Name: hepatocyte-specific ablation in zebrafish to study biliary-driven liver regeneration
Uploaded: 2015-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
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The authors thank Drs. Hukriede and Tsang for discussions. M.K. was supported by an NIH training grant (T32EB001026). This work was supported in part by grants from the American Liver Foundation, the March of Dimes Foundation (5-FY12-39), and the NIH (DK101426) to D.S.

Peixe-zebra foram levantadas e produzido de acordo com o procedimento padrão; experimentos foram aprovados pela Universidade de Pittsburgh Animal Care Institucional e Comitê de Uso. 1. Preparação de Embriões / larvas <ol><li> Para realizar cruzamentos programados, configurar adulto do sexo masculino e feminino Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931 peixes hemizigóticas ou homozigotos O / N e colocar um divisor entre eles. Remover este divisor na manhã seguinte quando o acasalamento é desejado. Coletar embriões esticando a água usando um filtro fino malha de plástico. </li><li> Ligue o filtro de cabeça para baixo e lavar a superfície da malha com um bom fluxo de água ovo dispensada de uma garrafa squeeze. Transferir 100 embriões em uma placa de 100 mm de petri com 25 ml de água ovo. Mantenha há mais de 100 embriões por placa de petri e criá-los a 28 ° C. </li><li> Para inibir a pigmentação, adicionar feniltioureia (PTU) para as placas de petri antes de 10 horas pós-fertilização (HPF), e levantar embryos / larvas até 80 hpf. A concentração final do PTU é de 0,2 mm. CUIDADO: PTU é tóxico. Use de acordo com as diretrizes de manejo adequadas. </li><li> Anestesiar as larvas por adição de 3-amino benzóico éster etílico do ácido (tricaina), a uma concentração final de 0,016%, em placas de petri. Em seguida, utilizando um microscópio de epifluorescência, larvas tipo PCP-positiva. Use larvas com um tamanho semelhante fígado e descartar aqueles com uma menor ou maior do fígado. NOTA: qualquer larvas PCP-positivo, independentemente de intensidade, pode ser utilizado porque não há nenhuma diferença na extensão da ablação de hepatócitos entre as larvas hemizigótico e homozigoto. CUIDADO: tricaina é tóxico. Use de acordo com as diretrizes de manejo adequadas. </li><li> Retire a água ovo contendo tricaina e adicione água ovo suplementado com 0,2 mM PTU. Manter a embriões / larvas a 28 ° C. </li></ol> 2. Tratamento Mtz <ol><li> Prepare fresco solução a 10 mM Mtz dissolvendo 0,171 g de pó em 1 Mtz00 ml de água de ovo suplementado com 0,2% de DMSO e 0,2 mM de UTP. Para dissolver completamente o Mtz, misturar a solução à temperatura ambiente com agitação rápida durante 20-30 minutos. Para ajudar a solubilizar Mtz Mtz e para melhorar a permeação para as larvas, adicione DMSO ao preparar Mtz. CUIDADO: A exposição prolongada ou aumento da concentração de Mtz é tóxico. Use de acordo com as diretrizes de manejo adequadas. </li><li> Separe as larvas em grupos controle e experimentais, transferindo número desejado de larvas em duas diferente 100 mm prato de petri ou multi-bem placa. Para o grupo experimental, manter as larvas em solução Mtz 10 mM; para o grupo controle, mantê-los em água ovo contendo 0,2% de DMSO. </li><li> Cobrir as placas ou pratos de petri contendo a solução Mtz com folha de alumínio para evitar o foto-inactivação da MTZ, e incuba-se a 28 ° C. A duração do tratamento depende da Mtz fase larval e a linha transgénica. </li><li> Para observar a ablação de hepatócitos grave semelhante no <em&gt; Tg (fabp10a: NTR-PCP) linha, tratar as larvas com a solução de Mtz ou 3,5 dias pós-fertilização (dpf) (para uma duração de 36 h) ou a partir de 5 dpf (para uma duração de 24 horas). </li></ol> 3. Análise da regeneração hepática biliar-driven <ol><li> No final do período de ablação, remover a solução Mtz das placas. Lavar as larvas tratadas com Mtz por adição de 25 ml de água ovo. Agitar a placa de 2-3 vezes para lavar as larvas antes de descartar a água do ovo. Repetir três vezes e, em seguida, mergulhar as larvas mais uma vez em água de ovo. Para evitar o edema do coração e a morte larval em larvas tratadas com Mtz, adicionar uma concentração mais baixa de tricaina, a uma concentração final de 0,008%, para imobilizar as larvas. </li><li> Para a análise do fígado, fígado examinar o tamanho das larvas tratadas com Mtz sob um microscópio de epifluorescência, com o filtro de PCP. Avaliar os níveis de ablação de hepatócitos com base no tamanho relativo do fígado: grande (não-ablação; 0-10% de larvas), forma (parcialmente ablação; 10-20%), e muito pequena (totalmente ablação; 80-90%). </li><li> Retirar as larvas com fígados não ablacionadas ou parcialmente extirpadas. Apenas manter larvas com uma pequena fígado, o que é indicativo de ablação hepatócitos grave. Para a análise de fígado na regeneração 0 ponto de tempo hr (R0h), colher as larvas após Mtz washout e PCP classificação. Caso contrário, mantenha as larvas classificadas em água ovo suplementado com PTU 0,2 mM até que esteja pronto para a colheita. </li><li> Transferir larvas