Name: the sleep nullifying apparatus: a highly efficient method of sleep depriving drosophila
Uploaded: 2020-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
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Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH 5R01NS051305-14 e 5R01NS076980-08 para PJS.

1. Preparação experimental
<ol><li>Recolher moscas enquanto se fecham em frascos, separando moscas machos e fêmeas. NOTA: Experimentos de sono são comumente realizados com moscas fêmeas. É importante coletar fêmeas virgens. Fêmeas acasaladas colocarão ovos que eclodem em larvas complicando a análise dos dados.</li>
	<li>House voa de um único sexo em grupos de <20. NOTA: A habitação voa em um ambiente socialmente enriquecido (grupos de >50) modula a unidade de sono6,13 medidas potencialmente confusas do sono rebote. Além disso, após o enriquecimento social, o sono diminuirá ao longo de alguns dias6. Assim, o sono de linha de base não é uma análise estável complicando o sono de recuperação. Manter moscas em grupos de <20 evita essa confusão potencial.</li>
	<li>Mantenha moscas em frascos por 3-5 dias em um ambiente controlado por luz e umidade. NOTA: A idade e a maturidade das moscas influenciam fortemente o sono. O sono é alto em moscas de um dia de idade e estabiliza em 3-5 dias de idade4. As moscas são normalmente mantidas em uma luz de 12 h: horário escuro de 12h a 50% de umidade.</li>
</ol>2. Preparação de tubos para gravação de sono
NOTA: O sono é monitorado usando monitores de atividade locomotor. Um monitor pode conter 32 moscas alojadas individualmente em tubos de 5 mm de diâmetro. Normalmente, genótipos são analisados em grupos de 16 ou 32 moscas.
<ol><li>Prepare um número apropriado de tubos com comida de mosca em uma extremidade. NOTA: A dieta e o metabolismo são conhecidos por influenciar o sono33,34, por isso é particularmente importante colocar moscas no mesmo alimento em que foram criadas.</li>
	<li>Sele a extremidade dos tubos com cera. NOTA: A privação e a recuperação do sono são um experimento de cinco dias, e a comida pode secar se não estiver devidamente selada. Em tubos devidamente selados, os alimentos podem ser mantidos por 10 dias ou mais. Assim, é fundamental garantir que as extremidades dos tubos estejam bem seladas. As moscas também podem ficar presas à comida molhada, no entanto. Assim, ajuda a fazer tubos 1-2 dias antes do início do experimento.</li>
	<li>Coloque individualmente o despertar, comportando-se voa em tubos de vidro de 65 mm de comprimento para gravação de sono usando um aspirador e tampe a extremidade dos tubos com uma rolha de espuma. NOTA: As moscas nunca são reassentadas à anestesia de CO2 ao colocar moscas em tubos para gravação de sono. O aspirador é feito de tubo de borracha com uma extremidade coberta com pano de queijo e inserida em uma ponta de pipeta de 1 mL.</li>
</ol>3. Gravar o sono
<ol><li>Carregue moscas em tubos em monitores de atividade para monitorar o sono. NOTA: As rochas SNAP monitoram para frente e para trás de -60° a +60° a cada ~10 s. Os monitores são mantidos em -60° para ~5.9s ; é preciso ~2,9 s para que a bandeja que segura os monitores se mova de -60° para +60° e ~1 s para voltar de +60° para -60°. O comprimento do ciclo pode ser alterado conforme necessário, ajustando a tensão fornecida ao motor.<ol>
<li>Tome cuidado para garantir que os tubos sejam colocados em monitores de atividade na orientação correta. Na orientação correta, a extremidade do tubo com alimentos está no topo do SNAP para garantir que as moscas não são empurradas para dentro da comida. Além disso, o fim com a comida fica na lateral do monitor com o jack de gravação de sono. Isso permite que os monitores de atividade sejam orientados corretamente no SNAP para uma privação eficiente do sono, monitorando simultaneamente a atividade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque monitores de atividade na câmara de gravação para monitorar o sono.</li>
	<li>Monitore o sono por pelo menos dois dias completos para estimar o sono da linha de base. NOTA: O dia em que as moscas são carregadas em monitores de atividade é tipicamente excluída como um dia de adaptação para permitir que as moscas se adaptem a serem alojadas em tubos. O sono da linha de base é registrado por pelo menos dois dias completos (48hrs) começando com a manhã seguinte ao dia em que as moscas são carregadas.</li>
	<li>Salve a carga de atividade locomotor de moscas em caixas de 1 min desde o momento das luzes em um determinado dia até as luzes no dia anterior usando o software de gravação de atividades (por exemplo, das 8:00 às 8:00).</li>
