O zebrafish é único em sua capacidade intrínseca de regenerar muitos tipos diferentes de tecidos, incluindo o RPE. Este protocolo pode ser usado para identificar vias moleculares que impulsionam a regeneração de RPE e mecanismos relacionados à doença de RPE. A versatilidade é uma vantagem primária dessa metodologia.
Além de estudar a regeneração do RPE, este protocolo pode ser utilizado para examinar os processos degenerativos rpe e os efeitos dos danos de RPE em tecidos adjacentes no olho. Os mamíferos, incluindo os humanos, são incapazes de reparar grandes lesões de RPE resultantes de trauma ou doença degenerativa. O uso do zebrafish como ferramenta para descobrir fatores pró-regenerativos da RPE é um passo significativo para promover a regeneração de RPE dos mamíferos.
Para preparar uma solução fresca de MTZ de 10 milimose, cinco dias após a fertilização, adicione pó MTZ à água do sistema sem PTU e misture completamente por um tremor vigoroso por uma hora a 37 graus Celsius. Esfrie a solução MTZ de 10 milimólares por uma hora à temperatura ambiente em um rotador de mesa ou agitador. Para testar larvas de zebrafish do transgene rpe65a:nsfB-eGFP, separe larvas positivas transgênicas eGFP de larvas negativas eGFP não transgênicas usando um microscópio estéreo fluorescente com um laser de excitação de 488 nanômetros.
Acorde larvas com tela imediatamente, pipetando diretamente em uma placa de Petri com PTU de 1,5X fresco sem tricaine. Após a conclusão da triagem, separe ainda mais as larvas positivas eGFP em dois grupos de placas de Petri, um grupo para receber tratamento MTZ e um grupo para ser o controle não controlado. Em seguida, ablate o pigmento de retina epitélio removendo 1,5X PTU dos pratos de tratamento ablado e adicionar a solução MTZ recém-feita de 10 milimolar.
Também remova 1,5X PTU dos pratos de controle não jateados e adicione água fresca do sistema sem PTU. Remova a solução MTZ de 10 milimões após exatamente 24 horas e adicione água fresca do sistema sem PTU. Mude a água fresca do sistema sem PTU nos pratos negativos MTZ.
Tela eGFP larvas positivas em quatro dias após a fertilização. O eGFP é visível quatro dias após a fertilização, mas parece mais fraco que a intensidade do sinal no quinto dia. Coloque larvas positivas eGFP em placas de seis poços em vez de placas de Petri a uma densidade de não mais de 10 larvas por poço para tratamento farmacológico.
Designe placas separadas de seis poços para larvas abladas e nãobladas. Determine o volume de 15 micromolar IWR-1 ou volume compatível com os pré-tratamentos de controle de veículo DMSO necessários e alíquota de 1,5X PTU em tubos cônicos em conformidade. Adicione ações IWR-1 a 1,5X PTU para uma concentração final de 15 micromolar IWR-1.
Adicione um volume compatível de estoque DMSO a 1,5X PTU. Misture bem com vórtice e confirme visualmente a dissolução dos compostos. Remova 1,5X PTU das larvas positivas eGFP em placas de seis poços e adicione cinco mililitros por poço de tratamentos recém-fabricados 0,06%DMSO ou 15 micromolar IWR-1.
Abule o RPE no dia seguinte. Em cinco dias após a fertilização, determine o volume de tratamentos farmacológicos e de controle de veículos necessários tanto para placas não abladas quanto para seis poços e volumes apropriados de aliquot de água do sistema fresco sem PTU ou solução MTZ de 10 milimões em tubos cônicos. Adicione as soluções de estoque IWR-1 e DMSO aos respectivos tubos cônicos, conforme realizado anteriormente.
Misture bem com vórtice e confirme visualmente a dissolução dos compostos. Remova 0,06% DMSO e 15 pré-tratamentos micromolar IWR-1 em PTU de 1,5X de placas designadas não abladas e abladas de seis poços. Reabasteca com a água adequada do sistema fresco sem tratamentos de solução PTU e MTZ.
Remova tratamentos de 0,06% DMSO e 15 micromolar IWR-1 em solução MTZ de 10 milômlares após exatamente 24 horas e reabasteça-se com tratamentos em água do sistema fresco sem PTU. Reabastecer tratamentos IWR-1 de 0,06% e 15 micromolar em água fresca do sistema sem PTU na placa de seis poços não jatada. Monitore o sucesso e a extensão da ablação in vivo usando iluminação de luz transmitida em um microscópio estéreo para manutenção larval pós-ablação genética.