recolhidas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e substituir a água de ovo com a solução de fixação de formaldeído a 3% em tampão PEM. Incubar o tubo num rotor O / N a 4 ° C. </li><li> Substituir a solução de fixação com 1 ml de PBSDT e rodar o tubo contendo as larvas no rotor durante 5 min. </li><li> Transferir as larvas fixo numa placa de Petri contendo 100 milímetros PBSDT usando uma pinça e, remover manualmente gema e barbatanas peitorais sob um microscópio de dissecação. Transfira até tp 20 larvas dissecado em um tubo de 1,5 ml. </li> &lt;li&gt; Substitua PBSDT solução com 1 ml de solução de bloqueio e balançar o tubo num agitador rotativo à temperatura ambiente durante 2 h. </li><li> Substituir solução de bloqueio com 100 ul de solução contendo os anticorpos primários de bloqueio. Lentamente balançar o tubo num rotor O / N a 4 ° C. </li><li> Remover a solução de anticorpo primário e lava-se com PBSDT 5 vezes durante 10 min de cada vez. Em seguida, adiciona-se 100 ul de solução de bloqueio contendo anticorpos secundários e rocha que num rotor a TA durante 2 h. </li><li> Lavar cinco vezes com PBSDT durante 10 min de cada vez, à TA por balanço num rotor. </li><li> Orientar as larvas lateralmente sobre uma lâmina de microscópio e adicionar uma gota de meio de montagem. Cobri-los cuidadosamente com uma tampa de vidro e selar a tampa de vidro com um esmalte de unha. Agora, ele está pronto para a microscopia confocal. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Grave, mas não leve, ablação de hepatócitos provoca a regeneração do fígado-driven biliar. Por conseguinte, após o tratamento de lavagem e Mtz, é importante para examinar o tamanho do fígado das larvas tratadas com Mtz, que pode ser avaliada pela fluorescência intrínseca do PCP fabp10a: NTR-PCP transgene. Uma vez que uma pequena percentagem das larvas tratadas com Mtz exibirá não excisada (0-5%) ou parcialmente ablação (10-20%) os fígados, é essencial para resolver e apenas analisar as larvas com uma muito pequena do fígado, que é indicativa de ablação hepatócitos grave. Embora no nosso protocolo, tratada com larvas de peixe-zebra Mtz 3,5-5 dpf (um período de tratamento de 36 h), as fases alternativas e duração do tratamento Mtz também são possíveis. Por exemplo, as larvas tratadas 5-6 dpf (de um período de tratamento de 24 horas) também exibiu ablação hepatócitos grave, semelhante ao período de tratamento de 36 h acima mencionado. Dois grupos adicionais geradas independentementefabp10a semelhante: linhagens transgênicas NTR e também informou sobre o processo de regeneração hepática-driven biliar após a ablação específica do hepatócito. Considerando que um grupo tratado com larvas Mtz 6-7 dpf 21, outro fez 3,5-4,5 dpf, chegando a conclusões similares 20. Uma vez que cada fabp10a: linha transgénica NTR pode exibir um nível de expressão diferente NTR, a duração e a dosagem de tratamento Mtz deve ser determinado separadamente para cada uma das linha transgénica utilizada. Também podem ser úteis para gerar uma linha transgénica com uma versão aumentada do gene NTR, em que a introdução de três mutações pontuais leva a um aumento na sua actividade enzimática 26. Este mutante NTR irá resultar num evento de ablação mais rápido do que o de tipo selvagem NTR 26. Isto é especialmente vantajoso quando a cinética de tipo selvagem NTR podem limitar a possibilidade de ablação celular completo numa fase desejada. Uma vez que centenas de larvaspode submeter-se simultaneamente a ablação de hepatócitos, este modelo de lesão de fígado de peixe-zebra pode ser aplicado para telas químicas para identificar moléculas pequenas que podem suprimir ou aumentar a regeneração do fígado impulsionado-biliar. Por exemplo, usando este modelo, o grupo Shin na Georgia Tech realizada uma tela de química e encontrou vários agonistas e antagonistas Wnt Notch que facilitaram a regeneração hepática 20. Também foi realizada uma tela química pequena escala e identificou vários compostos que podem suprimir a regeneração hepática (SK, TYC, JS, e DS, em preparação). Marcador análises em seres humanos sugerem que CEBs pode contribuir para hepatócitos regeneradas no fígado doente 5,6. O grupo do Dr. Wanless &#39;relatou recentemente que uma grande percentagem de parênquima na cirrose regrediram parece ser derivado a partir de LPCs / CEBs em seres humanos 27, o que implica a importância da regeneração hepática BEC-impulsionado em regressão cirrose. Dado o facto de CEBs principalmentecontribuir para os hepatócitos em regeneração no modelo de fígado de peixe-zebra descrito aqui, este modelo será uma ferramenta valiosa para determinar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes regeneração hepática BEC-driven. Compreender esses mecanismos irá fornecer insights significativos sobre como aumentar a regeneração hepática inata em pacientes com doenças graves de fígado. Além disso, em combinação com telas químicas, este modelo de peixe-zebra pode ser útil na identificação de um medicamento potencial que pode facilitar a regeneração do fígado inata em pacientes humanos.

