من خلال تتبع الجسيمات الحساسة للكتلة ، يمكننا ملاحظة الجزيئات الحيوية الفردية المنتشرة على الأغشية الدهنية وتحديد ديناميكياتها في الوقت الفعلي ، وكلها خالية تماما من التسميات. نظرا لعدم وجود ملصقات مطلوبة ، فلا يوجد خطر من إزعاج السلوك الديناميكي للجزيئات الحيوية. ميزة أخرى لهذه الطريقة هي حساسيتها للكتلة ، والتي تسمح لنا بتحديد حالات قلة القلة المرتبطة بالغشاء.
نظرا لتنوعها ، يمكننا تطبيق هذه الطريقة على أي نظام مرتبط بالغشاء. على وجه الخصوص ، يمكن استخدامه لدراسة تكوين مجمعات المستقبلات التي يسببها الليغاند. ابدأ بتوزيع عدد متساو من شرائح المجهر في حاملي PTFE.
نقل حاملي PTFE إلى الكعال. أضف الماء فائق النقاء وقم بصوتيته لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدم الملقط لنقل الحاملات إلى أكواب نظيفة وإضافة الأيزوبروبانول فائق النقاء.
سونيك مرة أخرى لمدة 15 دقيقة ، ثم مرة أخرى استبدال الأيزوبروبانول بالماء فائق النقاء ، وسونيك الكأس الذي يحتوي على حاملات لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة الحوامل من الأكواب وجفف شرائح المجهر في الحامل تحت تيار ثابت من غاز النيتروجين أو الهواء المضغوط. ضع الحامل المجفف الذي يحتوي على شرائح المجهر الكبيرة في منظف البلازما وقم بتشغيله.
لف الورق المقوى المسطح بورق الألومنيوم. انشر شرائح المجهر التي تم تنظيفها 24 ملم × 24 ملم على رقائق الألومنيوم مع مسافة كافية بين بعضها البعض. ثم قم بتوصيل شرائط الشريط على الوجهين بالحواف العلوية والسفلية للشرائح.
قم بقص كل شريحة مجهرية باستخدام مشرط بحيث يمكن إزالتها من رقائق الألومنيوم. يجب أن تحتوي كل شريحة على خطوط من الشريط على الوجهين متصلة بالحواف العلوية والسفلية للشريحة. ثم قم بتوصيل الشريحة بشريطي الشريط على الوجهين بالشريحة المحبة للماء.
سيشكل هذا مسار تدفق بين شرائح المجهر الأصغر والأكبر. قم بتخفيف الحويصلات الصغيرة أحادية الصفيحة المبثوقة حديثا ، أو سيارات الدفع الرباعي ، إلى تركيز نهائي قدره 0.4 ملليغرام لكل ملليلتر في المخزن المؤقت المطلوب للتفاعل. اختياريا ، لتعزيز تمزق الحويصلة ، أضف اثنين من كلوريد الكالسيوم المليمولي إلى تعليق الحويصلة.
قم بتركيب غرفة تدفق على مرحلة مقياس الكتلة الضوئية. اغسل 25 ميكرولتر من تعليق الحويصلة في غرفة التدفق واحتضن الغرفة لمدة دقيقتين ، ثم أزل الحويصلات غير المنصهرة من خلال الغسيل المتكرر لغرفة التدفق مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل في كل مرة. بمجرد أن يصبح الغشاء الدهني خاليا من الحويصلات غير المنصهرة ، أضف 50 ميكرولتر من البروتين الذي يهم إلى غرفة العينة.
بعد ذلك ، قم بتعيين شروط التصوير مثل حجم مجال الرؤية ووقت التعرض ومعدل الإطارات ووقت الاكتساب في برنامج الاستحواذ. اضبط التركيز البؤري تلقائيا. إذا لزم الأمر ، استخدم التحكم الجانبي لنقل مجال الرؤية إلى موضع به غشاء متجانس.
قم بإنشاء مجلد مشروع وابدأ تسجيل الفيلم. بعد الانتهاء من التسجيل ، حدد اسم ملف في مربع الحوار الذي يطلبه برنامج الاستحواذ. سيتم حفظ الفيلم تلقائيا في مجلد المشروع كملف MP للتحليل اللاحق.
