L'isolamento delle principali popolazioni di Megakaryocyte Progenitor, consente l'analisi fine della gerarchia del lignaggio in coltura cellulare su saggi molecolari, fino al livello della singola cellula. Questo protocollo combina una pratica più etica riducendo al minimo il numero di animali richiesti, in un processo efficiente per lo smistamento cellulare delle popolazioni MEP e MKP. Per l'osso, la raccolta spruzza il corpo di un topo C57 black six di otto-12 settimane, con il 70% di etanolo.
Usa le forbici per fare un punto da cinque a un centimetro di incisione della pelle, perpendicolare alla colonna vertebrale. E strappare la pelle intorno a tutto il corpo, tirandola giù. Posizionare il mouse a faccia in giù sul pad di dissezione, quindi individuare le ossa pelviche facendo scorrere le dita o le forbici, lungo la colonna vertebrale esposta, dall'alto verso il basso.
Per localizzare la cresta iliaca, identificare la piccola protuberanza nella regione lombare vicino agli arti posteriori. Dopo aver posizionato le forbici parallele alla colonna vertebrale, contro le vertebre e vicino alla protuberanza della cresta iliaca, procedere a tagliare i muscoli lungo il lato della colonna vertebrale sopra l'osso pelvico, facendo scorrere le forbici lungo le vertebre, fino alla coda. Quindi tagliare tra le vertebre e la cresta iliaca, rimanendo il più vicino possibile alle vertebre.
E taglia i muscoli rimanenti per staccare l'arto dal corpo. Trasferire gli arti staccati su una superficie pulita. Dopo aver scartato il resto del corpo in conformità con le linee guida istituzionali, utilizzare pinci e bisturi per esporre le ossa pelviche, femorali e tibiali, rimuovendo il tessuto circostante.
Utilizzare una pinze per tenere l'estremità distale del femore e dislocare con cura la testa del femore dall'osso pelvico, affettando delicatamente i muscoli attorno all'articolazione con un bisturi. Raschiare via il muscolo rimanente dall'osso pelvico e tagliare nel mezzo della cavità che conteneva la testa del femore. Mantenere l'ileo e scartare il lato sottile triangolare dell'osso.
Utilizzando un bisturi, rimuovere i tessuti residui intorno all'ileo e posizionare l'osso pulito in PBS sterile integrato con siero di vitello appena nato al 2%. Quindi utilizzare le forbici per tagliare il piede dalla gamba alla caviglia. Tenendo la parte inferiore della tibia con la pinca, raschiare il muscolo verso il ginocchio.
Scartare il perone. Quindi fai un taglio attraverso il plateau tibiale con il bisturi e posiziona la tibia in PBS sterile 2% NBCS. Dopo aver rimosso i tessuti residui intorno al femore, tenere il lato superiore del femore con una pinze e posizionare la lama del bisturi alla base della rotula.
Applicare una forza verso la rotula, parallela al femore per staccare la rotula. Quindi posizionare il femore, in PBS sterile 2% NBCS. In un armadio a flusso laminare, trasferire le ossa in una capsula di Petri sterile riempita con PBS sterile 2% NBCS.
Usa un bisturi per tagliare la testa dei femori. Riempire una siringa da un millilitro con PBS sterile 2%NBCS e attaccare un ago calibro 21 all'uscita. Quindi riempire un tubo di polipropilene da cinque millilitri con due millilitri di PBS sterile 2% NBCS.
Tenendo il femore con una pinica, inserire l'ago nella scanalatura sinistra, dopo la rimozione della rotula applicando la rotazione, assicurandosi che l'ago sia completamente inserito nell'osso, fino alla smussatura. Dopo l'inserimento dell'ago, trasferire l'osso con l'ago nel tubo contenente due millilitri di PBS 2%NBCS. Quindi erogare e aspirare il PBS 2% NBCS, dalla siringa fino a quando l'osso è libero.
Rimuovere l'ago dal femore e inserirlo nel foro sul lato opposto, dove si trovava la testa del femore. Dopo aver erogato e aspirato il tampone, scartare l'osso. Per la cresta iliaca e la tibia, utilizzare una pinca per tenere l'osso e inserire delicatamente l'ago nel lato aperto, applicando la rotazione.
Assicurarsi che l'ago sia completamente inserito nell'osso, fino alla smussatura. Quindi trasferire l'osso con l'ago nel tubo contenente due millilitri di PBS 2% NBCS. Erogare e aspirare il PBS 2%NBCS dalla siringa fino a quando l'osso non è limpido.