O fígado é um órgão altamente regenerativa. Durante a regeneração do fígado, regenerar hepatócitos, as células do parênquima do fígado, são derivados de hepatócitos pré-existentes (regeneração hepática-driven hepatócitos) ou BEC (regeneração hepática-driven biliar) 1,2. A lesão hepática geralmente provoca a proliferação de hepatócitos pré-existentes; no entanto, quando a proliferação de hepatócitos é comprometida, CEBs pode contribuir para hepatócitos 2-4. Estes dois modos de regeneração do fígado são clinicamente significativa. Após a remoção cirúrgica de uma porção do fígado humano (por exemplo, devido a tumores do fígado ou dadores vivos de fígado), hepatócitos no fígado proliferam restante para recuperar a massa do fígado perdida. Em contraste, em doentes com doenças hepáticas graves, a proliferação dos hepatócitos é grandemente comprometida, de modo a que as CEBs ou células progenitoras do fígado (LPCs) parecem contribuir para a regeneração de hepatócitos 5,6. O modelo de roedor 2/3 hepatectomia parcial, em quehepatócitos proliferam para recuperar a massa hepática perdido, tem contribuído significativamente para a compreensão atual de-driven hepatócito regeneração hepática 7,8. No entanto, não existe um modelo roedor válido no qual os hepatócitos em regeneração são derivados principalmente de CEBs. Embora vários modelos de toxina de roedor fígado levou à identificação de-driven biliar regeneração hepática 2-4, estudos recentes em rastreio de linhagem ratos indicam uma contribuição mínima de CEBs para regenerar hepatócitos nestes modelos 9,10. Alguns dos modelos de lesão de fígado de roedores, incluindo hepatectomia parcial 11-13 e induzida por acetaminofeno danos no fígado 14,15, ter sido aplicada a peixes-zebra e levou à identificação de novos genes ou vias envolvidas na regeneração do fígado. No entanto, hepatócito-driven, mas não BEC-driven, a regeneração do fígado ocorre nesses modelos de lesão do fígado de peixe-zebra. Portanto, um modelo de fígado romance em que BECs contribuir amplamente para se regeneraing hepatócitos é necessária para uma melhor compreensão da regeneração hepática BEC-driven. Os objetivos gerais do modelo de ablação de hepatócitos descritos aqui são (1) para gerar um modelo de fígado em que BECs contribuir amplamente para os hepatócitos em regeneração, e (2) elucidar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes regeneração hepática BEC-driven. Nossa hipótese é que a gravidade da lesão determina o modo de regeneração do fígado; Assim, previmos que a regeneração hepática-driven biliar iniciaria após lesão hepática grave. Para testar esta hipótese, desenvolvemos um modelo de fígado de peixe-zebra, gerando uma linhagem transgênica, Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931, que é altamente expressa nitrorredutase bacteriana (NTR) fundido com a proteína fluorescente ciano (PCP), sob a fabp10a específicas do hepatócito promotor. Desde NTR converte a pró-droga não tóxica, metronidazol (Mtz), em um fármaco citotóxico, ele destina-se somente a ablates NTR-células que expressam 16-18, neste caso, os hepatócitos. Ao manipular a duração do tratamento Mtz, a extensão da ablação de hepatócitos pode ser controlada. Usando esse modelo, que recentemente informou que após a perda de hepatócitos grave, BECs extensivamente dar origem a regeneração hepatócitos 19, que foi ainda confirmada por outros dois estudos independentes 20,21. Portanto, em comparação com o acima mencionado roedor e modelos de lesão de fígado de peixe-zebra, o nosso modelo de ablação dos hepatócitos é mais vantajoso para estudar a regeneração hepática BEC-dirigido. Este protocolo descreve o procedimento para a realização de experimentos de regeneração hepática utilizando o modelo de ablação de hepatócitos peixe-zebra. Este modelo será adequado para determinar os mecanismos subjacentes a regeneração hepática-driven biliar e para telas químicas para identificar pequenas moléculas que pode reprimir ou aumentam a regeneração do fígado.