لتحليل مقاطع الفيديو المسجلة ، قم بتشغيل تطبيق Jupyter notebook. في قائمة المجلدات الظاهرة، انتقل إلى الموقع حيث تحليل MSPT. يتم تخزين ملف دفتر الملاحظات ipy وانقر على الملف.
في دفاتر ملاحظات Jupyter ، يتم تنظيم التعليمات البرمجية في خلايا ويمكن تنفيذها خطوة بخطوة. انقر فوق الزر تشغيل الصغير بجوار الخلية أو حدد خلية واضغط على Shift Enter لتنفيذ الخلية. ابدأ باستيراد جميع الحزم المطلوبة للتحليل.
قم بتنفيذ الخلية التالية لتشغيل مطالبة ملف. اختر مجلدا يحتوي على ملف فيديو MP واحد أو عدة ملفات فيديو MP ليتم تحليلها واضغط على تحديد مجلد. تتم طباعة قائمة بالملفات المختارة أسفل الخلية.
لإزالة التشتت الثابت السائد للضوء باستخدام خوارزمية تقدير الخلفية من حيث البكسل، اختر خيار الوسيط المستمر لوضع المعلمة وقم بتعيين طول مناسب للنافذة الوسطية المنزلقة. اختياريا، احفظ الأفلام بعد إزالة الخلفية عن طريق إعداد save_processed_movies True لاستخدامها في اكتشاف الجسيمات وربط المسار. تأكد من تعيين True و GPU False المتوازي للمعالجة على وحدة المعالجة المركزية أو العكس بالعكس للمعالجة على وحدة معالجة الرسومات.
يتم تحديد الجسيمات وموقعها وتوطينها طوال الفيلم. اضبط حساسية اكتشاف الجسيمات باستخدام معلمة عتبة تستخدم لتسليط الضوء على البقع المرشحة عن طريق ثنائية الصور. افحص تأثير معلمات العتبة المختلفة على حساسية اكتشاف البقع في دفتر ملاحظات منفصل يسمى تصور الفيلم.
ipy دفتر الملاحظات. بعد تحميل الفيلم في عارض الإطارات، استخدم شريط تمرير العتبة لضبط عتبة اكتشاف الجسيمات والعثور على إعداد مناسب. بالعودة إلى دفتر الملاحظات الآخر ، اختر ثلاث معلمات لربط الجسيمات في إطارات متتالية في مسارات باستخدام تتبع حزمة Python.
اضبط الحد الأقصى لإزاحة الجسيمات من إطار إلى آخر وفقا للحد الأقصى لسرعة الانتشار المتوقعة. حدد الحد الأقصى لعدد الإطارات التي قد يختفي فيها الجسيم ويظهر مرة أخرى ولكن لا يزال يعتبر نفس الجسيم. يمكن إزالة المسارات ذات النقاط القليلة جدا باستخدام المعلمة minimum_trajectory_length لتحديد معاملات الانتشار بشكل أكثر قوة.
إصلاح جميع المعلمات في الخلية عن طريق تنفيذها. قم بتنفيذ الخلية التالية لتحليل جميع مقاطع الفيديو المحددة باستخدام المعلمات المختارة. ستظهر أشرطة التقدم لكل خطوة معالجة أسفل الخلية.
قد يستغرق ذلك بعض الوقت ، اعتمادا على طول الفيديو وإعدادات المعلمة والأجهزة. في الخطوة التالية ، يحدد البرنامج معاملات الانتشار للمسارات الموجودة في القسم السابق ، استنادا إلى كل من توزيع مسافة القفز وتحليل متوسط الإزاحة المربعة. ابدأ بتحديد frame_rate الفيلم pixel_size.
قم بإصلاحها عن طريق تنفيذ الخلية ، ثم قم بتشغيل الخلية التالية وحدد الدليل الأصل الذي يحتوي على جميع ملفات CSV التي تم إنشاؤها بواسطة trackpy. تتم طباعة قائمة بملفات CSV التي تم العثور عليها أسفل الخلية. في الخلية التالية ، اختر اسما لحاوية HDF5 حيث يتم تخزين النتائج وتنفيذها.
