Ce protocole est significatif parce que les cellules lin-négatives et les cellules SK isolées des mêmes souris donneuses n’avaient aucune différence apparente dans la génération de LAM induite par MLL-AF9. En outre, l’injection IP de cellules leucémiques peut développer avec succès un modèle murin de LAM. Par rapport aux méthodes de transplantation conventionnelles, cette technique est plus pratique et moins coûteuse.
Pour commencer, stérilisez la souris C57BL/6J femelle CD45.1 âgée de 8 à 10 semaines avec de l’éthanol à 70 %. Placez la souris sur un tampon chirurgical stérile sur un panneau de polystyrène et épinglez les jambes à travers les coussinets de la souris. Coupez la peau au-dessus de la cavité abdominale à la ligne médiane et élargissez l’espace sous-cutané vers les pattes postérieures avec des ciseaux stériles à extrémité pointue.
Étendez l’incision de la ligne médiane abdominale jusqu’aux chevilles et élargissez l’espace sous-cutané sous les pattes postérieures avec les lames de ciseaux à extrémité tranchante. Couper le tendon d’Achille avec des ciseaux à extrémité pointue. Tenez le tendon à l’aide d’une pince avec des dents et coupez l’autre extrémité attachée au fémur pour enlever le muscle gastrocnémien.
Coupez le tendon du quadriceps attaché au genou avec des ciseaux à extrémité pointue. Tenez le tendon et coupez la tête musculaire attachée au fémur pour enlever le muscle gastrocnémien. Coupez les autres muscles entourant le fémur à l’extrémité attachée au tibia.
Ensuite, coupez la cheville avec des ciseaux tranchants, en veillant à ce que le tibia reste intact. Tenez l’extrémité distale du fémur et coupez l’articulation de la hanche avec des ciseaux à extrémité tranchante, en veillant à ce que la tête fémorale reste intacte. Transférer les tibias et les fémurs dans un tampon d’écoulement dans un tube de 15 millilitres.
Séparez le tibia et le fémur en brisant le genou à la main. Retirez la rotule, le cartilage et les condyles fémoraux pour exposer le plateau tibial et le fémur distal. Retirez les muscles à l’aide d’une gaze stérile et faites tremper les os dans un tampon d’écoulement.
Couper le col du fémur et rincer les cellules de la moelle osseuse avec un tampon d’écoulement des deux extrémités du fémur à l’aide d’une seringue de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 23. Ensuite, coupez la malléole tibiale et rincez les cellules de la moelle osseuse avec un tampon d’écoulement des deux extrémités du tibia. Disperser les cellules en pipetant de haut en bas à l’aide d’une seringue de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 18.
Centrifuger la suspension unicellulaire à quatre degrés Celsius et 400 G pendant trois minutes. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de globules rouges, ou RBC, tampon de lyse pour lyser les globules rouges pendant trois minutes. Ajouter cinq millilitres de tampon de débit pour arrêter la lyse.
Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire et remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de tampon de débit. Placez une passoire cellulaire de 70 microns sur un tube de 50 millilitres et passez la suspension à travers la crépine pour recueillir les cellules. Ajustez la concentration de la cellule avec tampon de débit à une fois 10 à huit par millilitre dans les tubes en polypropylène à fond rond.
Sélectionnez les cellules de lignée négative à l’aide d’un kit d’isolation de cellules hématopoïétiques de souris conformément aux instructions du fabricant. Une fois cela fait, centrifuger les cellules souches hématopoïétiques triées et les cellules négatives de lignée non triées et les remettre en suspension dans trois millilitres de cytokines 2X, de milieux IMDM et de trois millilitres de surnageant viral dans une boîte enrobée de rétro-réducteur. Incuber le plat dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 6 ou 24 heures.
Après la transduction, récolter les cellules par centrifugation. Si nécessaire, utilisez de la trypsine pour recueillir les cellules attachées au fond du plat. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans du PBS préchauffé.
Injecter des cellules dans la souris receveuse principale rétro-orbitalement ou intrapéritonéale avec une demi-aiguille de calibre 27. Surveillez la souris quotidiennement. Après un mois, prélever du sang chaque semaine par saignement rétro-orbitaire pour surveiller la leucocytose en évaluant la numération globulaire complète sur un HEMAVET.