	<li>Estimar o sono dos dados de atividade locomotor com macros personalizadas usando 5 min de inatividade como limiar para um ataque de sono35. NOTA: Uma série de métricas de sono são calculadas a partir da contagem de atividades locomotor. Estes incluem sono em min/h acima de 24 h, tempo total de sono em 24h, média e máximo de sono diurno e noturnocomprimentos 36.</li>
</ol>4. Privação e recuperação do sono
<ol><li>Como as moscas podem ser privadas de sono por períodos variáveis de tempo (por exemplo, 12h, 24 h e 36 h) e o sono de recuperação também pode ser avaliado em vários intervalos (por exemplo, 6h, 12h, 24 h e 48 h), determinar a duração da recuperação por necessidade experimental. A recuperação do sono pode ser visualizada usando um gráfico de ganho/perda de sono ou examinando por cento de sono recuperado em um intervalo predeterminado (por exemplo, 6 h).</li>
	<li>Se o sono estiver estável ao longo dos dois dias de linha de base, no terceiro dia, coloque monitores de atividade no SNAP para privação de sono durante a noite. NOTA: As moscas exibirão um forte rebote de sono sobre uma faixa de vezes de sono8,32,37,38, mas o sono tem que ser estável para avaliar de forma confiável o sono rebote. O sono é estável quando a diferença de sono entre os dias de base é de ± 100 min.</li>
	<li>Certifique-se de que os monitores de atividade estejam protegidos no lugar com pinos do suporte do monitor, cabos de monitor conectados e monitores orientados corretamente com a extremidade com alimentos na parte de trás e barreiras plásticas na frente(Figura 1). NOTA: O SNAP é projetado para que a câmera gire uma vez a cada 10 s(Figura 1). A inserção plástica reinicia os tubos empurrando os tubos para trás quando o aparelho está na posição "para cima". A redefinição dos tubos é importante para garantir que todos os tubos tenham toda a amplitude de movimento no início de cada ciclo.</li>
	<li>Desconecte os monitores de atividade e tire os monitores do SNAP imediatamente após as luzes acesas após a privação de sono durante a noite. NOTA: É fundamental que a privação do sono seja encerrada, e as moscas são colocadas em recuperação imediatamente após as luzes acesas após 12h de privação do sono durante a noite. Mesmo um atraso de 20-30 minutos na colocação de moscas na recuperação pode interferir na extensão do sono de recuperação.</li>
	<li>O local voa em uma câmara de gravação onde eles ficarão imperturbáveis por dois dias (48 h) para monitorar o sono de recuperação. NOTA: Se a câmara de gravação estiver sendo usada para outros experimentos, deve-se tomar cuidado extra para evitar estimular a recuperação de moscas.</li>
	<li>Calcule a quantidade de sono perdida. Para cada mosca individual, calcule a diferença horária entre o sono obtido durante a privação do sono e a hora correspondente durante a linha de base; somam as diferenças horárias para calcular o sono total perdido.</li>
	<li>Calcule a quantidade de sono recuperada. Para cada mosca individual, calcule a diferença horária entre o sono obtido durante a recuperação e a hora correspondente durante a linha de base; somam as diferenças horárias para calcular o sono total ganho. NOTA: Se uma mosca é realmente privada de sono é empírica. Assim, o experimentador deve examinar por cento de sono perdido. Se a mosca não perdeu uma quantidade suficiente de sono, pode ser excluída da análise. Embora isso possa ser necessário para outras abordagens de privação do sono, raramente é necessário para o SNAP. Mais comumente, o sono pode não ser estável em uma determinada mosca antes do início da privação do sono. Se o sono não estiver estável, a homeostase não pode ser calculada. Aceitamos uma diferença máxima de ± 100 minutos de sono calculados antes do início da privação do sono como candidatos à inclusão. Na ocasião, o sono de uma mosca individual é distribuído de forma desigual ao longo do dia de 24h (por exemplo, alguns indivíduos podem obter 60-70% de sua cota de sono durante o dia e, portanto, só perdem uma pequena proporção de sua cota de sono de 24 horas quando privados por 12 h à noite). Estas moscas podem ser avaliadas separadamente.</li>
	<li>Calcule a porcentagem média de sono recuperado (em relação à linha de base) acima de 12 h, 24 h e 48h do período de recuperação para cada genótipo.</li>
	<li>A partir dos dados de sono, calcule o comprimento médio e máximo do período de luta do sono diurno na linha de base e os dias de recuperação para cada genótipo. NOTA: O sono de recuperação em moscas é caracterizado pelo aumento da quantidade de sono e aumento da profundidade do sono nos dias de recuperação. A consolidação do sono é usada como medida de profundidade do sono. Limiares de excitação também podem ser usados como medida de profundidade do sono.</li>
</ol>

