O isolamento das principais populações progenitoras de Megacaitos, permite a análise fina da hierarquia de linhagem na cultura celular em ensaios moleculares, até o nível celular único. Este protocolo combina uma prática mais ética, minimizando o número de animais necessários, em um processo eficiente para a triagem celular das populações de MEP e MKP. Para osso, a coleta pulveriza o corpo de um rato C57 preto C57 de oito a 12 semanas, com 70% de etanol.
Use uma tesoura para fazer uma incisão de cinco a um centímetro da pele, perpendicular à coluna. E rasgar a pele ao redor de todo o corpo, puxando-a para baixo. Coloque o mouse de frente para baixo na almofada de dissecção e localize os ossos pélvicos deslizando dedos ou tesouras, ao longo da coluna exposta, de cima a baixo.
Para localizar a crista ilíaca, identifique a pequena colisão na região lombar perto dos membros traseiros. Depois de colocar a tesoura paralela à coluna vertebral, contra as vértebras, e perto da colisão da crista ilíaca, proceda ao corte dos músculos ao longo da lateral da coluna acima do osso pélvico, deslizando a tesoura ao longo das vértebras, até a cauda. Em seguida, corte entre as vértebras e a crista ilíaca, ficando o mais perto possível das vértebras.
E corte os músculos restantes para separar o membro do corpo. Transfira os membros separados para uma superfície limpa. Depois de descartar o resto do corpo em conformidade com as diretrizes institucionais, use fórceps e bisturis para expor os ossos pélvicos, femorais e tibiais, removendo tecido circundante.
Use fórceps para segurar a extremidade distal do fêmur, e deslocar cuidadosamente a cabeça femoral do osso pélvico, cortando suavemente os músculos ao redor da articulação com um bisturi. Raspe o músculo restante do osso pélvico, e corte no meio da cavidade que segurou a cabeça femoral. Mantenha o ípio e descarte o lado fino triangular do osso.
Usando um bisturi, remova os tecidos residuais ao redor do ílio, e coloque o osso limpo em PBS estéril complementado com soro de bezerro recém-nascido de 2%. Em seguida, use uma tesoura para cortar o pé da perna no tornozelo. Segurando a parte inferior da tíbia com os fórceps, raspe o músculo em direção ao joelho.
Descarte a fíbula. Em seguida, faça um corte através do planalto tibial com o bisturi, e coloque a tíbia em PBS estéril 2%NBCS. Depois de remover os tecidos residuais ao redor do fêmur, segure a parte superior do fêmur com fórceps, e coloque a lâmina do bisturi na base da rótula.
Aplique uma força em direção à rótula, paralelamente ao fêmur para desprender a rótula. Em seguida, coloque o fêmur, em PBS estéril 2%NBCS. Em um armário de fluxo laminar, transfira os ossos para uma placa de Petri estéril cheia de PBS estéril 2%NBCS.
Use um bisturi para cortar a cabeça dos fêmures. Encha uma seringa de um mililitro com PBS 2% NBCS estéril, e conecte uma agulha calibre 21, à tomada. Em seguida, encha um tubo de polipropileno de cinco mililitros com dois mililitros de PBS estéril 2%NBCS.
Segurando o fêmur com fórceps, insira a agulha na ranhura esquerda, após a remoção da rótula, aplicando rotação, garantindo que a agulha esteja completamente inserida no osso, até o bisel. Após a inserção da agulha, transfira o osso com a agulha para o tubo contendo dois mililitros de PBS 2%NBCS. Em seguida, dispense e aspire o PBS 2%NBCS, da seringa até que o osso esteja limpo.
Retire a agulha do fêmur e insira-a no orifício do lado oposto, onde estava a cabeça do fêmur. Depois de dispensar e aspirar o tampão, descarte o osso. Para a crista ilíaca e a tíbia, use fórceps para segurar o osso e insira delicadamente a agulha no lado aberto, aplicando rotação.
Assegurando que a agulha esteja completamente inserida no osso, até o bisel. Em seguida, transfira o osso com a agulha para o tubo contendo dois mililitros de PBS 2%NBCS. Dispense e aspire o PBS 2% NBCS da seringa até que o osso esteja limpo.
