Este estudo investiga como o uso indevido crônico de álcool afeta a função imunológica dos macrófagos alveolares, alterando o metabolismo mitocondrial. No geral, nossa pesquisa destaca a interseção do uso de álcool, metabolismo e função imunológica, tornando-a relevante para campos como imunologia, farmacologia e saúde pública. Embora o uso de álcool tenha efeitos prejudiciais conhecidos, os mecanismos metabólicos específicos e, particularmente, o papel da oxidação da glutamina nos macrófagos alveolares não são totalmente compreendidos.
Além disso, este protocolo preenche uma lacuna metodológica, permitindo a reprodutibilidade em estudos futuros. Este protocolo permite medições sensíveis da respiração mitocondrial em tempo real de múltiplas réplicas técnicas e biológicas. Ele pode ser ajustado para outros tipos de células e é mais confiável para testar a função metabólica do que outras técnicas que consomem mais tempo ou exigem tamanhos de amostra maiores.
Esses resultados esclarecem o impacto da exposição ao etanol no metabolismo da glutamina de macrófagos alveolares, o que pode influenciar intervenções terapêuticas em estudos futuros. Em geral, esperamos ver uma mudança na compreensão do metabolismo celular da glutamina e de outros modelos de doenças. Nosso trabalho se concentrou em entender como os macrófagos pulmonares metabolizam as fontes de combustível para obter energia.
Como os macrófagos precisam de muita energia para funções imunológicas, como sinalização para outras células imunes e fagocitose e eliminação de patógenos, nossos próximos passos se concentrarão em vincular mudanças no metabolismo energético com a função imunológica dos macrófagos. Para começar, pegue células MHS cultivadas tratadas com etanol por 72 horas e crescidas até pelo menos 50% de confluência em frascos T75. Crie um mapa de placas com cinco a seis réplicas técnicas para cada réplica biológica sob condições controladas e tratadas com etanol, incluindo controles de meio para comparação BPTES.
Enxágue as células com meio fresco ou PBS para remover detritos e células flutuantes. Em seguida, adicione seis mililitros de meio contendo soro ao frasco T75 para nutrir as células. Usando um raspador de células, retire as células até que o fundo do frasco esteja limpo.
Separe as células destacadas pipetando-as usando uma pipeta sorológica ou uma pipeta de um mililitro. Transfira as células suspensas para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 200G por seis minutos para pellet as células. Em seguida, aspirar o sobrenadante do sedimento da célula centrífuga.
Adicione um mililitro de meio ao pellet e ressuspenda bem as células. Transfira 10 microlitros da suspensão celular para um tubo de microcentrífuga. Adicione 10 microlitros de azul de tripano e misture bem a solução.
Agora, transfira 10 microlitros da mistura de azul de tripano celular para um lado de um hemocitômetro ou contador de células, para contar as células. Calcule a diluição necessária com base no número de poços e células necessários usando a fórmula mostrada aqui. Em seguida, aplique 80 microlitros das células ressuspensas nos poços necessários na placa de microcultura de fluxo extracelular de 96 poços.
Incube as células durante a noite em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono para permitir que elas adiram e se equilibrem na placa. Após o tratamento, remova a parte superior do pacote de fluxo extracelular e coloque a parte sondada do pacote de fluxo voltada para cima na bancada. Aplique 200 microlitros de solução calibrante de fluxo extracelular em cada poço na parte inferior do cartucho do pacote de fluxo extracelular.
Monte o cartucho do pacote de fluxo extracelular reconectando as seções e envolvendo-o em Parafilm. Coloque o cartucho em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius, sem dióxido de carbono, ou banho de contas, para equilibrar. Por fim, ligue o computador com o desenho do ensaio e abra o software de análise conectado ao instrumento bioanalisador de fluxo extracelular.
Comece verificando as células MHS de controle e tratadas com etanol para garantir que estejam saudáveis e aderidas em uma monocamada sob um microscópio. Para preparar o meio base de fluxo extracelular, alíquota de 35 mililitros em um tubo de 50 mililitros. Adicione 350 microlitros de piruvato de sódio de 100 milimolares, D-glicose e GlutaMAX para estabilidade.
Aqueça a solução preparada a 37 graus Celsius. Em seguida, aspire suavemente o meio de crescimento da placa de microcultura de fluxo extracelular, deixando o mínimo de meio residual sem perturbar as células. Lave os poços com até 50 microlitros de meio base de fluxo extracelular.
Em seguida, adicione 180 microlitros de meio base de fluxo extracelular a cada poço. Incube a placa de microcultura extracelular em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius, sem dióxido de carbono, por 30 minutos a uma hora para permitir o equilíbrio. Adicione 700 microlitros de meio base de fluxo extracelular ao tubo BPTES para fazer uma solução estoque de 120 milimolares.
Pipetar a solução para uma solubilização adequada. Em seguida, adicione 630 microlitros de meio de base de fluxo extracelular ao tubo de oligomicina para preparar uma solução estoque de 100 milimolares e misture bem. Em seguida, adicione 720 microlitros de meio de base de fluxo extracelular ao tubo FCCP para preparar uma solução estoque de 100 milimolares.
Pipetar a solução para cima e para baixo 10 vezes para solubilizar adequadamente o composto. Adicione 540 microlitros de meio de base de fluxo extracelular ao tubo RA para preparar uma solução estoque de 50 milimolares e misture por pipetagem. Para preparar uma solução de trabalho BPTES de 30 micromolares, misture 1.500 microlitros de meio de base de fluxo extracelular com 500 microlitros de solução estoque BPTES de 120 milimolares.
Misture 2.520 microlitros de meio base de fluxo extracelular com 480 microlitros de solução estoque de oligomicina de 100 milimolares para criar uma solução de trabalho de 16 milimolares. Em seguida, prepare a solução de trabalho FCCP misturando 2.865 microlitros de meio base suplementado com fluxo extracelular com 135 microlitros de solução estoque FCCP de 100 milimolares. Para preparar a solução de trabalho AR, misture 2.700 microlitros de meio base suplementado com fluxo extracelular com 300 microlitros de solução estoque de RA de 50 milimolares.
Carregue os poços de fundo, controle de mídia e células com os reagentes mostrados aqui. As células de etanol e BPTES-MHS exibiram uma menor taxa de consumo de oxigênio basal dependente de glutamina das células e respiração mitocondrial ligada ao ATP da glutamina em comparação com as células controle. As células de etanol e BPTES apresentaram menor perda na respiração máxima e redução da capacidade respiratória sobressalente dependente de glutamina em relação às células de controle.