<ol>
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J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+does+your+mutant+sleep?+Probing+arousal+to+better+understand+sleep+defects+in+Drosophila.">How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila.</a> Scientific Reports. 5, 8454 (2015).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+homeostasis+in+Drosophila+melanogaster.">Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Sleep. 27 (4), 628-639 (2004).</li><li>Klose, M., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep-drive+reprograms+clock+neuronal+identity+through+CREB-binding+protein+induced+PDFR+expression.">Sleep-drive reprograms clock neuronal identity through CREB-binding protein induced PDFR expression.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Dissel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+restores+behavioral+plasticity+to+Drosophila+mutants.">Sleep restores behavioral plasticity to Drosophila mutants.</a> Current Biology. 25 (10), 1270-1281 (2015).</li><li>Gerstner, J. R., Vanderheyden, W. M., Shaw, P. J., Landry, C. F., Yin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty-acid+binding+proteins+modulate+sleep+and+enhance+long-term+memory+consolidation+in+Drosophila.">Fatty-acid binding proteins modulate sleep and enhance long-term memory consolidation in Drosophila.</a> PLoS One. 6 (1), 15890 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O sono em Drosophila foi caracterizado independentemente em 2000, por dois grupos4,5. Nestes estudos pioneiros, as moscas foram privadas do sono por manuseio suave (ou seja, privação de mão) e mostraram uma resposta homeostática robusta à privação do sono durante a noite. É importante ressaltar que, com qualquer experimento de privação do sono, é crucial controlar os potenciais efeitos de confusão do método usado para manter o animal acordado. Estudos de privação de mão estabelecem a referência para estudos de homeostase de mosca como um meio minimamente disruptivo de privar moscas. O SNAP priva eficientemente as moscas do sono de >98% do sono noturno, e, importante, induz um rebote de sono comparável ao obtido com privação de mão4,7.
Desde os estudos fundamentais que definem o sono em moscas, uma série de métodos foram desenvolvidos para avaliar a homeostase do sono em moscas de forma elevada7,9,39,40,41. Pesquisamos ~250 artigos sobre sono em moscas e encontramos ~46% desses artigos publicados relatados usando privação do sono para avaliar a regulação ou função do sono(Tabela 1). Uma série de métodos diferentes efetivamente induziram um rebote do sono em moscas. Curiosamente, dos estudos que avaliaram a recuperação do sono, os protocolos utilizados para a privação do sono e a recuperação do sono diferem. Especificamente, tanto a duração da privação do sono (Tabela 2) quanto a duração para a qual a recuperação foi avaliada(Tabela 1) variaram substancialmente, potencialmente complicando comparações de resultados obtidos com diferentes protocolos. A recuperação do sono em moscas é conhecida por persistir por até 48horas após a privação do sono5. Assim, achamos que uma descrição completa dos efeitos de uma determinada manipulação do sono na homeostase são melhor obtidas quando o rebote homeostático é avaliado durante um período de recuperação de 48 horas.
É importante notar que privar moscas do sono durante o dia não aumenta consistentemente a unidade de sono4. Assim, iniciar um protocolo de privação do sono de 24 horas no lights-on e continuar até o dia seguinte não aumentaria adicionalmente o sono de recuperação em comparação com um protocolo de privação de sono de 12 horas que começa no apagar das luzes. Na verdade, a recuperação calculada do sono pode ser menor, uma vez que incluirá sono diurno não-homeostaticamente regulamentado, além do sono noturno. A observação de que a privação do sono diurno não induz um rebote homeostático pode, no entanto, ser usada para controlar para potenciais efeitos de confusão do método de privação do sono. Assim, moscas que dormem privadas durante a noite no SNAP são comparadas com moscas que recebem um estímulo comparável durante o dia7.
Além de ser usado para a privação total do sono, alterando a frequência do estímulo, o SNAP também pode ser usado para restringir cronicamente e fragmentar o sono7,42, imitando assim condições de perda crônica do sono em humanos. Além disso, ao fornecer estímulos em etapas de frequência crescente, o SNAP também pode ser usado para medir os limiares de excitação8. O SNAP é, portanto, uma maneira fácil de efetivamente privar e restringir o sono das moscas, avaliar a resposta homeostática e medir outras características do sono.
O SNAP pode caber em uma incubadora de moscas de laboratório padrão, mas definitivamente perturbará moscas na incubadora que não fazem parte do experimento. Felizmente, o SNAP pode ser colocado em um local isolado para privar moscas sem perturbar outros experimentos em andamento. Uma vez que o sono de recuperação é frágil, deve-se tomar cuidado para garantir que o sono de recuperação ocorra em um local tranquilo.
Estudos complementares de privação do sono, ferramentas genéticas e farmacológicas foram desenvolvidos para melhorar o sono em moscas8,43,44. Assim, a capacidade de modular o sono facilmente bidirecionalmente permitirá que a pesquisa sobre sono de moscas continue fornecendo insights profundos sobre a regulação e a função do sono.