<table><tbody><tr><td>3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1547</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Calcium sulfate dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3771</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Mounting media (Vectashield)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm petri dish&amp;nbsp;</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>M5300</td><td></td></tr><tr><td>clear nail polish</td><td>Fisher Scientific</td><td>50949071</td><td></td></tr><tr><td>fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Dumont #5&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>glass slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>glass coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540-A and 12-542-A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>zn-5 (mouse anti-Alcam)</td><td>ZIRC</td><td>zn-5</td><td>1:10 dilution</td></tr><tr><td>goat anti-Hnf4a</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6556 (C-19)</td><td>1:50 dilution</td></tr><tr><td>rat anti-RFP</td><td>Allele Biotechnology</td><td>ACT-CM-MRRFP10</td><td>1:300 dilution</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L)</td><td>Jackson laboratories</td><td>705-605-147</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21240</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Cy3 donkey anti-rat IgG</td><td>Jackson laboratories</td><td>712-165-150</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>dissecting microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6F</td><td></td></tr><tr><td>epifluorescence microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205FA</td><td></td></tr><tr><td>confocal microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>egg water</td><td></td><td></td><td>0.3 g/L of sea salts &amp;lsquo;Instant Ocean&amp;rsquo; and 0.5 mM CaSO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;in distilled water.&lt;br /&gt;
&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td></td><td></td><td>25.6 g Na2HPO4&amp;middot;7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4.&amp;nbsp; Bring to 1 L with distilled water.&amp;nbsp; Adjust pH 7.&amp;nbsp; Autoclave for 20 min at 121&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1X PBSDT</td><td></td><td></td><td>0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS.</td></tr><tr><td>PEM buffer</td><td></td><td></td><td>30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4.&amp;nbsp; Bring to 1 L with distilled water.&amp;nbsp; Adjust pH 7.</td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td></td><td></td><td>Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT.</td></tr></tbody></table>

hepatocyte-specific ablation in zebrafish to study biliary-driven liver regeneration

O fígado tem uma grande capacidade para se regenerar. Os hepatócitos, as células parenquimatosas do fígado, pode regenerar em uma de duas maneiras: a regeneração hepática hepatocyte- ou accionada por biliar. Na regeneração hepática-driven hepatócitos, os hepatócitos em regeneração são derivados de hepatócitos pré-existentes, ao passo que, na regeneração-driven biliar, hepatócitos em regeneração são derivadas de células epiteliais das vias biliares (CEBs). Para a regeneração hepática-driven hepatócito, existem modelos de roedores excelentes que têm contribuído significativamente para a compreensão atual da regeneração hepática. No entanto, não existe tal modelo de roedor existe para regeneração hepática-driven biliar. Nós recentemente relatado em um modelo de fígado de peixe-zebra em que BECs extensivamente dar origem a hepatócitos após a perda de hepatócitos grave. Neste modelo, os hepatócitos são especificamente ablação por um meio de farmacogenética. Aqui nós apresentamos em detalhes os métodos para retirar hepatócitos e analisar o processo de regeneração hepática BEC-driven.Este modelo de ablação específica do hepatócito pode ser ainda usado para descobrir os mecanismos moleculares e celulares subjacentes da regeneração hepática-driven biliar. Além disso, estes métodos podem ser aplicados para telas químicas para identificar moléculas pequenas que aumentam ou suprimem a regeneração do fígado.

