L’importance du protocole repose sur la réduction des erreurs humaines et de la contamination microbiologique. En outre, responsable de produire des milliers de sphéroïdes pour les approches de bio-impression 3D. Le principal avantage de cette question, cependant, est qu’il est optimisé les heures de travail.
Les paramètres logiciels sont cruciaux car ils peuvent influencer la qualité finale des sphéroïdes. Et le meilleur conseil serait d’effectuer des tests uniquement avec des milieux de culture cellulaire. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car il s’agit d’une ancienne méthode traditionnelle de culture cellulaire 3D basée sur Begin en récoltant la suspension de cellules souches avec une pipette sérologique de 10 millilitres et en la transférant dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres.
Ensuite, centrifugez à 400 RCF pendant 5 minutes pour obtenir la pastille ASC. Remettez en suspension la pastille de cellule en utilisant DMEM-Low contenant 10% FBS. Après avoir effectué le comptage cellulaire, prenez les ASC dans des tubes centrifuges séparés de 15 millilitres pour ensemencer les récessions 81 et 256 micromoulées avec de l’hydrogel non adhérent.
Reportez-vous au manuscrit textuel pour plus de détails sur le nombre de cellules utilisées. Ajouter 500 microlitres de solution stérile d’agarose ultra pure à 2% au centre d’un moule en silicone contenant 81 ou 256 renfoncements circulaires. Après 40 minutes, démoulez l’agarose ultra pure du moule en silicone et placez-la dans un puits d’une plaque en plastique à 12 puits.
Ajouter deux millilitres de DMEM-Low dans le puits avec l’agarose micromoulée et incuber à 37 degrés Celsius avec un apport en dioxyde de carbone atmosphérique de 5% pendant au moins 12 heures avant d’ensemencer les ASC. Assurez-vous que le flux laminaire est activé et que le flux d’air de l’armoire fonctionne correctement. Vérifiez que l’équipement est connecté à la tension correcte et que la tablette est connectée à l’équipement.
Vérifiez si la hauteur du verre de protection de l’armoire est au même niveau que le marquage du capteur de l’équipement. Appuyez sur le bouton marche ou arrêt sur le côté gauche de l’équipement. Ensuite, attendez que la tablette et l’équipement démarrent.
Placez les boîtes de pointe, le rack pour les tubes centrifuges et la plaque contenant l’hydrogel d’agarose micromoulé dans l’espace de travail de l’équipement. Dans le logiciel ouvert sur la tablette, cliquez sur LabWare Editor. Installez une table de travail virtuelle et choisissez les positions des pipettes, des boîtes à embouts, du rack pour les tubes en plastique et des plaques.
Cliquez sur le bouton « passer à la procédure » pour inclure tous les paramètres et commandes effectués par l’équipement tout au long de l’expérience. Attendez qu’une barre d’outils et une liste de procédures s’ouvrent dans le logiciel. Initialement, pour indiquer les commandes, incorporez le nombre d’échantillons à pipeter et faites-le glisser vers la liste des procédures.
Ensuite, cliquez sur le bouton de commande transfert de réactif sur le logiciel pour transférer la suspension ASC vers les puits de la plaque de 12 puits contenant les micro-moules et faites-la glisser vers la liste des procédures. Cliquez sur propriétés pour configurer les positions de début et de fin de l’équipement pour transférer l’échantillon. Attendez que le logiciel revienne à la page Table de travail.
Configurez les paramètres d’ensemencement automatisé des ASC comme décrit dans le manuscrit textuel. Sélectionnez l’eau comme type de liquide standard. Cliquez sur le bouton options pour configurer les paramètres afin de créer une suspension homogène des ASC comme décrit dans le manuscrit textuel.
Cliquez sur le bouton avec un symbole de coche sur la barre supérieure du logiciel pour vous assurer qu’il n’y a pas d’erreur de programmation. Cliquez sur le bouton de lecture dans la barre supérieure du logiciel pour démarrer le programme. Laissez l’équipement démarrer comme prévu.
Et attendez qu’il fasse un son indiquant qu’il a terminé. Collectez la plaque de 12 puits puis incubez-la à 37 degrés Celsius avec un apport en dioxyde de carbone atmosphérique de 5% pendant au moins 18 heures, pour permettre la formation de sphéroïdes complets et compacts. Récoltez manuellement les sphéroïdes après un, trois et sept jours de culture pour analyse.
Rincez le milieu avec une micro pipette pour libérer les sphéroïdes de l’hydrogel d’agarose micromoulé non adhérent. Collectez les sphéroïdes manuellement à l’aide d’une micro pipette et transférez-les dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Au total, 85 et 160 sphéroïdes ont été mesurés à partir d’hydrogels non adhésifs micromoulés avec respectivement 81 et 256 récessions circulaires.
Le système de pipette automatique a ensemencé la suspension de la cellule ASC dans 12 puits d’une seule plaque de 12 puits en 15 minutes. En utilisant les 81 hydrogels micromoulés non adhérents, produit 972 sphéroïdes dans cette étude. Alors que les 256 hydrogels micromoulés non adhérents, ont produit 3072 sphéroïdes.
Les sphéroïdes ASC ont été analysés pour l’homogénéité de leur taille et de leur forme. Les stéroïdes ASC provenant de micro-moules avec 81 récessions ont montré un diamètre homogène pendant la période de culture. Contrairement aux stéroïdes ASC provenant de micro-moules avec 256 récessions, le ratio de diamètres le plus petit et le plus grand était proche de un dans les sphéroïdes ASC de micro-moules avec 81 et 256 récessions.
Les analyses de viabilité, de morphologie et de force ont fourni des preuves de la production réussie à grande échelle de sphéroïdes ASC. La plupart des cas est de s’assurer que le problème a été résolu brusquement sans erreurs.