O sono é quase universal em animais, mas sua função permanece incerta. A homeostase do sono, o aumento compensatório do sono após a privação do sono, é uma propriedade definidora do sono, que tem sido usada para caracterizar estados de sono em um número de animais1,2,3,4,5.
O sono na mosca tem muitas semelhanças com o sono humano, incluindo uma resposta homeostática robusta à perda de sono4,5. Inúmeros estudos de sono na mosca têm usado a privação do sono tanto para inferir a função do sono, examinando as consequências adversas que se acumulam a partir da vigília prolongada, quanto para entender a regulação do sono, determinando os mecanismos neurobiológicos que controlam a regulação homeostática do sono. Assim, as moscas privadas de sono apresentaram prejuízos no aprendizado e na memória6,7,8,9,10,11,12, plasticidade estrutural13,14,15, atenção visual16, recuperação da lesão neuronal17,18, acasalamento e comportamentos agressivos19, 20, proliferação celular21, e respostas ao estresse oxidativo22,23 para citar alguns. Além disso, as investigações sobre os mecanismos neurobiológicos que controlam o sono de recuperação produziram insights críticos sobre a maquinaria neuronal que constitui o homeostat do sono8,9,23,24,25,26,27,28,29 . Finalmente, além de revelar insights fundamentais sobre a função do sono em animais saudáveis, estudos de privação do sono também informaram insights sobre a função do sono em estados doentes30,31.
Embora a privação do sono seja inegavelmente uma ferramenta poderosa, com qualquer experimento de privação do sono, é importante distinguir fenótipos que resultam de um aumento prolongado, daqueles induzidos pelo estímulo usado para manter o animal acordado. A privação do sono por privação manual ou manuseio suave, é geralmente considerada como estabelecendo o padrão para privação de sono minimamente disruptiva. Aqui descrevemos um protocolo para o sono privando moscas usando o Aparelho de Anulação do Sono (SNAP). O SNAP é um dispositivo que fornece um estímulo mecânico para moscas a cada 10 anos, mantendo as moscas acordadas induzindo geotaxis negativos(Figura 1). O SNAP priva eficientemente moscas de >98% do sono noturno, mesmo em moscas com alta movimentação de sono8,32. O SNAP foi calibrado em moscas sensíveis ao estrondo, a agitação das moscas no SNAP não prejudica as moscas; a privação do sono com o SNAP induz um rebote comparável ao obtido por privação manual7. O SNAP é, portanto, um método robusto para dormir privar moscas enquanto controla os efeitos do estímulo estimulante.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Locomotor activity tubes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher Tissue Prep Wax</td><td>Thermo Fisher</td><td>13404-122</td><td>Wax used for sealing tubes</td></tr><tr><td>Glass tubes</td><td>Wale Apparatus</td><td>244050</td><td>We cut 5mm diameter Pyrex glass&amp;nbsp;tubes into 65mm long tubes&amp;nbsp;to record sleep. Pre-cut tubes&amp;nbsp;can also be purchased.</td></tr><tr><td>Nutri Fly Bloomington Formulation fly food</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-113</td><td>Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in.</td></tr><tr><td>Rotary glass cutting tool</td><td>Dremel Multi Pro</td><td>395</td><td>Used to cut 65mm long glass tubes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Monitoring Sleep&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAM System and DAMFileScan software</td><td>Trikinetics</td><td></td><td>Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format</td></tr><tr><td>Data acquisition computer</td><td>Lenovo</td><td>Idea Centre AIO3</td><td>A equivalent computer from any manufacturer can substitute</td></tr><tr><td>Drosophila Activity Monitors</td><td>Trikinetics</td><td>DAM2</td><td>These monitors are used to record flies&#039; locomotor activity</td></tr><tr><td>Environment Monitor</td><td>Trikinetics</td><td>DEnM</td><td>Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded</td></tr><tr><td>Light Controller</td><td>Trikinetics</td><td>LC4</td><td>A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off</td></tr><tr><td>Power Supply Interface Unit for DAM</td><td>Trikinetics</td><td>PSIU-9</td><td>Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data</td></tr><tr><td>RJ11 connector</td><td>7001-64PC</td><td>Multicomp</td><td>DAM monitors accept RJ11 jacks</td></tr><tr><td>Splitters</td><td>Trikinetics</td><td>SPLT5</td><td>Used to connect upto 5 DAM monitors</td></tr><tr><td>Telephone cable wire</td><td>Radioshack</td><td>278-367</td><td>Phone cables to acquire data from DAM monitors</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sleep Deprivation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Gw INSTEK</td><td>GPS-30300</td><td>Power supply for the SNAP</td></tr><tr><td>Sleep Nullifying Apparatus</td><td>Washington University School of Medicine machine shop</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the sleep nullifying apparatus: a highly efficient method of sleep depriving drosophila

