Esse protocolo é significativo porque células lin-negativas e células SK isoladas do mesmo camundongo doador não tiveram diferença aparente na geração de LMA-MLL-AF9. Além disso, a injeção IP de células leucêmicas pode desenvolver com sucesso um modelo de LMA em camundongos. Comparada aos métodos convencionais de transplante, essa técnica é mais conveniente e menos dispendiosa.
Para começar, esterilize o camundongo fêmea C57BL/6J CD45.1 de 8 a 10 semanas de idade com etanol 70%. Coloque o mouse em uma almofada cirúrgica estéril em uma placa de isopor e fixe as pernas através das almofadas da pata do rato. Corte a pele acima da cavidade abdominal na linha média e amplie o espaço subcutâneo em direção às patas traseiras com uma tesoura estéril afiada.
Estender a incisão da linha média abdominal até os tornozelos e ampliar o espaço subcutâneo abaixo das patas traseiras com as lâminas de tesoura afiada. Corte o tendão de Aquiles com uma tesoura afiada. Segure o tendão usando pinças com dentes e corte a outra extremidade presa ao fêmur para remover o músculo gastrocnêmio.
Corte o tendão do quadríceps preso ao joelho com uma tesoura afiada. Segure o tendão e corte a cabeça do músculo preso ao fêmur para remover o músculo gastrocnêmio. Corte os outros músculos ao redor do fêmur na extremidade presa à tíbia.
Em seguida, corte o tornozelo com uma tesoura afiada, garantindo que a tíbia permaneça intacta. Segure a extremidade distal do fêmur e corte a articulação do quadril com uma tesoura afiada, garantindo que a cabeça femoral permaneça intacta. Transfira as tíbias e fêmures para um tampão de fluxo em um tubo de 15 mililitros.
Separe a tíbia e o fêmur quebrando o joelho com a mão. Remova a patela, cartilagem e côndilos femorais para expor o platô tibial e o fêmur distal. Retire os músculos usando gaze estéril e mergulhe os ossos em um tampão de fluxo.
Corte o colo femoral e lave as células da medula óssea com tampão de fluxo de ambas as extremidades do fêmur usando uma seringa de 10 mililitros com uma agulha de calibre 23. Em seguida, corte o maléolo tibial e lave as células da medula óssea com tampão de fluxo de ambas as extremidades da tíbia. Disperse as células pipetando para cima e para baixo usando uma seringa de 10 mililitros com uma agulha calibre 18.
Centrifugar a suspensão de célula única a quatro graus Celsius e 400 G durante três minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em cinco mililitros de tampão de lise de hemácias, ou hemácias, para lisar as hemácias por três minutos. Adicione cinco mililitros de tampão de fluxo para parar a lise.
Em seguida, centrifugar a suspensão celular e ressuspender o pellet em cinco mililitros de tampão de fluxo. Coloque um filtro de células de 70 mícrons em um tubo de 50 mililitros e passe a suspensão pelo filtro para coletar as células. Ajuste a concentração celular com tampão de fluxo para uma vez 10 a oito por mililitro em tubos de polipropileno de fundo redondo.
Selecione células negativas de linhagem usando um kit de isolamento de células hematopoiéticas de camundongo de acordo com as instruções do fabricante. Uma vez feito, centrifugar as células-tronco hematopoéticas selecionadas e as células negativas de linhagem não selecionadas e ressuspender em três mililitros de 2X de citocinas, meios IMDM e três mililitros de sobrenadante viral em uma placa revestida retro-redutora. Incube o prato em uma incubadora umidificada de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius por 6 ou 24 horas.
Após a transdução, colher as células por centrifugação. Se necessário, use tripsina para coletar as células ligadas ao fundo do prato. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em PBS pré-aquecido.
Injetar células no camundongo receptor primário retro-orbital ou intraperitonealmente com uma meia agulha de calibre 27. Monitore o mouse diariamente. Após um mês, coletar sangue semanalmente por sangramento retro-orbital para monitorar a leucocitose avaliando o hemograma completo em um HEMAVET.
