Рыбка данио уникальна своей внутренней способностью регенерировать многие различные типы тканей, включая RPE. Этот протокол может быть использован для идентификации молекулярных путей, которые управляют регенерацией RPE и механизмами, связанными с болезнью RPE. Универсальность является основным преимуществом этой методологии.
В дополнение к изучению регенерации RPE, этот протокол может быть использован для изучения дегенеративных процессов RPE и влияния повреждения RPE на соседние ткани в глазу. Млекопитающие, включая людей, не в состоянии восстановить большие повреждения RPE в результате травмы или дегенеративного заболевания. Использование рыбок данио в качестве инструмента для обнаружения прорегенеративных факторов RPE является значительным шагом на пути к содействию регенерации RPE млекопитающих.
Чтобы приготовить свежий 10-миллимолярный раствор МТЗ, через пять дней после оплодотворения, добавьте порошок МТЗ в системную воду без ПТУ и тщательно перемешайте путем энергичного встряхивания в течение одного часа при 37 градусах Цельсия. Охладите 10-миллимолярный раствор МТЗ в течение одного часа при комнатной температуре на настольном ротаторе или шейкере. Чтобы отсеять личинок рыбок данио от трансгена rpe65a:nsfB-eGFP, отделите трансгенных положительных личинок eGFP от нетрансгенных отрицательных личинок eGFP с помощью флуоресцентного стереомикроскопа с 488-нанометровым лазером возбуждения.
Проснуться отсеивают личинок немедленно, пипетируя непосредственно в чашку Петри со свежим 1,5-кратным ПТЮ без трицина. По завершении скрининга далее разделяйте eGFP-положительных личинок на две группы чашек Петри, одну группу для получения обработки MTZ и одну группу, чтобы быть неабляционным контролем. Затем абляцию пигментного эпителия сетчатки удаляют 1,5X PTU из абляционной посуды для лечения и добавляют свежеприготовленный 10-миллимолярный раствор MTZ.
Также удалите 1,5X PTU из неабляционной контрольной посуды и добавьте пресную системную воду без PTU. Удалите 10-миллимолярный раствор МТЗ ровно через 24 часа и добавьте пресную системную воду без ПТЭ. Поменяйте пресную систему воды без ПТУ на отрицательной посуде МТЗ.
Скрининг положительных личинок eGFP на четыре дня после оплодотворения. eGFP виден через четыре дня после оплодотворения, но на пятый день кажется более тусклым, чем интенсивность сигнала. Поместите eGFP положительных личинок в шестилуночные пластины вместо чашек Петри при плотности не более 10 личинок на лунку для фармакологического лечения.
Назначают отдельные шестилуночные пластины для абляционных и неабляционных личинок. Определите объем 15 микромоляров IWR-1 или объем dmso, соответствующий необходимой предварительной обработке, и аликвотите 1,5X PTU в конические трубки соответственно. Добавьте запас IWR-1 к 1,5X PTU для конечной концентрации 15 микромоляров IWR-1.
Добавьте соответствующий объем запасов DMSO в 1,5X PTU. Хорошо перемешать путем вихря и визуально подтвердить растворение соединений. Удалите 1,5X PTU из положительных личинок eGFP в шестилуночных пластинах и добавьте пять миллилитров на лунку свежеприготовленных 0,06% DMSO или 15 микромолярных IWR-1 обработок.
Удалите RPE на следующий день. Через пять дней после оплодотворения определите объем фармакологических и контрольных обработок транспортных средств, необходимых как для неаблированных, так и для абляционных шестилуночных пластин и аликвотных соответствующих объемов либо пресной системной воды без ПТУ, либо 10-миллимолярного раствора МТЗ в конические трубки. Добавьте растворы IWR-1 и DMSO в соответствующие конические трубы, как это было выполнено ранее.
Хорошо перемешать путем вихря и визуально подтвердить растворение соединений. Удалите 0,06% DMSO и 15 микромолярной предварительной обработки IWR-1 в 1,5X PTU из назначенных неабляционных и абляционных шестилуночных пластин. Пополняйте запасы воды соответствующей пресной системой без обработки раствором ПТУ и МТЗ.
Удалите 0,06% DMSO и 15 микромолярных IWR-1 в 10-миллимолярном растворе MTZ ровно через 24 часа и пополните их обработками в пресной системе воды без ПТУ. Восполняйте 0,06% DMSO и 15 микромолярной обработки IWR-1 в пресной системной воде без ПТУ на небляционной шестилуночной плите. Следите за успехом и степенью абляции in vivo с помощью пропускаемого светового освещения на стереомикроскопе для поддержания личинок постгенетической абляцией.