A homeostase do sono, o aumento do sono observado após a perda do sono, é um dos critérios definidores utilizados para identificar o sono em todo o reino animal. Como consequência, a privação do sono e a restrição do sono são ferramentas poderosas que são comumente usadas para fornecer insights sobre a função do sono. No entanto, os experimentos de privação do sono são inerentemente problemáticos, na prática, o estímulo à privação em si pode ser a causa das mudanças observadas na fisiologia e no comportamento. Assim, técnicas bem sucedidas de privação do sono devem manter os animais acordados e, idealmente, resultar em uma recuperação robusta do sono sem também induzir um grande número de consequências não intencionais. Aqui, descrevemos uma técnica de privação do sono para Drosophila melanogaster. O Aparelho de Anulação do Sono (SNAP) administra um estímulo a cada 10 anos para induzir geotaxis negativos. Embora o estímulo seja previsível, o SNAP efetivamente evita >95% do sono noturno mesmo em moscas com alta movimentação de sono. É importante ressaltar que a resposta homeostática subsequente é muito semelhante à alcançada usando privação manual. O tempo e o espaçamento dos estímulos podem ser modificados para minimizar a perda de sono e, assim, examinar efeitos não específicos do estímulo sobre fisiologia e comportamento. O SNAP também pode ser usado para restrição de sono e para avaliar limiares de excitação. O SNAP é uma poderosa técnica de interrupção do sono que pode ser usada para entender melhor a função do sono.