Passare tutta la sospensione cellulare attraverso un tappo del filtro cellulare da 40 micron, posto su un tubo sterile di polistirene da cinque millilitri, e aggiungere 500 microlitri di PBS 2%NBCS. Mettere da parte 100 microlitri della sospensione cellulare come midollo osseo totale. Quindi conservarlo sul ghiaccio per la procedura di colorazione.
Pellet la sospensione filtrata per centrifugazione. Dopo aver scartato il surnatante, risusegitare il pellet in un cocktail di anticorpi primari appena preparato, con l'incubazione su ghiaccio, per 30-45 minuti. Mettere da parte 10 microlitri della sospensione cellulare in un tubo sterile di polistirene da cinque millilitri, etichettato Come frazione dei pori di Lin, e aggiungere 90 microlitri di PBS 2%NBCS.
Nel frattempo, preparare una perla per l'esaurimento magnetico, risosepolandole nella fiala, con un vortice completo per 30 secondi. Trasferire un volume di perline corrispondente a due perline per cella bersaglio, in un tubo di polipropilene da cinque millilitro, e lavare le perline due volte, con PBS 2%NBCS, posizionando il tubo sul magnete. Dopo aver rimosso il tampone di lavaggio con una pipetta sterile di pasta di vetro, rifondere le perle in 500 microlitri di PBS sterile 2%NBCS.
Per il primo passo dell'esaurimento magnetico, aggiungere 250 microlitri di perle sul pellet di cellule lavate e incubare con una miscelazione delicata per cinque minuti sul ghiaccio. Quindi aggiungere due millilitri di PBS sterile 2% NBCS, con una miscelazione delicata, e posizionare il tubo nel magnete per due minuti. Procedere alla raccolta della frazione non magnetica con una pipetta sterile di pasta di vetro.
E per la seconda fase di esaurimento magnetico, aggiungilo ai restanti 250 microlitri di pere magnetiche. Posizionare il tubo sigillato con paraffina su un rullo tubolare, per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi aggiungere due millilitri di PBS sterile 2% NBCS con una miscelazione delicata.
E posizionare il tubo con il magnete per due minuti. Raccogliere la frazione non magnetica in un tubo sterile di polipropilene da cinque millilitri, etichettato, frazione di Lin Neg non magnetica, con una pipetta di vetro sterile e procedere con la selezione cellulare dei megacariociti progenitori, come descritto nel manoscritto di testo. Per la strategia di gating per lo smistamento cellulare, nella popolazione di Lin Neg, vengono selezionate le cellule che esprimono C-kit e un'espressione bassa o nulla dell'antigene Sca-1 o CD16/32.
In questa popolazione, i MEP sono identificati come cellule CD150 positive e CD9 dim. L'MKP come CD150 positivo e le cellule luminose CD9. Nell'analisi rappresentativa della citometria a flusso, le cellule identificate come MEP e Mkp, sono state etichettate con anticorpi coniugati a fluorescenza per CD41a e marcatori classici CD42c delle linee megacariocitiche e piastriniche.
Entrambi i marcatori sono stati espressi dalle cellule della popolazione MKp e non sono stati rilevati sulla superficie delle cellule della popolazione MEP. Il contenuto di DNA dei megacariociti ordinati, ha dimostrato che le cellule sono per lo più 2n per la popolazione MEP. E una piccola parte delle celle MKp sono estranee.
Le cellule ploidiche più elevate non sono state rilevate in modo significativo in queste popolazioni. Nei saggi clonogenici semi-solidi, CFU-MK è stato rilevato sia nelle popolazioni MEP che MKp. BFU-E non è stato rilevato nella popolazione MKp, ma rilevato in MEP e, la popolazione di cellule progenitrici CD9 dim negative CD150.
L'osservazione microscopica il terzo giorno di differenziazione, mostra che MEP e MKp hanno prodotto principalmente megacariociti, identificati come cellule di grandi dimensioni. I megacariociti ottenuti dopo tre giorni di coltura, sono stati identificati utilizzando l'espressione CD41 e CD42c e rappresentano rispettivamente il 54% e l'82% delle cellule prodotte da popolazioni cellulari MEP e MKp. La ploidia dei megacariociti prodotti, era maggiore dal megacariocita derivato dalla popolazione MKp, rispetto alla popolazione MEP.
Solo le cellule derivate dalla popolazione MKp, erano in grado di emissione di proplatelet, suggerendo uno stadio di maturazione più avanzato per la popolazione MKp. L'uso dell'osso pelvico, aumenta drasticamente al numero di cellule, mentre l'esaurimento magnetico in due fasi migliora l'efficacia dell'esaurimento del lignaggio. Questo protocollo consente la successiva coltura di popolazioni MEP e MKp di singole cellule, che, insieme all'analisi trascrittomica e proteomica, dovranno certamente decifrare i meccanismi coinvolti, implementati biogenesi.
