Nosso protocolo é o primeiro método documentado para anestesia e intubação endotraqueal de filhotes de camundongos pré-adolescentes para cirurgia cardiotorácica. Desenvolvemos regimes anestésicos, equipamentos especializados e práticas específicas de manuseio que permitem a intubação endotraqueal de filhotes de camundongos C57 Black Six J de 10 dias de idade para cirurgia cardiotorácica, minimizando a mortalidade animal. Prevemos que um operador experiente em intubações adultas pode alcançar proficiência em intubação pré-adolescente depois de praticar em 10 ninhadas de sete a oito filhotes Demonstrando o procedimento estará o Dr. Jianxin Wu, um cientista sênior da equipe de nosso laboratório.
No dia do experimento, montar equipamentos especializados para intubação de filhotes de 10 dias de idade, conforme descrito no manuscrito. Para a cirurgia, use uma cânula que consiste em uma tubulação de plástico de 19 milímetros de comprimento presa a um adaptador de bloqueio de isca fêmea de plástico de 21 milímetros. Enrijeça a tubulação da cânula inserindo um pedaço de fio de cobre através do adaptador de bloqueio de isca.
Prenda o filhote anestesiado em decúbito dorsal a uma plataforma de intubação. Antes da intubação do filhote anestesiado, verifique a profundidade da anestesia pelo reflexo de pinça da pata. O reflexo de pinça da pata deve estar presente, mas acentuadamente reduzido em relação ao de um animal consciente.
Segure a língua do filhote com uma pequena pinça e use um laringoscópio feito de um pedaço de fio de cobre e uma luz de fibra óptica flexível para expor a glote e as cordas vocais. Incline a cânula enrijecida para que a extremidade da trava de isca fique ligeiramente mais baixa do que a ponta e, assim que as cordas vocais se separarem, insira a cânula e avance-a até que o adaptador de bloqueio de isca esteja fora da boca. Em seguida, remova imediatamente o fio.
Avaliar a profundidade da anestesia após a intubação pela capacidade do animal de respirar espontaneamente. Transfira o filhote entubado para uma almofada de aquecimento a 37 graus Celsius. Confirme a intubação traqueal bem-sucedida do filhote de respiração espontânea, bloqueando brevemente o cateter de intubação para verificar se isso impede o movimento do tórax.
Conecte a cânula endotraqueal a um ventilador, fornecendo oxigênio a 100% a uma taxa de fluxo de um litro por minuto. O procedimento deve levar menos de 15 segundos para minimizar a rerespiração. Após a indução de um plano cirúrgico de anestesia para a cirurgia, confirme a intubação traqueal, verificando se a frequência de movimento da parede torácica é igual à do ventilador.
Coloque o filhote sob um microscópio cirúrgico com objetivos 10X e 16X para a cirurgia de infarto do miocárdio. Depois de desinfetar a pele, faça uma incisão horizontal da pele entre a terceira e a quarta costela na parede lateral esquerda do tórax usando um bisturi. Com a ajuda de pinças finas, abra o tórax por dissecção contundente do espaço intercostal e use um afastador para manter o espaço aberto.
Induzir um infarto do miocárdio ligando a artéria coronária esquerda distal ao apêndice atrial esquerdo com uma sutura de monofilamento de polipropileno 9-0. Após os 10 minutos da cirurgia de infarto, feche a pele com uma sutura de 7-0. Limpe o sangue com etanol a 70% ou solução salina e desinfete a incisão com Betadine.
Permita que o animal se recupere e garanta que a respiração espontânea seja retomada em poucos minutos. Em seguida, devolva o filhote à câmara pré-oxigenada aquecida e monitore continuamente durante a recuperação. À medida que o reflexo de endireitamento é recuperado, extubar o filhote.
Esfregue suavemente o filhote com a cama da gaiola caseira. Mantenha o filhote aquecido e verifique se a respiração é regular e se o filhote é capaz de movimento espontâneo. Devolva a barragem à gaiola.
Em seguida, devolva todos os filhotes quando eles tiverem se recuperado totalmente da anestesia. Abrigue a represa e os filhotes durante a noite em uma gaiola colocada metade em uma almofada de aquecimento situada a 37 graus Celsius. No terceiro dia pós-cirurgia, prenda o filhote anestesiado em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento, colando a cauda.
Coloque um fio sobre os incisivos e tape o filhote em uma posição e mantenha a cabeça estendida em um cone nasal. Desinfete a pele com etanol a 70%. Usando uma tesoura fina, faça uma incisão de um centímetro na pele sobre a artéria carótida comum direita ao longo da traqueia e canule o vaso exposto usando um único tubo de polietileno de lúmen ligado a uma agulha de calibre 26 para administrar 0,2 mililitros de solução salina heparinizada por um minuto após causar uma parada cardíaca, conforme descrito no manuscrito, dissecar a veia jugular direita através da incisão anterior e transectá-la.
Perfundir o coração com 0,2 mililitros de PBS e, em seguida, com 0,1 mililitros de 0,2% de Azul Alciano para manchar o miocárdio remoto não infartado. Verifique a perfusão bem-sucedida, evidenciada pela lavagem do sangue, PBS e, em seguida, Alcian Blue através da veia jugular. Quando terminar, abra o tórax e excise o coração, dissecando o tecido conjuntivo circundante e os vasos para liberar o coração.
Lave o coração em PBS, em seguida, remova os átrios e fotografe o coração com uma câmera montada em um microscópio cirúrgico usando um subjetivo 10X. Nos experimentos preliminares, o esquema anestésico foi otimizado para filhotes de 10 dias de idade. Uma dose de 50 miligramas por kg de cetamina, seis miligramas por kg de xilazina e 0,18 miligramas por kg de atropina resultou em uma profundidade suficiente de anestesia para permitir a intubação endotraqueal de filhotes respirando espontaneamente pesando 5,5 a 7,30 gramas.
Como os filhotes mais leves não podiam tolerar a maior dose de anestesia, a diminuição da dosagem para 30 miligramas por kg de cetamina, quatro miligramas por kg de xilazina e 0,12 miligramas por kg de atropina permitiu a intubação dos filhotes pesando 4,50 a 5,49 gramas. Em comparação, uma redução adicional da dose de cetamina para 20 miligramas por kg permitiu a intubação de filhotes pesando 3,15 a 4,49 gramas. A tabela também mostra o número e a porcentagem de filhotes intubados que procederam à cirurgia.
Os filhotes com menor peso corporal foram mais difíceis de intubar do que os filhotes mais pesados e necessitaram de mais tentativas, o que resultou em uma menor porcentagem de sobrevivência dos filhotes do que o grupo de maior peso. Além disso, um número maior de filhotes intubados do grupo de maior peso procedeu à cirurgia de infarto do miocárdio do que o grupo de baixo e médio peso. A sobrevida dois dias após a cirurgia de infarto do miocárdio foi consistente entre os diferentes grupos de peso em 86% a 92%A profundidade da anestesia é crítica para a intubação e sobrevida.
Se a anestesia for muito leve, a intubação é difícil. Se muito profundo, os filhotes param de respirar espontaneamente durante ou após a intubação. Nosso protocolo de intubação anestésica permitirá que modelos que necessitem de cirurgia torácica cardíaca sejam estabelecidos em camundongos pré-adolescentes, permitindo, por exemplo, estudos sobre os pulmões, esôfago e coração durante esse período.