MTZ tratamento durante 36 h (A36h, A representa ablação) 3,5-5 dpf reduzida drasticamente o tamanho do fígado (Figura 1B). Depois Mtz washout, considerado como o início de regeneração hepática (R), forte fabp10a: CFP-NTR e fabp10a: expressão dsRed reapareceu no prazo de 30 horas (Figura 1B). A rede biliar intra-hepático, tal como avaliado por expressão de Alcam que está presente na membrana de CEBs 22, mas inicialmente recolhido foi restabelecida em 54 horas pós-lavagem (R54h) (Figura 1C). Estes dados indicam que a regeneração e recuperação do fígado ocorrem rapidamente no nosso modelo de lesão do fígado. A Figura 2 mostra que os hepatócitos em regeneração são derivadas de CEBs. A Tg (Tp1: H2B-mCherry) A linha S939 expressa uma proteína fluorescente vermelha nuclear sob o controlo de um elemento que contém os locais de ligação 12 RBP-Jĸ 23. Este respo Notchelemento nsive parece conduzir a expressão do gene em CEBs exclusivamente no fígado 24; no entanto, é possível que dirige a expressão do gene em causa LPCs sinalização Notch está intimamente relacionado com os LPCs 25. Portanto, esta linha transgénica permite a fácil detecção de BEC, e provavelmente LPC, núcleos. Além disso, a estabilidade prolongada do H2B-mCherry autorizações de proteínas de fusão de curto prazo rastreio linhagem. A maioria das células H2B-mCherry + no fígado em regeneração R0h expressa Hnf4α (Figura 2A), que é expresso em hepatócitos, mas não em CEBs, no fígado de controlo. Hepatócitos, tal como avaliado por fabp10a: NTR-expressão PCP, em R48h ainda retido Tp1: expressão H2B-mCherry (Figura 2B, setas). Estes dados indicam a conversão BEC hepatócitos sobre perda grave de hepatócitos, o que foi confirmado pela linhagem permanente rastreio 19. <img<html> alt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52785 / 52785fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Um modelo de fígado de peixe-zebra. (A) Esquema ilustrando os períodos de tratamento Mtz e regeneração hepática. (B) 36 h tratamento Mtz reduziu significativamente o tamanho do fígado e fabp10a: PCP e fabp10a: dsRed fluorescência a R0h; no entanto, forte PCP e dsRed fluorescência reapareceu no R30h. As setas apontam para o fígado (li). visualizações (C) confocal de projecção de todo o fígado imunocoradas com anticorpos anti-Alcam que rotulados CEBs. A rede de vias biliares intra-hepática foi desabou em R0h mas rapidamente restabelecida em R54h. Regiões pontilhadas delinear o fígado. Barras de escala:. 100 (B), 20 (C) mm <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52785/52785fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> _upload / 52785 / 52785fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. BECs dar origem a hepatócitos sobre perda de hepatócitos grave (A) pontos de vista de projecção confocal do fígado mostrando Hnf4α (verde) e Tp1:. MCherry-H2B (vermelho) expressão em R0h. (B) imagens de cortes individuais-óptico confocal mostrando fabp10a: NTR-PCP (cinzento) e Tp1:-mCherry H2B (vermelho) expressão no fígado. expressão mCherry foi revelado por anti-mCherry immunostaining. Observe a expressão mCherry fraco nos núcleos de PCP + hepatócitos (setas). Células mCherry forte + são CEBs. Barras de escala:. 20 um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52785/52785fig2large.jpg" target="_blank">favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Ablação específicas do hepatócito em Zebrafish para estudar a regeneração do fígado-driven biliar

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

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Nanyang Technological University

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8.5K visualizações.  University of Pittsburgh. To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Vídeo: Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Biologia do Desenvolvimento

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Uso do Sistema de Teton para estudar os mecanismos moleculares de Regeneração Zebrafish

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Desenvolvimento de um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol no peixe-zebra para estudar Progenitor mediada por células de regeneração de hepatócitos

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

Surgical Ablation Ensaio para Estudar Eye Regeneração em Planárias

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related morbidity and mortality and affects more than 2 million people in the United States. A better understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying alcohol-induced liver injury is crucial for developing effective treatment for ALD. Zebrafish larvae exhibit hepatic steatosis and fibrogenesis after just 24 h of exposure to 2% ethanol, making them useful for the study of acute alcoholic liver injury. This work describes the procedure for acute ethanol treatment in zebrafish larvae and shows that it causes steatosis and swelling of the hepatic blood vessels. A detailed protocol for Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) staining that is optimized for the histological analysis of the zebrafish larval liver, is also described. H&#38;E staining has several unique advantages over immunofluorescence, as it marks all liver cells and extracellular components simultaneously and can readily detect hepatic injury, such as steatosis and fibrosis. Given the increasing usage of zebrafish in modeling toxin and virus-induced liver injury, as well as inherited liver diseases, this protocol serves as a reference for the histological analyses performed in all these studies.

