Bu çalışma, kronik alkol kötüye kullanımının mitokondriyal metabolizmayı değiştirerek alveoler makrofaj bağışıklık fonksiyonunu nasıl etkilediğini araştırmaktadır. Genel olarak, araştırmamız alkol kullanımı, metabolizma ve bağışıklık fonksiyonunun kesişimini vurgulayarak immünoloji, farmakoloji ve halk sağlığı gibi alanlarla ilgili hale getiriyor. Alkol kullanımının zararlı etkileri bilinmekle birlikte, spesifik metabolik mekanizmalar ve özellikle alveoler makrofajlarda glutamin oksidasyonunun rolü tam olarak anlaşılamamıştır.
Ek olarak, bu protokol metodolojik olarak gelecekteki çalışmalarda tekrarlanabilirliğe izin veren bir boşluğu doldurmaktadır. Bu protokol, birden fazla teknik ve biyolojik kopyanın gerçek zamanlı hassas mitokondriyal solunum ölçümlerine izin verir. Diğer hücre tipleri için ayarlanabilir ve metabolik fonksiyonu test etmek için daha fazla zaman alan veya daha büyük numune boyutları gerektiren diğer tekniklere göre daha güvenilirdir.
Bu sonuçlar, etanol maruziyetinin alveolar makrofaj glutamin metabolizması üzerindeki etkisini açıklığa kavuşturur ve bu da gelecekteki çalışmalarda terapötik müdahaleleri etkileyebilir. Genel olarak, hücresel glutamin metabolizmasını ve diğer hastalık modellerini anlamaya yönelik bir kayma görmeyi bekliyoruz. Çalışmamız, akciğer makrofajlarının enerji için yakıt kaynaklarını nasıl metabolize ettiğini anlamaya odaklanmıştır.
Makrofajlar, diğer bağışıklık hücrelerine sinyal gönderme ve patojen fagositozu ve temizlenmesi gibi bağışıklık fonksiyonları için çok fazla enerjiye ihtiyaç duyduğundan, bir sonraki adımlarımız enerji metabolizmasındaki değişimleri makrofaj bağışıklık fonksiyonu ile ilişkilendirmeye odaklanacaktır. Başlamak için, 72 saat boyunca etanol ile muamele edilmiş ve T75 şişelerinde en az% 50 birleşme noktasına kadar büyütülmüş kültürlenmiş MHS hücrelerini alın. BPTES karşılaştırması için ortam kontrolleri de dahil olmak üzere, kontrol ve etanol ile muamele edilmiş koşullar altında her biyolojik kopya için beş ila altı teknik kopya içeren bir plaka haritası oluşturun.
Kalıntıları ve yüzen hücreleri temizlemek için hücreleri taze ortam veya PBS ile durulayın. Daha sonra hücreleri beslemek için T75 şişesine altı mililitre serum içeren ortam ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, şişenin tabanı temizlenene kadar hücreleri ayırın.
Ayrılan hücreleri serolojik bir pipet veya bir mililitrelik bir pipet kullanarak pipetleyerek ayırın. Askıya alınmış hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri peletlemek için altı dakika boyunca 200G'de santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı santrifüj hücresi peletinden aspire edin.
Pelete bir mililitre ortam ekleyin ve hücreleri iyice yeniden askıya alın. 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 10 mikrolitre tripan mavisi ekleyin ve çözeltiyi iyice karıştırın.
Şimdi, hücreleri saymak için 10 mikrolitre hücre tripan mavisi karışımını bir hemositometrenin veya hücre sayacının bir tarafına aktarın. Burada gösterilen formülü kullanarak ihtiyaç duyulan kuyu ve hücre sayısına bağlı olarak gereken seyreltmeyi hesaplayın. Daha sonra, 80 mikrolitre yeniden askıya alınmış hücreleri, 96 oyuklu hücre dışı akı mikrokültür plakasındaki gerekli kuyucuklara uygulayın.
