как IL-22 или OSM^68,69. Наши результаты подтвердили, что IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α и OSM являются основными индукторами воспаления кожи и продемонстрировали мощный синергизм в экспрессии хемокинов, цитокинов и антимикробных пептидов в клеточной линии HaCaT.

Примечательно, что комбинация M5 индуцировала экспрессию нейтрофилов клеток HaCaT, привлекающих хемокины CXCL1, CXCL2, CXCL8, и рекрутирование клеток CCR6⁺ Th17 хемокинов CCL20, которые играют решающую роль в инициации и поддержании псориаза 70,71,72. Предполагается, что антимикробные пептиды модифицируют воспалительные реакции хозяина с помощью различных механизмов, включая действие ангиогенных факторов, хемотаксических агентов и регуляторов пролиферации клеток, которые были вовлечены в развитие псориаза в последние годы⁷³. S100A8 и S100A9 также участвуют в вербовке воспалительных инфильтратов^74,75. S100A8 и S100A9 увеличивают продукцию CXCL1, CXCL2, CXCL8 и CCL20 в кератиноцитах⁷⁶. BD2 обладает хемокиновой активностью и может привлекать Т-клетки памяти и незрелые дендритные клетки к месту микробной инвазии посредством взаимодействия с CCR6⁷⁷. S100A12 имеет хемотаксис на тучных клетках и моноцитах⁷⁸. Антимикробные пептиды, экспрессируемые в модели M5 стимулированного HaCaT псориазиформа in vitro, необходимы для естественной защиты кожи, а также способствуют инфильтрации воспалительных клеток.

Наши данные показали достоверное снижение экспрессии генов ранней (KRT1 и KRT10) и поздней (филаггрин и лорикрин) дифференцировки после комбинированной стимуляции M5 в клетках HaCaT (рис. 2). Псориаз характеризуется неконтролируемым повышением скорости пролиферации и плохой дифференцировкой⁷⁹. GWAS выявил многочисленные генетические вариации, связанные с псориазом, включающие многие гены, имеющие решающее значение для дифференцировки кератиноцитов. Кератиноциты псориаза, идентифицированные РНК-секвенированием, снижены, дифференциально экспрессируются гены, обогащенные генами, ассоциированными с эпидермальной дифференцировкой⁸¹. Кератиноциты псориаза показали снижение экспрессии генов ранней (KRT1, KRT10, DSC1) и поздней (LOR, FLG, IVL) дифференцировки⁸¹. KRT1 и KRT10 принимают непосредственное участие в контроле клеточного цикла, который запускает дифференцировку кератиноцитов⁸². Мутация KRT1/10 или отсутствие KRT10 показали большую эпидермальную пролиферацию в базальном слое^83,84. Мутация потери функции (p.K4022X) в гене филаггрина связана с псориазом⁸⁵. Мутация лорикрина, как кандидата в локус PSORS4, нарушает дифференцировку кератиноцитов и замедляет процесс гибели клеток⁸⁶. Наблюдалось снижение экспрессии филаггрина и лорикрина кератиноцитами в коже поражения псориазом⁸⁷. Кроме того, S100A8/A9 стимулирует пролиферацию кератиноцитов за счет индуцированного фосфорилирования p38 и SAPK/JNK с последующей активацией ERK1/2⁸⁸. В целом, паттерн экспрессии мРНК процесса дифференцировки кератиноцитов, стимулируемого комбинацией M5 на клетках HaCaT, согласуется с паттерном экспрессии псориатических поражений кожи.

В этом протоколе клеточная линия HaCaT была использована для создания псориазиформных моделей кожного воспаления in vitro, поскольку их легко получить и они культивируются с хорошей стабильностью и воспроизводимостью. Несмотря на то, что клетки HaCaT широко использовались в исследованиях псориаза 15,16,17,18,19, сообщалось, что профиль транскрипции генов белков, ассоциированных с ороговевшей оболочкой, в клетках HaCaT в целом отличался от такового в первичных кератиноцитах, что позволяет предположить, что клетки HaCaT имеют ограничение в качестве модели для изучения развития нормального кожного барьера ^89,90. Между тем, кератиновый профиль, экспрессируемый HaCaT, намного шире, чем обычно наблюдается в первичных кератиноцитарных культурах, включая кератины, связанные с простым эпителием¹⁹. В нашем предыдущем исследовании анализ обогащения генонтологии (GO) клетками HaCaT, стимулированными M5, показал аналогичное обогащение генов в данных транскриптома с пораженной кожей и эпидермисом пациентов с псориазом. Мы обнаружили, что в дифференциально экспрессируемых генах (DEGs) псориазоподобных клеток HaCaT паттерн DEGs в клетках HaCaT, стимулированных M5, коррелирует с патогенетическими особенностями псориаза (GSE54456, GSE26866)⁹¹. Между тем, иммуногистохимические паттерны хемокинов ^40,92,93, антимикробных пептидов 46,94,95,96,97 и маркеров дифференцировки кератиноцитов 97,98,99,100 у пациентов с псориазом соответствовали базе данных GEO. Таким образом, клетки HaCaT, стимулированные М5 в качестве модели кожного воспаления in vitro псориазиформы, были сходны с первичными кератиноцитами.

Примечательно, что активность рекомбинантных цитокинов имеет решающее значение для успеха эксперимента. Всегда делайте рабочие аликвоты растворенных рекомбинантных цитокинов и избегайте циклов замораживания/размораживания. Между тем, мы обнаружили более сильный псориазиформный кожный воспалительный процесс при М5, стимулированном HaCaT культуральной средой плюс 2% FBS по сравнению с 10% FBS. Кроме того, идентификация экспрессии провоспалительных хемокинов необходима для определения того, является ли модель псориазиформа, индуцированной M5, успешной, прежде чем проводить скрининг потенциальных лекарств или исследования механизма псориаза.

Здесь мы установили комбинацию M5, которая стимулирует клетки HaCaT псориазиформную кожную воспалительную модель, демонстрируя последовательную экспрессию медиаторов воспаления и снижение уровня дифференцировки кератиноцитов у пациентов с псориазом, демонстрируя преимущества изучения синергетического влияния цитокинов на патофизиологическое состояние in vitro. Синергетическая стимуляция IL-17A, IL22, IL-1α, TNF-α и OSM может стать новой ценной стратегией для идентификации ключевых патогенных тканеспецифичных молекул заболевания и представлять собой потенциальный биомаркер или лекарственную мишень для разработки будущих методов лечения псориаза.

Авторы не сообщали о потенциальном конфликте интересов.

Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая [81703132, 31271483, 81472650, 81673061, 81573050, 31872739 и 81601462]