Para gerar a região de interesse do RPE ou ROI usando Fiji, abra uma imagem TIFF de oito bits, reoriente a imagem para que o lado dorsal fique para cima e distal seja deixado escolhendo imagem, transforme e gire horizontalmente. Para o último comando, escolha a opção que melhor se adequa à direcionalidade necessária para essa imagem. Inicie o gerenciador de ROI escolhendo análise, ferramentas, gerenciador de ROI.
Use imagem, zoom e alternar entre os canais DAPI e Brightfield. Use atalhos de teclado para obter eficiência. Identifique o ponto em que o lado apical do RPE está adjacente da ponta da membrana limitante externa e use este marco anatômico como ponto de partida do ROI.
Crie o ROI RPE com a ferramenta de seleções de polígonos na barra de ferramentas fiji usando os canais de imagem DAPI e Brightfield e a função de zoom de imagem para identificar limites de RPE apical e basal. Leve as extremidades dorsal e ventral do ROI a um ponto afiado em vez de cortar ou arredondar. Adicione o ROI clicando em adicionar no gerenciador de ROI.
Salve o arquivo ROI escolhendo mais e salve dentro do gerenciador de ROI. Clique duas vezes no rpegen. m arquivo para abrir no painel do editor.
Sob a seção variável definida pelo usuário do rpegen. m arquivo, digite os locais do diretório para pastas contendo os arquivos roi, os arquivos de imagem de tiff e onde os arquivos de saída devem ser salvos. Digite o nome do grupo para que o arquivo do tapete seja exportado e a localização do canal Brightfield na pilha de imagens TIFF.
Execute o script clicando no botão executar no menu do editor na parte superior do MATLAB. Depois de salvar o arquivo MAT, uma figura de três painéis aparecerá e também será salva como um PDF para o diretório de saída para cada execução de imagem. Aguarde até que esses PDFs de controle de qualidade tenham sido salvos na pasta de saída e a última figura tenha desaparecido.
Abra os PDFs individuais e verifique se todos os ROIs correspondem às imagens de Brightfield. Clique duas vezes no rpegen_permplot. m arquivo para abrir em uma nova guia de editor.
Em variáveis definidas pela seção de um usuário, digite o local do diretório para a pasta de saída contendo os arquivos MAT de execução do rpegen. m script. Digite cada nome de arquivo MAT a ser carregado.
Execute esta seção do script clicando no botão executar seção no menu do editor. Na seção dois, digite os nomes dos dois grupos para uma comparação estatística nas variáveis dados A e dados B e designe o número de repetições de simulação de permutação na variável reps. Apenas 2.000 repetições foram usadas para esta demonstração para diminuir o tempo de processamento.
Execute esta seção do script clicando no botão executar seção no menu do editor. Execute a figura do mapa de calor e os resultados do grupo e seções de valor P independentemente usando o botão de seção executar. Danos inteiros de uma larva pós-fertilização de cinco dias mostraram expressão transgênica brilhante no RPE no momento da triagem para ablação genética.
A crioseção transversa de larva pós-fertilização de seis dias nãoblada mostrou que a expressão transgênica era restrita a células RPE maduras com a expressão mais brilhante confinada ao 2/3 central do RPE. Pontas de flecha indicam microvilli apical. A crioseção transversal de uma larva pós-lesão de um dia ablada revelou interrupção da morfologia celular positiva eGFP.
Flechas indicam núcleos pyknotic. Danos inteiros de montagem de larvas pós-fertilização nãobladas de sete dias mostraram pigmentação de RPE em todo o olho e larvas pós-lesões de dois dias abladas mostraram uma zona de ablação sem pigmento no RPE central. Um gráfico gerado usando RpEGEN mostrou semelhança entre os grupos DMSO pós-fertilização pós-fertilização de nove dias não jatidos e IWR-1 em toda a extensão do RPE.
A trama mostrou intensidade de pixel mais leve nos grupos DMSO e IWR-1 mais leves de quatro dias, que pareciam mais leves no IWR-1 ablado quando comparados a qualquer outro grupo de tratamento. As diferenças na pigmentação central de RPE foram significativas ao comparar larvas tratadas IWR-1 abladas com controles tratados com DMSO ablados. Usando este paradigma de ablação de zebrafish, conseguimos identificar várias vias de sinalização molecular, como sinalização de vento que mostramos aqui, que são reguladores críticos da regeneração de RPE.