Canton S (Cs) foi usado como uma cepa tipo selvagem. As moscas foram mantidas em uma luz de 12 h: horário escuro de 12h e privação de sono por 12 horas durante a noite. A inspeção dos perfis de sono das moscas de Cs no dia da linha de base (bs), dia de privação do sono (sd) e dois dias de recuperação (rec1 e rec2)(Figura 2A) sugere que as moscas foram efetivamente privadas de sono no SNAP, e recuperaram o sono durante o dia consistente com os relatos observados na literatura4,5. A eficácia do SNAP em manter as moscas acordadas também é vista na alta atividade (300-350 contagens/h) exibida por moscas durante a privação do sono(Figura 2B). De fato, monitorar as taxas de atividade das moscas durante a privação do sono pode ser um barômetro útil da eficácia do protocolo de privação e/ou uma medida indireta da unidade de sono. Quando a privação do sono é ineficaz, as moscas não são tão ativas durante o período de privação. Moscas que estão sob alta unidade de sono rapidamente adormecem após cada estímulo e não atravessam o tubo tantoquanto 35. Tanto o ângulo de inclinação do aparelho, quanto a velocidade da queda são fundamentais para garantir que as moscas sejam efetivamente mantidas acordadas sem prejudicá-las. Cada laboratório pode otimizar o ângulo e a velocidade ajustando a mola (Figura 1B) e/ou o tamanho e a forma da câmera (Figura 1C e Figura 1D, à direita).
Para estimar quantitativamente a eficácia da privação do sono e da recuperação, o sono perdido durante a privação e, em seguida, recuperado nos dias de recuperação foi calculado para cada mosca individual(Figura 2C). É importante ressaltar que não houve mudança significativa no sono da linha de base entre o dia da privação e o dia da linha de base (ver 0-12 h na Figura 2C) indicando que o sono é estável nessas moscas. Uma grande diferença no sono neste período de 12 horas (por exemplo, ± 100 min) sugere que o sono não estava estável. O SNAP efetivamente privou moscas de >98% de seu sono noturno. As moscas recuperaram ~20% de seu sono nas primeiras 12 horas e não recuperaram sono adicional durante a noite, como relatado anteriormente. No entanto, as moscas começaram a recuperar o sono no dia seguinte, de tal forma que se recuperaram ~36% do sono ao longo de 48h derecuperação (Figura 2D). 30 - 40% do sono recuperado acima de 48 h é bastante típico para moscas do tipo selvagem sem sono usando o SNAP.
A homeostase do sono é caracterizada tanto pelo aumento da duração do sono quanto pelo aumento da profundidade do sono durante o período de recuperação após a privação. A consolidação do sono diurno é comumente usada como uma leitura da profundidade do sono. A consolidação do sono pode ser avaliada como a duração média do ataque de sono durante todo o dia(Figura 2E). No entanto, à medida que a pressão do sono é dissipada durante a recuperação, a duração média do ataque de sono será reduzida à medida que o dia avança. Assim, é frequentemente útil também examinar mudanças na duração máxima do ataque de sono que podem fornecer uma métrica mais sensível (Figura 2F).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Método de Privação do Sono</td>
			<td>Total # de papéis</td>
			<td>% papéis / técnica</td>
			<td>Recuperação avg avaliada</td>
		</tr>
<tr>
<td>ESTALO</td>
			<td>52</td>
			<td>37.14%</td>
			<td>33 ± 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vórtice/Agitação Aleatória</td>
			<td>49</td>
			<td>35.00%</td>
			<td>18 ± 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Privação manual</td>
			<td>9</td>
			<td>6.43%</td>
			<td>36 ± 11</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD termogenético</td>
			<td>15</td>
			<td>10.71%</td>
			<td>36 ± 12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Unspecified</td>
			<td>15</td>
			<td>10.71%</td>
			<td>29 ± 10</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Levantamento de diferentes métodos de privação do sono utilizados na literatura. Apenas 116 /254 papéis usaram privação de sono. O número de trabalhos usando cada método = "Total # de papéis". A fração de papéis usando cada método = "% de trabalhos/ técnica". O tempo médio de recuperação avaliado para cada método = "Recuperação avg avaliada". SD - Privação de sono. SNAP - Aparelho de anulação do sono
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Comprimento do SD</td>
			<td>Total de estudos</td>
		</tr>
<tr>
<td>< 6 h</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 h</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>>6 h e < 12 h</td>
			<td>17</td>
		</tr>
<tr>
<td>12 h</td>
			<td>69</td>
		</tr>
<tr>
<td>>12 h e <24 h</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>24 h</td>
			<td>19</td>
		</tr>
<tr>
<td>> 24 h</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD crônico</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Qualquer SD</td>
			<td>160</td>
		</tr>
</tbody></table>Mesa 2. O tempo de privação do sono realizado em diferentes estudos. SD - Privação do sono
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62105/62105fig01.jpg"> Figura 1. O Apparatus de anulação do sono (SNAP). A) Vista frontal do aparelho. O SNAP pode acomodar 8 monitores de atividade em duas linhas; pinos de suporte restringem os monitores no lugar. As pernas podem ser ajustadas para ajudar a posicionar o aparelho na orientação correta. B) Visão de close-up do motor e mola que balançam o aparelho para frente e para trás. O motor gira uma câmera que inclina o aparelho de volta para a posição "para cima" e comprime a mola. A liberação da mola da compressão encaixa o aparelho de volta à posição "para baixo". )Esquerda - Vista lateral do aparelho na posição "para baixo". Os pinos do suporte restringem os monitores; uma ranhura do cabo do monitor garante que os cabos do monitor sejam mantidos no lugar. As almofadas ajudam a amortecer o impacto do aparelho na posição 'para baixo'. Certo - Vista de perto da câmera. D) Visão do lado esquerdo do aparelho na posição "up". Direita - A rotação no sentido anti-horário da câmera inclina o aparelho para a posição 'up'. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/62105/62105fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62105/62105fig02.jpg"> Figura 2. Resultados experimentais. A) Parcelas de sono de Cs voam para os quatro dias do experimento: o dia da linha de base (bs), o dia da privação do sono (sd) e dois dias de recuperação (rec1 e rec2). B) A atividade locomotor média conta com moscas no dia da privação do sono. Moscas foram privadas de sono das horas 12-24. C) Curso de tempo de privação e recuperação do sono. As moscas Cs foram privadas de sono das horas 12 - 24, e permitidas a se recuperar da hora 24 - 72. O SNAP efetivamente privou moscas de >98% de sono, que foi parcialmente recuperada acima de 48 h (n = 12 moscas, Medidas Repetidas ANOVA para o tempo, F [70.1470]=12,97, p < 10-15). D) Percentual de sono recuperado acima de 48 h. Moscas recuperaram ~20% de seu sono ao longo de 12 h, e ~36% de seu sono ao longo de 48 h. E) Consolidação do sono para cada dia do experimento, medida pela duração média do ataque de sono durante o dia. O sono está mais consolidado no primeiro dia de recuperação em comparação com a linha de base (p <0,05, t-test). F) Consolidação do sono para cada dia do experimento medida pela duração máxima do ataque de sono durante o dia. O sono está mais consolidado no primeiro dia de recuperação em comparação com a linha de base (p <0,05, t-test). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/62105/62105fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila

A privação do sono é uma ferramenta poderosa para investigar a função e a regulação do sono. Descrevemos um protocolo para dormir privar Drosophila usando o Aparelho de Anulação do Sono, e determinar a extensão do sono de recuperação induzido pela privação.

