A importância do protocolo depende da redução de erros humanos e contaminação por microbiologia. Além disso, responsável por produzir milhares de esferoides para abordagens de bioimpressão 3D. A principal vantagem deste assunto, porém, é que ele otimize o horário de trabalho.
Os parâmetros de software são cruciais porque podem influenciar a qualidade final dos esferoides. E o melhor conselho seria realizar testes apenas com mídia de cultura celular. A demonstração visual deste método é crítica porque é um antigo método tradicional de cultura celular 3D baseado no Begin, colhendo a suspensão das células-tronco com uma pipeta sorológica de 10 mililitros e transferindo-a para um tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Em seguida, centrífuga a 400 RCF por 5 minutos para obter a pelota ASC. Resuspende a pelota de célula usando DMEM-Low contendo 10% de FBS. Após a realização da contagem de células, tome ASCs em tubos de centrífugas separados de 15 mililitros para semear as 81 e 256 recessões micromoedas com hidrogel não aderente.
Consulte o manuscrito do texto para obter detalhes do número de células utilizadas. Adicione 500 microliters de solução de agarose 2% ultra pura estéril no centro de um molde de silicone contendo 81 ou 256 recessos circulares. Após 40 minutos, desenforme a agarose ultra pura do molde de silicone e coloque-a em um poço de uma placa de plástico de 12 poços.
Adicione dois mililitros de DMEM-Low no poço com a ágarose micromoldada e incubar a 37 graus Celsius com 5% de suprimento de dióxido de carbono atmosférico por pelo menos 12 horas antes de semear os ASCs. Certifique-se de que o fluxo laminar está ligado e que o fluxo de ar do gabinete esteja funcionando corretamente. Confirme se o equipamento está conectado à tensão correta e o tablet está conectado ao equipamento.
Verifique se a altura do vidro de proteção do armário está no mesmo nível da marcação do sensor do equipamento. Pressione o botão liga ou desarme no lado esquerdo do equipamento. Então, espere o tablet e o equipamento começarem.
Posicione as caixas de ponta, o rack para tubos de centrífugas e a placa contendo o hidrogel de agarose micromoldado no espaço de trabalho do equipamento. No software aberto no tablet, clique em LabWare Editor. Configure uma mesa de trabalho virtual e escolha as posições das pipetas, caixas de ponta, o rack para os tubos de plástico e as placas.
Clique no botão mudar para procedimento"botão para incluir todos os parâmetros e comandos realizados pelo equipamento durante todo o experimento. Aguarde uma barra de ferramentas e uma lista de procedimentos para abrir no software. Inicialmente, para indicar os comandos, incorpore o número de amostras a serem pipetadas e arraste-as para a lista de procedimentos.
Em seguida, clique no botão de comando de transferência de reagente no software para transferir a suspensão ASC para os poços da placa de 12 poços contendo os micro moldes e arraste-o para a lista de procedimentos. Clique em propriedades "para configurar as posições de inicial e final para o equipamento transferir a amostra. Aguarde que o software retorne à página Tabela de Trabalho.
Configure os parâmetros para semeadura automatizada das ASCs conforme descrito no manuscrito do texto. Selecione a água como o tipo líquido padrão. Clique no botão opções"para configurar os parâmetros para criar uma suspensão homogênea dos ASCs conforme descrito no manuscrito do texto.
Clique no botão com um símbolo de verificação na barra superior do software para garantir que não haja erro de programação. Clique no botão play"na barra superior do software para iniciar o programa. Que o equipamento comece como programado.
E espere que ele faça um som indicando que terminou. Colete a placa de 12 poços e incuba-a a 37 graus Celsius com um suprimento de dióxido de carbono 5% atmosférico por pelo menos 18 horas, para permitir a formação de esferoides completos e compactos. Colher manualmente os esferoides após um, três e sete dias de cultura para análise.
Lave o meio com uma micro pipeta para liberar os esferoides do hidrogel agarose micromolded não aderente. Colete os esferoides manualmente usando uma micro pipeta e transfira-os para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Um total de 85 e 160 esferoides foram medidos a partir de hidrogéis micromoedos não adesivos com 81 e 256 recessões circulares, respectivamente.
O sistema de pipeta automática semeou a suspensão da célula ASC em 12 poços de uma única placa de 12 poços em 15 minutos. Utilizando o hidrogel não aderente de 81 micromoldados, produziu 972 esferoides neste estudo. Enquanto o hidrogel não aderente de 256 micromoldados, produziu 3072 esferoides.
Os spheróides ASC foram analisados para a homogeneidade de seu tamanho e forma. Os esteroides ASC de micro moldes com 81 recessões apresentaram diâmetro homogêneo durante o período de cultura. Em contraste com os esteroides ASC de micro moldes com 256 recessões, a menor e maior proporção de diâmetros foi próxima de uma em esferoides ASC de micro moldes com 81 e 256 recessões.
A viabilidade, a morfologia e as análises de força forneceram evidências para a produção bem sucedida e em larga escala de esferoides ASC. O maior caso é garantir que o problema foi resolvido abruptamente sem erros.