This protocol describes histological analyses of the livers from zebrafish larvae that have been treated with 2% ethanol for 24 h. Such acute ethanol treatment results in hepatic steatosis and swelling of the hepatic vasculature.

Análises histológicas de lesão hepática alcoólica aguda em peixe-zebra

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all liver cancer cases. With the introduction of effective treatments to prevent and treat hepatitis B/C, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and the more aggressive form know as non-alcoholic steatohepatitis (NASH), are quickly becoming the number one risk factors to develop HCC in modern societies. To better understand the role NASH has on the development of HCC we designed a NASH-associated HCC zebrafish. The optical clarity and genetic tractability of the zebrafish larvae make them an appealing and powerful model to study the liver microenvironment and immune cell composition using non-invasive fluorescent live imaging. This protocol describes how to use a NASH-associated HCC zebrafish model to investigate the effect of cholesterol surplus in the liver microenvironment and its impact on immune cell composition at early stages of the disease. First, we feed HCC larvae (s704Tg), which express hepatocyte-specific activated beta-catenin, with a 10% high cholesterol diet for 8 days to develop a NASH-associated HCC model. Here we describe how to make use of different transgenic lines to evaluate several early malignancy features in the liver by non-invasive confocal microscopy, such as liver area, cell, and nuclear morphology (hepatocytes area, nuclear area, nuclear:cytoplasmic ratio (N:C ratio), nuclear circularity, micronuclei/nuclear herniation scoring) and angiogenesis. Then, using transgenic lines with tagged immune cells (neutrophils, macrophages, and T cells) we show how to analyze liver immune cell composition in NASH-associated HCC larvae. The described techniques are useful to evaluate liver microenvironment and immune cell composition at early hepatocarcinogenesis stages, but they can also be modified to study such features in other liver disease models.

Here, we present how to generate a non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-associated Hepatocellular Carcinoma (HCC) zebrafish model to study the impact of cholesterol surplus on liver microenvironment and immune cell landscape.

Análise do Microambiente Hepático Durante a Progressão Precoce do Carcinoma Hepatocelular Associado à Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica em Peixe-Zebra.

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

Pesquisa do câncer

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

Quantificando o tamanho do fígado em zebrafish larval usando microscopia de campo brilhante

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

Perfil de expressão gênica específica do tipo de célula no fígado do mouse

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Biologia

Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy livers are capable of regenerating from toxic damage, but in advanced liver disease, the natural ability of the liver to regenerate is impaired. Zebrafish have emerged as a powerful experimental system for studying regeneration. They are an ideal model for studying liver regeneration from partial hepatectomy, a procedure with direct clinical relevance in which part of the liver is surgically removed, leaving the rest intact. There is no standard protocol for partial hepatectomy; previous studies using this model have used slightly different protocols and reported disparate results. Described here is an efficient, reproducible protocol for performing a partial hepatectomy in adult zebrafish. We use this technique to demonstrate that zebrafish are capable of epimorphic regeneration of the resected lobe. This protocol can be used to further interrogate the mechanisms required for liver regeneration in zebrafish.

This protocol describes the procedure for removing the ventral lobe of the liver in adult zebrafish to enable the study of liver regeneration.

Hepatectomia Parcial em Zebrafish Adulto

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...

Targeted Liver Ablation: Inducing Hepatocyte Death with Metronidazole in Transgenic Zebrafish Larvae

Source: Choi T.Y., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52785/" target="_blank">Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration</a>. J. Vis. Exp. (2015)
The article describes targeted liver ablation, a method for inducing hepatocyte death with metronidazole in transgenic zebrafish larvae. The sample protocol describes the process for generating, manipulating and assessing targeted liver ablation in zebrafish.

Ablação hepática direcionada: induzindo a morte de hepatócitos com metronidazol em larvas de peixe-zebra transgênico

Source: Choi T.Y., et al. Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration. J. Vis. Exp. (2015)
The article describes ...