O aparelho de anulação do sono: um método altamente eficiente de privação do sono Drosophila

Sleep homeostasis, the increase in sleep observed following sleep loss, is one of the defining criteria used to identify sleep throughout the animal ...

the-sleep-nullifying-apparatus-highly-efficient-method-sleep

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila

3.3K visualizações.  Washington University School of Medicine. A privação do sono é uma ferramenta poderosa para investigar a função e a regulação do sono. Descrevemos um protocolo para dormir privar Drosophila usando o Aparelho de Anulação do Sono, e determinar a extensão do sono de recuperação induzido pela privação.

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Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Assaying atividade locomotora para estudar ritmos circadianos e sono Parâmetros em Drosophila</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Neurociência

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Medição quantitativa da resposta imune e do sono em<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Imunologia e Infecção

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, and issues commands to start or stop feeding. Deciphering the processes underlying the decision-making of timely and moderate feeding carries major implications in our understanding of physiological and psychological disorders related to feeding control. Simple, quantitative, and robust methods are required to measure the food ingestion of animals after experimental manipulation, such as forcibly increasing the activities of certain target neurons. Here, we introduced dye-labeling-based feeding assays to facilitate the neurogenetic study of feeding control in adult fruit flies. We review available feeding assays, and then describe our methods step-by-step from setup to analysis, which combine thermogenetic and optogenetic manipulation of neurons controlling feeding motivation with dye-labeled food intake assay. We also discuss the advantages and limitations of our methods, compared with other feeding assays, to help readers choose an appropriate assay.

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Quantitative food-intake assays with dyed food provide a robust and high-throughput means to evaluate feeding motivation. Combining the food consumption assay with thermogenetic and optogenetic screens is a powerful approach to investigate the neural circuits underlying appetite in adult Drosophila melanogaster.

Combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

Comportamento

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Luz Ensaio Preferências para estudar inata e circadiano Photobehavior Regulamentado<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

The FlyBar: Administering Alcohol to Flies

Fruit flies (Drosophila melanogaster) are an established model for both alcohol research and circadian biology. Recently, we showed that the circadian clock modulates alcohol sensitivity, but not the formation of tolerance. Here, we describe our protocol in detail. Alcohol is administered to the flies using the FlyBar. In this setup, saturated alcohol vapor is mixed with humidified air in set proportions, and administered to the flies in four tubes simultaneously. Flies are reared under standardized conditions in order to minimize variation between the replicates. Three-day old flies of different genotypes or treatments are used for the experiments, preferably by matching flies of two different time points (e.g., CT 5 and CT 17) making direct comparisons possible. During the experiment, flies are exposed for 1 hr&#160;to the pre-determined percentage of alcohol vapor and the number of flies that exhibit the Loss of Righting reflex (LoRR) or sedation are counted every 5 min. The data can be analyzed using three different statistical approaches. The first is to determine the time at which 50% of the flies have lost their righting reflex and use an Analysis of the Variance (ANOVA) to determine whether significant differences exist between time points. The second is to determine the percentage flies that show LoRR after a specified number of minutes, followed by an ANOVA analysis. The last method is to analyze the whole times series using multivariate statistics. The protocol can also be used for non-circadian experiments or comparisons between genotypes.

Drosophila has emerged as a significant model system for dissecting the cellular and molecular underpinnings of behavioral responses to alcohol. Here we present a protocol for the collection of alcohol sensitivity data in a circadian context that can be easily applied to other experiments and is well-suited for undergraduate research.

O Flybar: Administração álcool para Moscas

Fruit flies (Drosophila melanogaster) are an established model for both alcohol research and circadian biology. Recently, we showed that the circadian ...

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human populations, the Drosophila model allows strict control over genetic background, and virtually unlimited numbers of individuals of the same genotype can be reared rapidly under well-controlled environmental conditions without regulatory restrictions and at relatively low cost. Flies exposed to ethanol undergo physiological and behavioral changes that resemble human alcohol intoxication, including loss of postural control, sedation, and development of tolerance. Here, we describe a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The assay is based on video recording of single flies introduced without anesthesia in 24-well cell culture plates in a set-up that enables synchronous initiation of alcohol exposure. The system enables a single person to collect individual ethanol sedation data on as many as 2,000 flies within an 8 h work period. The assay can, in principle, be extended to assess the effects of exposure to any volatile substance and applied to measure effects of acute toxicity of volatiles on other insects, including other fly species.