وأخيرا تنفيذ الخلية C.4 لإجراء تحليل الانتشار. في الخلية C.5 أدخل التباين مع معلمات خط معايرة الكتلة ، مما يعني تحديد الميل والإزاحة باستخدام عينات من الكتلة المعروفة وتنفيذها لتحويل جميع تباينات الجسيمات إلى الكتلة الجزيئية. تقييم كثافة الجسيمات الظاهرة على الغشاء عن طريق تنفيذ الخلية C.6 ، والتي ترجع قيمة الكثافة المتوسطة من حيث الجسيمات المكتشفة والمسارات الحالية خلال كل إطار كأعمدة إضافية في إطار البيانات.
لإنشاء المخطط النهائي لارتباط الكتلة ومعامل الانتشار، قم بتنفيذ الخلية D.1 لتحميل مطالبة ملف وتحديد ملف HDF5 الذي يحتوي على نتائج MSPT، ثم حدد إما مجموعة البيانات من فيديو واحد لرسمها في الخلية D.2 أو قم بدمج البيانات من مقاطع فيديو متعددة في إطار بيانات واحد عن طريق تنفيذ الخلية D.3. في هذا المثال، نظرا لأن جميع مقاطع الفيديو عبارة عن نسخ متماثلة من عينات متطابقة، يتم تجميع مجموعة البيانات. أخيرا ، ارسم كثافة النواة ثنائية الأبعاد عن طريق تنفيذ الخلية D.4.
إذا كنت راضيا، حدد موقعا لحفظ المخطط في ملف PDF في الخلية D.5 وتنفيذه. تظهر هنا صور تمثيلية لخشونة سطح شريحة الغطاء الزجاجي أثناء تكوين طبقة ثنائية الدهون المدعومة ، مع طبقة ثنائية دهنية مدعومة سليمة ، وللبروتينات المثالية المعاد تشكيلها على SLB. يتم عرض جميع الأمثلة الأربعة في الوضع الأصلي ، والذي يمكن الوصول إليه أثناء القياس نفسه ، وكصور قياس النسبة المعالجة بعد إزالة الخلفية المستندة إلى الوسيط.
يمكن تحقيق المعايرة التي تترجم التباين إلى كتلة جزيئية عن طريق ربط الجزيئات الحيوية ذات الكتلة المعروفة ب SLB عبر مركب البيوتين-ستربتافيدين-البيوتين. كاستراتيجية مثالية ، يمكن للمرء استخدام المتغيرات البيوتينيل من ألبومين مصل البقر ، والبروتين A ، والفوسفاتيز القلوي ، والفيبرونيكتين التي ترتبط بالستربتافيدين الذي يرتبط في حد ذاته بالدهون المحتوية على البيوتين في الغشاء. يعكس التباين الواضح بشكل متزايد لهذه الجزيئات الكبيرة النموذجية الوزن الجزيئي المتزايد لمعايير البيوتينيل المعنية.
من خلال تعيين كل ذروة من الرسوم البيانية للتباين إلى الكتلة المقابلة لحالة oligomer للبروتين القياسي ، يتم الكشف عن علاقة خطية بين التباين والكتلة ويمكن استخدامها لاحقا لتحليل أنظمة الجزيئات الكبيرة غير المعروفة. تظهر هنا تقديرات كثافة النواة 2D لكل من الكتلة ومعامل الانتشار للستربتافيدين رباعي التكافؤ في مجمع مع ألدولاز البيوتينيل أو مع جسم مضاد للماعز معدل بالبيوتين مضاد للأرانب IgG. تظهر الصور التمثيلية مقارنة بين كتل الأوليغومر المحددة لمركب الستربتافيدين رباعي التكافؤ مع الألدولاز المعدل بالبيوتين أو IgG والأوزان الجزيئية المتوقعة.
باستخدام MSPT ، يمكننا تتبع الجزيئات الحيوية مباشرة على الأغشية الدهنية ، وتحديد الكتلة التي لديها ، وكيف تتحرك ، وكيف تتفاعل. أنا واثق من أن هذه التقنية ستحول فهمنا للعمليات البيولوجية على الأغشية ومعها.