Proponha o olho com o polegar e o indicador e, em seguida, penetre no plexo do seio venoso com um tubo capilar de hematócrito estéril através do canto interno. Colete de 20 a 25 microlitros de sangue em um tubo de coleta de sangue EDTA e feche as pálpebras para parar o sangramento. Aplique uma gota de solução oftálmica de sulfato de gentamicina no olho.
Quando os glóbulos brancos atingirem quatro vezes 10 a quatro células por microlitro, isole as células da medula óssea lavando os fêmures e tíbias com tampão de fluxo, seguido de lise eritrocitária, como descrito anteriormente. Em seguida, para colher os esplenócitos, coloque o mouse em uma almofada cirúrgica estéril em uma placa de isopor e fixe as pernas através das almofadas da pata do rato. Esterilizar o rato com etanol a 70%.
Corte a pele e o músculo na linha média para expor a cavidade abdominal com uma tesoura estéril afiada. Isole o baço e coloque-o em um tampão de fluxo em um tubo de 15 mililitros. Malha o baço através de um filtro de 70 mícrons em um prato de seis centímetros com três mililitros de tampão de fluxo.
Transfira as células da placa para um tubo de 15 mililitros, centrifugar a suspensão de célula única, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em cinco mililitros de tampão de lise de hemácias por três minutos. Adicione cinco mililitros de tampão de fluxo para parar a lise e centrifugar a suspensão celular. Ressuspenda o pellet em cinco mililitros de tampão de fluxo, misture e passe através de um filtro de células de 70 mícrons para coletar células em um tubo de 50 mililitros.
Identificar células primárias de leucemia mieloide aguda, ou LMA, corando os esplenócitos e as células da medula óssea com o anticorpo anti-camundongo CD45.1 conjugado FITC e detectando em um citômetro de fluxo. As células são primeiramente acopladas em FSC-A FSC-H e FSC-A SSC-A para adquirir singletes. A população CD45.1 positiva é limitada na parcela FL1 comparando-a com células não coradas.
Para transplante secundário, ressuspenda as células esplênicas CD45.1 da LMA de receptores retroorbitários primários em PBS e injete-as retroorbitalmente em camundongos machos CD45.2. A presença de leucocitose aberrante e o aumento da infiltração de células leucêmicas na medula óssea e no baço apoiam a viabilidade do uso de células negativas para linhagem da medula óssea para gerar LMA primária. Não foram observadas diferenças significativas em receptores primários traduzidos com LSK ou células negativas para linhagem.
As células AML disseminaram-se na cavidade abdominal dos receptores primários por leucemia de linhagem mista ou células transduzidas de linhagem MLL-AF9 negativas. Esses resultados também confirmaram o estabelecimento da LMA primária via injeção intraperitoneal de células negativas para linhagem da medula óssea transduzidas por MLL-AF9 na forma de leucocitose e a presença de células de LMA na medula óssea e no baço de camundongos receptores. No entanto, o transplante primário por injeção intraperitoneal levou mais tempo para desenvolver LMA do que por injeção retroorbitária, apesar do igual número de células doadoras.
Os receptores secundários apresentaram leucocitose e hepatoesplenomegalia significativa em menos de um mês pós-transplante. As células da LMA também foram detectadas no sangue periférico, medula óssea e baço, bem como na cavidade peritoneal. A injeção intraperitoneal de oito vezes 10 para as cinco células de LMA obteve enxertia comparável à injeção retro-orbitária de oito vezes 10 para as cinco LMA.
Os camundongos receptores terciários exibiram agudamente sinais de LMA, incluindo leucocitose e hepatoesplenomegalia, presença de células leucêmicas no sangue, medula óssea e baço, observação histológica do fêmur e baço demonstrou ainda a infiltração de células leucêmicas. Comparado aos transplantes secundário e terciário, o transplante terciário progrediu muito mais rápido que o transplante secundário. Para o modelo atual, a classificação de células LSK é desnecessária.
As células lin-negativas podem ser transduzidas com o vírus da LMA por 6 horas ou 24 horas. Isso não afetará a eficiência do estabelecimento do modelo.
