Este método nos permitirá avaliar o papel da cavidade pericárdica que envolve o coração e seu conteúdo no reparo cardíaco após o infarto do miocárdio. Em comparação com os métodos convencionais de ligadura coronariana para modelagem do infarto do miocárdio, nosso método mantém uma cavidade pericárdica intacta, permitindo a determinação do conteúdo e rastreia seus papéis após a lesão isquêmica cardíaca. Compreender a contribuição da cavidade pericárdica e a resposta à lesão do coração fornecerá informações importantes sobre estratégias terapêuticas que visam o pericárdio para melhorar a cicatrização do coração.
Para começar com a pós-anestesia, restrinja as patas do rato e posicione-o sobre a mesa cirúrgica. Depois de preparar o rato para a cirurgia, conforme descrito no manuscrito, ventilar o rato com 2%isoflurano e 100% de oxigénio como gás transportador utilizando um ventilador comercial. Em seguida, defina uma taxa de 110 respirações por minuto, um volume corrente de 250 microlitros e uma pressão expiratória final positiva de quatro milímetros de mercúrio.
Role o mouse 30% em seu lado direito para posicionar o lado esquerdo do peito para a cirurgia. Em seguida, faça uma incisão lateral de dois a três centímetros na pele do peito para visualizar os músculos peitorais do lado esquerdo. Faça uma incisão de um centímetro da linha média para fora para cortar o peitoral maior e menor.
Evite sangramento excessivo durante toda a cauterização dos vasos sangrando. Visualize os músculos intercostais entre a terceira e a quarta costelas. Faça uma incisão de dois centímetros no músculo intercostal esquerdo para introduzir ar na cavidade torácica e permitir que o coração e os pulmões caiam para longe da incisão.
Para incidir o intercostal sem sangramento, pare temporariamente o ventilador e expanda a abertura usando um dispositivo de cauterização. Usando afastadores, retraia as costelas para expor o coração. Em seguida, observe o pericárdio e o coração subjacente sob um microscópio estéreo.
Coloque suavemente a pinça na superfície do pericárdio para reduzir o pericárdio e o movimento cardíaco subjacente. Marcar visualmente a artéria coronária LAD traçando sua emergência sob o apêndice esquerdo. Usando o driver de microagulha, guie uma sutura apropriada através do pericárdio sob o LAD.
Observe a sutura emergindo do outro lado do LAD e do pericárdio. Representando o modelo de ligadura permanente, amarre a sutura para restringir o fluxo sanguíneo através da artéria coronária, tornando visível o branqueamento da porção anterior do ventrículo esquerdo. Em seguida, corte o excesso de sutura com a ajuda de uma tesoura.
Fornecer injeções de manutenção de analgésico por via subcutânea a cada 12 horas por 72 horas após a cirurgia. Depois de reduzir o isoflurano para 1%, desligue o isoflurano, mantendo a ventilação com oxigênio. Uma vez que o animal mostre sinais de respiração, remova o tubo traqueal de calibre 23 da boca e coloque o rato em uma gaiola de recuperação para monitorar a retomada da respiração.
Permita que o rato recupere na gaiola com uma parte da gaiola colocada numa almofada de aquecimento para fornecer uma fonte de calor externa. Monitore o estado de saúde do rato diariamente durante sete dias, avaliando as incisões e o desconforto animal. Se necessário, administrar antibióticos para uma recuperação bem-sucedida após a cirurgia invasiva.
Depois de manter o rato sob anestesia geral com oxigênio, coloque-o em decúbito dorsal em uma plataforma de palco aquecida e prenda as patas aos eletrodos de ECG. Em seguida, rasgue o peito. Adquira imagens de ECG usando sonda transdutora e gel de contato e analise com o software apropriado.
Após a avaliação não invasiva do ECG, desligue o isoflurano e devolva o rato à gaiola. Fixe o coração em formalina a 10% por pelo menos 24 horas. Corte a amostra usando uma lâmina de barbear reta através do ventrículo direito, septo interventricular e ventrículo esquerdo, garantindo que a incisão passe pelo centro da zona do infarto.
E, em seguida, a parafina incorpora as amostras de tecido. As seções cortadas são então colocadas em de montagem para posterior incorporação de parafina e subsequente seccionamento em seções de cinco micrômetros de espessura. Após a colocação de seções de tecido em lâminas, desparafinizar usando tolueno e lavagens de álcool graduadas com água deionizada.
Em seguida, reidrate. Em seguida, marque a seção com 0,1% de vermelho sirius em ácido pícrico por duas horas à temperatura ambiente. Lavar a secção com ácido acético a 0,5% durante três minutos, seguido de enxaguar com etanol a 70% durante um minuto.
Desidratar a seção usando a ordem inversa das lavagens com concentrações crescentes e graduadas de etanol antes da montagem para avaliação microscópica. A indução bem-sucedida do infarto do miocárdio com a ligadura coronariana modificada foi avaliada examinando-se os parâmetros funcionais e as características estruturais do coração. Para a função, a fração de ejeção diminuída do ventrículo esquerdo foi avaliada por ecocardiografia dentro de três a quatro semanas após o infarto do miocárdio.
A coloração histológica demonstrou que as alterações funcionais foram acompanhadas de fibrose significativa da parede do ventrículo esquerdo, o que foi confirmado pela quantificação da fibrose corada em vermelho picrosirius nos cortes transversais do coração quatro semanas após o infarto com os modelos de ligadura coronariana pericárdica interrompida ou intacta. A combinação do método de marcação de esferas fluorescentes com a análise de citometria de fluxo forneceu uma abordagem para rastrear os macrófagos pericárdicos positivos para Gata6 residentes. É importante ressaltar que pouca ou nenhuma rotulagem foi detectada no coração ou no sangue.
Após o infarto do miocárdio, a realocação das células pode ser rastreada por citometria de fluxo e imagem. A quantificação das células mieloides pericárdicas marcadas com esferas fluorescentes com ou sem infarto do miocárdio é mostrada. É necessário cuidado para evitar inadvertidamente interromper ou rasgar o pericárdio fino durante o procedimento.
Este método pode ser combinado com o rastreamento de linhagem do bloqueio celular ou efetor, o que permitirá rastrear e determinar o impacto do componente pericárdico na resposta de cicatrização no coração infartado. Identificamos que a cavidade pericárdica protege o coração após a lesão, que é parcialmente mediada por macrófagos pericárdicos residentes. Esta abordagem abre uma nova área de pesquisa para doenças cardiovasculares.