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Current methods to measure alcohol sensitivity in Drosophila are designed to test groups of flies. We present a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The method does not require specialized tools and can be performed in any laboratory using common materials.

Método de alta duração para medir o tempo de sedação de álcool de melanogaster individual drosophila

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human ...

An Adjustable High-Definition Imaging System for Behavioral Studies of Drosophila Adults

Drosophila melanogaster is a very powerful model in biological research, but a bad model for photography or videography. This paper describes a simple but effective method to observe and document the behavior or morphology of flies. Flies were placed in a translucent observation chamber c.a. &#216;15 x 5mm (no food inside) or &#216;15 x 12 mm (with an 8 mm-high piece of food inside). After covering with an ultraviolet (UV)/clear filter with high light transmittance, the chamber was placed under a 5-50x zoom stereo microscope, and mini light-emitting diode (LED) video lights were placed on both sides of the microscope to illuminate the chamber to obtain uniform, soft, bright, and nearly shadow-free light. Then, a compact digital camera with 3-5x optical zoom, which can record 1080 P high-definition or higher resolution video (at a frame rate of &#8805;30 fps), was connected to the eyepiece of microscope through a bracket, and photographs or videos were taken through the eyepiece. By adjusting the zoom knob of the zoom stereo microscope, it was very easy to track the flies and take panoramic or detailed close-up images as needed, while the camera recorded everything under the microscope. Because the flies can stay at any position in the chamber, they can be observed and recorded from all directions. The photographs or videos taken are of good image quality. This method can be used both for scientific research and teaching.

An Adjustable High-Definition Imaging System for Behavioral Studies of Drosophila Adults

This protocol describes how to make a simple adult Drosophila behavior observation chamber, and how to take high-definition photographs/videos of the morphology or behavior of different types of fruit flies in the observation chamber through relatively simple and affordable methods.

Um sistema de imagem de alta definição ajustável para estudos comportamentais de adultos drosophila

Drosophila melanogaster is a very powerful model in biological research, but a bad model for photography or videography. This paper describes a simple but ...

Avançando nos tratamentos de distúrbios do sono: uma abordagem de triagem baseada em Drosophila

High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders characterized by shortened sleep duration and fragmented patterns. These sleep disruptions also correlate with an increased risk of various illnesses in the elderly, including diabetes, cardiovascular diseases, and psychological disorders. Unfortunately, existing drugs for sleep disorders are associated with significant side effects such as cognitive impairment and addiction. Consequently, the development of new, safer, and more effective sleep disorder medications is urgently needed. However, the high cost and lengthy experimental duration of current drug screening methods remain limiting factors.
This protocol describes a cost-effective and high-throughput screening method that utilizes Drosophila melanogaster, a species with a highly conserved sleep regulation mechanism compared to mammals, making it an ideal model for studying sleep disorders in the elderly. By administering various small compounds to aged flies, we can assess their effects on sleep disorders. The sleep behaviors of these flies are recorded using an infrared monitoring device and analyzed with the open-source data package Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). This protocol offers a low-cost, reproducible, and efficient screening approach for sleep regulation. Fruit flies, due to their short life cycle, low husbandry cost, and ease of handling, serve as excellent subjects for this method. As an illustration, Reserpine, one of the tested drugs, demonstrated the ability to promote sleep duration in elderly flies, highlighting the effectiveness of this protocol.

Autor em destaque: Superando desafios na medição do sono de Drosophila usando o sistema DAM 

Presented is a protocol for high-throughput drug screening to improve sleep by monitoring the sleep behavior of fruit flies in an elderly Drosophila model.

Triagem de drogas de moléculas pequenas de alto rendimento para distúrbios do sono relacionados à idade usando Drosophila melanogaster

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders ...

O aparelho de anulação do sono: um método altamente eficiente de privação do sono Drosophila

Resumo

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Assaying atividade locomotora para estudar ritmos circadianos e sono Parâmetros em Drosophila

Medição quantitativa da resposta imune e do sono em

Combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em Drosophila

Luz Ensaio Preferências para estudar inata e circadiano Photobehavior Regulamentado

O Flybar: Administração álcool para Moscas

Método de alta duração para medir o tempo de sedação de álcool de melanogaster individual drosophila

Um sistema de imagem de alta definição ajustável para estudos comportamentais de adultos drosophila

Triagem de drogas de moléculas pequenas de alto rendimento para distúrbios do sono relacionados à idade usando Drosophila melanogaster

Triagem de drogas de moléculas pequenas de alto rendimento para distúrbios do sono relacionados à idade usando Drosophila melanogaster

Triagem de drogas de moléculas pequenas de alto rendimento para distúrbios do sono relacionados à idade usando Drosophila melanogaster