Hücreleri, plakaya yapışmalarını ve dengelenmelerini sağlamak için% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece, nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin. Tedaviden sonra, hücre dışı akı paketinin üst kısmını çıkarın ve akı paketinin sondalanan kısmını yüzü yukarı bakacak şekilde tezgahın üzerine yerleştirin. Hücre dışı akı paketi kartuşunun alt kısmındaki her bir oyuğa 200 mikrolitre hücre dışı akı kalibrant çözeltisi uygulayın.
Bölümleri yeniden takarak ve Parafilm'e sararak hücre dışı akı paketi kartuşunu birleştirin. Dengelemek için kartuşu 37 santigrat derece, karbondioksit olmayan, nemlendirilmiş bir inkübatöre veya boncuk banyosuna yerleştirin. Son olarak, tahlil tasarımının bulunduğu bilgisayarı açın ve hücre dışı akı biyoanalizör cihazına bağlı analiz yazılımını açın.
Kontrol ve etanol ile muamele edilmiş MHS hücrelerini kontrol ederek başlayın, sağlıklı olduklarından ve mikroskop altında tek tabakalı bir tabakaya yapıştıklarından emin olun. Hücre dışı akı baz ortamını hazırlamak için, 35 mililitreyi 50 mililitrelik bir tüpe alikot edin. Stabilite için her biri 350 milimolar sodyum piruvat, D-glikoz ve GlutaMAX'ın her birine 100 mikrolitre ekleyin.
Hazırlanan çözeltiyi 37 santigrat dereceye ısıtın. Daha sonra, büyüme ortamını hücre dışı akı mikrokültür plakasından nazikçe aspire edin ve hücreleri rahatsız etmeden minimum kalıntı ortamı bırakın. Kuyuları 50 mikrolitreye kadar hücre dışı akı baz ortamı ile yıkayın.
Daha sonra, her oyuğa 180 mikrolitre hücre dışı akı baz ortamı ekleyin. Hücre dışı mikrokültür plakasını 37 santigrat derece, karbondioksit içermeyen, nemlendirilmiş bir inkübatörde dengeyi sağlamak için 30 dakika ila bir saat boyunca inkübe edin. 120 milimolar bir stok çözeltisi yapmak için BPTES tüpüne 700 mikrolitre hücre dışı akı baz ortamı ekleyin.
Uygun çözünürlük için çözeltiyi pipetleyin. Daha sonra, 100 milimolar bir stok çözeltisi hazırlamak için oligomisin tüpüne 630 mikrolitre hücre dışı akı baz ortamı ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra, 100 milimolar bir stok çözeltisi hazırlamak için FCCP tüpüne 720 mikrolitre hücre dışı akı baz ortamı ekleyin.
Bileşiği uygun şekilde çözündürmek için çözeltiyi 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 50 milimolar bir stok çözeltisi hazırlamak için RA tüpüne 540 mikrolitre hücre dışı akı baz ortamı ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. 30 mikromolar BPTES çalışma çözeltisi hazırlamak için, 1.500 mikrolitre hücre dışı akı baz ortamını 500 mikrolitre 120 milimolar BPTES stok çözeltisi ile karıştırın.
16 milimolar bir çalışma çözeltisi oluşturmak için 2.520 mikrolitre hücre dışı akı baz ortamını 480 mikrolitre 100 milimolar oligomisin stok çözeltisi ile karıştırın. Daha sonra 2.865 mikrolitre hücre dışı akı takviyeli baz ortamı 135 mikrolitre 100 milimolar FCCP stok çözeltisi ile karıştırarak FCCP çalışma çözeltisini hazırlayın. RA çalışma çözeltisini hazırlamak için, 2.700 mikrolitre hücre dışı akı takviyeli baz ortamını 300 mikrolitre 50 milimolar RA stok çözeltisi ile karıştırın.
Arka planı, ortam kontrolünü ve hücre içeren kuyuları burada gösterilen reaktiflerle yükleyin. Etanol ve BPTES-MHS hücreleri, kontrol hücrelerine kıyasla daha düşük glutamine bağımlı bazal oksijen tüketim oranı hücreleri ve glutaminden ATP'ye bağlı mitokondriyal solunum sergiledi. Etanol ve BPTES hücreleri, kontrol hücrelerine göre maksimal solunumda daha az kayıp ve glutamine bağlı yedek solunum kapasitesinde azalma gösterdi.