Proptose l’œil avec le pouce et l’index, puis pénètre dans le plexus du sinus veineux avec un tube capillaire hématocrite stérile à travers le canthus interne. Recueillir 20 à 25 microlitres de sang dans un tube de prélèvement sanguin EDTA et fermer les paupières pour arrêter le saignement. Appliquez une goutte de solution ophtalmique de sulfate de gentamycine sur l’œil.
Lorsque les globules blancs atteignent quatre fois 10 à quatre cellules par microlitre, isoler les cellules de la moelle osseuse en rinçant les fémurs et les tibias avec un tampon d’écoulement, suivi d’une lyse des globules rouges comme décrit précédemment. Ensuite, pour récolter les splénocytes, placez la souris sur un tampon chirurgical stérile sur un panneau de polystyrène et épinglez les pattes à travers les coussinets de la souris. Stérilisez la souris avec de l’éthanol à 70%.
Coupez la peau et les muscles à la ligne médiane pour exposer la cavité abdominale avec des ciseaux stériles à extrémité pointue. Isolez la rate et placez-la dans un tampon d’écoulement dans un tube de 15 millilitres. Mailler la rate à travers une passoire de 70 microns dans une boîte de six centimètres avec trois millilitres de tampon de débit.
Transférer les cellules de la capsule dans un tube de 15 millilitres, puis centrifuger la suspension unicellulaire, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans cinq millilitres de tampon de lyse des globules rouges pendant trois minutes. Ajouter cinq millilitres de tampon d’écoulement pour arrêter la lyse et centrifuger la suspension cellulaire. Remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de tampon de débit, mélangez et passez à travers une crépine cellulaire de 70 microns pour recueillir les cellules dans un tube de 50 millilitres.
Identifier les cellules de la leucémie myéloïde aiguë primitive, ou LAM, en colorant les splénocytes et les cellules de la moelle osseuse avec l’anticorps CD45.1 anti-souris conjugué FITC et en les détectant sur un cytomètre en flux. Les cellules sont d’abord fermées sur FSC-A FSC-H et FSC-A SSC-A pour acquérir des singlets. La population CD45.1 positive est fermée sur le graphique FL1 en la comparant à des cellules non colorées.
Pour la transplantation secondaire, remettre en suspension les cellules spléniques de la LAM CD45.1 provenant de receveurs rétroorbitaires primaires dans le PBS et les injecter rétro-orbitalement à la souris mâle CD45.2. La présence d’une leucocytose aberrante et l’infiltration accrue de cellules leucémiques dans la moelle osseuse et la rate appuient la faisabilité de l’utilisation de cellules négatives de la lignée de la moelle osseuse pour générer une LAM primaire. Aucune différence significative n’a été observée chez les receveurs primaires traduits avec LSK ou cellules de lignée négative.
Les cellules de LAM se propagent dans la cavité abdominale des receveurs primaires par leucémie de lignée mixte ou cellules MLL-AF9 transduites de lignée négative. Ces résultats ont également confirmé l’établissement de la LAM primaire par injection intrapéritonéale de cellules MLL-AF9 de la lignée de moelle osseuse négatives sous forme de leucocytose et la présence de cellules de LAM dans la moelle osseuse et la rate des souris receveuses. Cependant, la greffe primaire par injection intrapéritonéale a pris plus de temps à développer une LAM que par injection rétro-orbitale malgré le nombre égal de cellules de donneur.
Les receveurs secondaires ont présenté une leucocytose et une hépatosplénomégalie significative moins d’un mois après la transplantation. Les cellules AML ont également été détectées dans le sang périphérique, la moelle osseuse et la rate, ainsi que dans la cavité péritonéale. L’injection intrapéritonéale de huit fois 10 aux cinq cellules de LAM a permis d’obtenir une greffe comparable à l’injection rétro-orbitale de huit fois 10 aux cinq cellules de LAM.
Les souris receveuses tertiaires présentaient des signes aigus de LMA, notamment une leucocytose et une hépatosplénomégalie, la présence de cellules leucémiques dans le sang, la moelle osseuse et la rate, l’observation histologique du fémur et de la rate a également démontré l’infiltration de cellules leucémiques. Par rapport aux transplantations secondaires et tertiaires, la transplantation tertiaire a progressé beaucoup plus rapidement que la transplantation secondaire. Pour le modèle actuel, le tri des cellules LSK n’est pas nécessaire.
Les cellules Lin-négatives peuvent être transduites avec le virus AML pendant 6 heures ou 24 heures. Cela n’affectera pas l’efficacité de l’établissement modèle.