Чтобы создать интересующую область RPE или рентабельность инвестиций с помощью Фиджи, откройте восьмибитное изображение TIFF, переориентируйте изображение так, чтобы дорсальная сторона была вверху, а дистальная часть оставалась, выбирая изображение, преобразуя и переворачивая горизонтально. Для последней команды выберите параметр, который наилучшим образом соответствует направленности, необходимой для этого изображения. Запустите менеджер ROI, выбрав анализ, инструменты, менеджер ROI.
Используйте изображение, масштабирование и переключение между каналами DAPI и Brightfield. Используйте сочетания клавиш для повышения эффективности. Определите точку, в которой апикальная сторона RPE примыкает к кончику внешней ограничивающей мембраны, и используйте этот анатомический ориентир в качестве отправной точки ROI.
Создайте рентабельность инвестиций в RPE с помощью инструмента выделения полигонов на панели инструментов Fiji, используя каналы изображения DAPI и Brightfield, а также функцию масштабирования изображения для определения апикальных и базальных границ RPE. Доведите дорсальный и вентральный концы ROI до острой точки, а не притупляйте или округляйте. Добавьте ROI, нажав на добавить в менеджере ROI.
Сохраните файл ROI, выбрав больше, и сохраните в менеджере ROI. Дважды щелкните по рпегену. m файл для открытия в области редактора.
Под заданным пользователем переменным разделом rpegen. m file, введите расположение каталогов для папок, содержащих файлы roi, файлы изображений tiff и места, где должны быть сохранены выходные файлы. Введите имя группы для экспортируемого матового файла и расположение канала Brightfield в стеке изображений TIFF.
Запустите скрипт, нажав на кнопку «Выполнить» в меню редактора в верхней части MATLAB. После сохранения файла MAT появится рисунок из трех панелей, который также будет сохранен в формате PDF в выходном каталоге для каждого запуска изображения. Подождите, пока эти PDF-файлы контроля качества не будут сохранены в выходной папке, и последний рисунок исчезнет.
Откройте отдельные PDF-файлы и убедитесь, что все ROI соответствуют изображениям Brightfield. Дважды щелкните по rpegen_permplot. m файл для открытия в новой вкладке редактора.
В разделе Переменные, определяемые одним пользователем, введите расположение каталога выходной папки, содержащей файлы MAT, запущенные при запуске rpegen. m скрипт. Введите имя каждого загружаемого ФАЙЛА MAT.
Запустите этот раздел скрипта, нажав на кнопку выполнить раздел в меню редактора. Во втором разделе введите названия двух групп для статистического сравнения в переменных данных A и данных B и обозначьте количество повторений моделирования перестановок в переменной reps. Только 2000 повторений были использованы для этой демонстрации, чтобы уменьшить время обработки.
Запустите этот раздел скрипта, нажав на кнопку выполнить раздел в меню редактора. Выполняйте рисунок тепловой карты и группируйте результаты и разделы P-value независимо друг от друга с помощью кнопки run section. Полное повреждение пятидневной личинки после оплодотворения показало яркую трансгенную экспрессию в РПЭ во время скрининга на генетическую абляцию.
Поперечная криосекция неиблированной шестидневной личинки после оплодотворения показала, что трансгенная экспрессия была ограничена зрелыми клетками RPE с самой яркой экспрессией, ограниченной центральной 2/3 RPE. Наконечники стрел указывают на апикальные микроворсинки. Поперечная криосекция абляционной однодневной посттравматической личинки выявила нарушение морфологии eGFP-положительных клеток.
Стрелки указывают на пикнотические ядра. Целые повреждения неаблированных семидневных личинок после оплодотворения показали пигментацию RPE по всему глазу, а абляционные двухдневные личинки после травмы показали зону абляции, в которой отсутствовал пигмент в центральной RPE. График, сгенерированный с использованием RpEGEN, показал сходство между неабляционными девятидневными группами DMSO и IWR-1 по всей длине RPE.
График показал общую более легкую интенсивность пикселей в абляционных четырехдневных группах DMSO и IWR-1 после травмы, которые оказались самыми легкими в абляционной IWR-1 по сравнению с любой другой группой лечения. Различия в центральной пигментации RPE были значительными при сравнении абляционных личинок, обработанных IWR-1, с контрольными группами, обработанными абляционным DMSO. Используя эту парадигму абляции рыбок данио, мы смогли идентифицировать несколько молекулярных сигнальных путей, таких как передача сигналов ветра, которые мы показали здесь, которые являются критическими регуляторами регенерации RPE.