Passe toda a suspensão celular através de uma tampa de coador de células de 40 mícrons, colocada em um tubo de poliestireno de cinco mililitros estéril, e adicione 500 microliters de PBS 2%NBCS. Reserve 100 microlitres da suspensão celular como medula óssea total. Em seguida, armazene-o no gelo para o procedimento de coloração.
Pelota a suspensão filtrada por centrifugação. Depois de descartar o supernaspe, resuspenque a pelota em um coquetel de anticorpos primários recém-preparado, com a incubação no gelo, por 30 a 45 minutos. Reserve 10 microliters da suspensão celular em um tubo de poliestireno de cinco mililitros estéreis, rotulado fração de poros lin, e adicione 90 microliters de PBS 2%NBCS.
Enquanto isso, prepare uma conta para esgotamento magnético, ressusundo-as no frasco, com vórtice completo por 30 segundos. Transfira um volume de contas correspondente a duas contas por célula alvo, em um tubo de polipropileno de cinco mililitros, e lave as contas duas vezes, com PBS 2%NBCS, colocando tubo no ímã. Depois de remover o tampão de lavagem com uma pipeta de pasteur de vidro estéril, resuspenque as contas em 500 microliters de PBS estéril 2%NBCS.
Para o primeiro passo de esgotamento magnético, adicione 250 microliters de contas na pelota de células lavadas, e incubar com mistura suave por cinco minutos no gelo. Em seguida, adicione dois mililitros de PBS 2%NBCS estéreis, com mistura suave, e coloque o tubo no ímã por dois minutos. Prossiga para coletar a fração não magnética com uma pipeta de pasta de vidro estéril.
E para o segundo passo do esgotamento magnético, adicione-o aos 250 microliters restantes de contas magnéticas. Coloque o tubo selado com parafina em um rolo de tubo, por 20 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione dois mililitros de PBS 2%NBCS estéreis com mistura suave.
E coloque o tubo com o ímã por dois minutos. Colete a fração não magnética em um tubo de polipropileno de cinco mililitros estéreis, rotulado, não magnético Fração Lin Neg, com uma pipeta de pastreur de vidro estéril, e prossiga com progenitores de megacariócitos de triagem celular, como descrito no manuscrito do texto. Para a estratégia de gating para classificação celular, na população de Lin Neg, são selecionadas as células que expressam c-kit, e uma expressão baixa ou nenhuma de antígeno Sca-1 ou CD16/32.
Nessa população, o MEP é identificado como células cd150 positivas e CD9 dim. O MKP como CD150 positivo, e células brilhantes CD9. Na análise representativa da Citometria de Fluxo, as células identificadas como MPE e Mkp, foram rotuladas com anticorpos conjugados de fluorescência para CD41a, e marcadores clássicos CD42c, das linhagens megacariocíticas e plaquetas.
Ambos os marcadores foram expressos pelas células da população de MKp, e não foram detectados na superfície das células da população do MEP. O conteúdo de DNA dos megacaiócitos classificados, demonstrou que as células são em sua maioria 2n para a população do MEP. E uma pequena parte das células MKp são estrangeiras.
Células ploidy mais elevadas não foram significativamente detectadas nessas populações. Em ensaios clonogênicos semissólidos, a CFU-MK foi detectada em populações de MEP e MKp. O BFU-E não foi detectado na população de MKp, mas detectado no MEP e, na população de células progenitoras CD150 negativas CD9 dim.
A observação microscópica no terceiro dia de diferenciação, mostra que o MEP e o MKp produziram principalmente megacaiócitos, identificados como células grandes. Os megacariócitos obtidos após três dias de cultura, foram identificados por meio da expressão CD41 e CD42c, representando 54, e 82% das células produzidas a partir de populações de células MEP e MKp, respectivamente. A ploidia dos megacaitos produzidos, foi maior a partir do megacaito derivado da população MKp, comparando-o com a população do MPE.
Apenas as células derivadas da população de MKp, eram capazes de emissão de proplatelet, sugerindo um estágio de maturação mais avançado para a população de MKp. O uso do osso pélvico aumenta drasticamente para o número de células, enquanto o esgotamento magnético de duas etapas melhora a eficácia do esgotamento da linhagem. Este protocolo permite a cultura subsequente da população de células únicas e mep e MKp, que, juntamente com a análise transcriômica e proteômica, certamente terá de decifrar os mecanismos envolvidos, implementadas biogênese.
