Name: the sleep nullifying apparatus: a highly efficient method of sleep depriving drosophila
Uploaded: 2020-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH 5R01NS051305-14 ו 5R01NS076980-08 ל- PJS.

1. הכנה ניסיונית
<ol><li>לאסוף זבובים כשהם מתחלקים לתוך בקבוקונים, הפרדת זבובים זכר ונקבה. הערה: ניסויי שינה נערכים בדרך כלל עם זבובים נשיים. חשוב לאסוף נקבות בתולות. נקבות מויזות יטילו ביצים שבוקעות לתוך זחלים מה שמסבך את ניתוח הנתונים.</li>
	<li>זבובי בית של מין אחד בקבוצות של <20. הערה: דיור טס בסביבה מועשרת חברתית (קבוצות של >50) מווסתכונןשינה 6,13 מדידות מבלבלות פוטנציאליות של שינה ריבאונד. יתר על כן, לאחר העשרה חברתית, השינה תרד על פני כמה ימים6. לכן, שינה בסיסית אינה יציבה לסבך ניתוח של שינה ריבאונד. שמירה על זבובים בקבוצות של <20 מונעת את הבלבול הפוטנציאלי הזה.</li>
	<li>יש לשמור על זבובים בבקבוקונים למשך 3-5 ימים בסביבה מבוקרת אור ולחות. הערה: גיל ובגרות של זבובים משפיעים מאוד על השינה. השינה גבוהה בזבובים בני יום אחד ומתייצבת על ידי 3-5 ימים של גיל4. זבובים נשמרים בדרך כלל על אור של 12 שעות: לוח זמנים חשוך של 12 שעות ב-50% לחות.</li>
</ol>2. הכנת צינורות להקלטת שינה
הערה: השינה מנוטרת באמצעות צגי פעילות לוקומוטור. צג יכול להחזיק 32 זבובים שוכנים בנפרד בצינורות בקוטר 5 מ"מ. בדרך כלל, גנוטיפים מנותחים בקבוצות של 16 או 32 זבובים.
<ol><li>הכן מספר מתאים של צינורות עם מזון זבוב בקצה אחד. הערה: דיאטה ומטבוליזם ידועים להשפיע על שינה33,34, ולכן חשוב במיוחד למקם זבובים על אותו מזון שבו הם גדלו.</li>
	<li>לאטום את קצה הצינורות עם שעווה. הערה: מניעת שינה וריבאונד הם ניסוי של חמישה ימים, ומזון יכול להתייבש אם לא אטום כראוי. בצינורות אטומים כראוי, מזון יכול להישמר במשך 10 ימים או יותר. לכן, זה קריטי כדי להבטיח כי הקצוות של הצינורות אטומים היטב. זבובים יכולים גם להיתקע למזון רטוב, עם זאת. לכן, זה עוזר לעשות צינורות 1-2 ימים לפני תחילת הניסוי.</li>
	<li>במקום בנפרד להתעורר, מתנהג זבובים לתוך צינורות זכוכית באורך 65 מ"מ להקלטת שינה באמצעות שאיפה ולחבר את הקצה של הצינורות עם פקק קצף. הערה: זבובים לעולם אינם נחשפים מחדש להרדמה CO2 בעת הצבת זבובים לתוך צינורות להקלטת שינה. השאפתן עשוי צינורות גומי עם קצה אחד מכוסה גבינה מוכנס לתוך קצה פיפטה 1 מ"ל.</li>
</ol>3. הקלטת שינה
<ol><li>טען זבובים בצינורות לתוך צגי פעילות כדי לפקח על השינה. הערה: סלעי SNAP מנטרים הלוך ושוב מ - 60° ל + 60 ° כל ~ 10s. המסכים מוחזקים ב-60° עבור ~ 5.9s ; נדרשים ~2.9 s כדי שהמגש יחזיק את הצגים יעבור מ- -60° ל- +60° ו- ~ 1 s כדי לחזור מ- +60° ל- -60°. ניתן לשנות את אורך המחזור לפי הצורך על ידי התאמת המתח המסופק למנוע.<ol>
<li>הקפד להבטיח כי צינורות ממוקמים צגי פעילות בכיוון הנכון. בכיוון הנכון, קצה הצינור עם מזון נמצא בחלק העליון של SNAP כדי להבטיח כי זבובים לא לקבל דחף לתוך המזון. בנוסף, הסוף עם מזון הוא בצד של הצג עם שקע הקלטת השינה. הדבר מאפשר למוניטורים של הפעילות להיות מכוונים כראוי ב- SNAP למחסור יעיל בשינה ובו זמנית ניטור הפעילות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מקם צגי פעילות בתא ההקלטה כדי לפקח על השינה.</li>
	<li>נטר שינה במשך יומיים מלאים לפחות כדי להעריך שינה בסיסית. הערה: היום זבובים נטענים לתוך צגי פעילות בדרך כלל אינו נכלל כיום הסתגלות כדי לאפשר לזבובים להסתגל להיות מאוכסן בצינורות. שינה בסיסית נרשמת לפחות יומיים מלאים (48 שעות) החל מהבוקר שאחרי היום זבובים נטענים.</li>
	<li>שמור ספירת פעילות locomotor של זבובים בפחים של דקה אחת מרגע האורות ביום נתון לאורות ביום הקודם באמצעות תוכנת הקלטת פעילות (למשל, מ 8 בבוקר עד 8 בבוקר).</li>
	<li>הערכת שינה מנתוני הפעילות של locomotor באמצעות פקודות מאקרו מותאמות אישית באמצעות 5 דקות של חוסר פעילות כסף עבור התקף שינה35. הערה: מספר מדדי שינה מחושבים מספירת הפעילות של locomotor. אלה כוללים שינה של דקה/שעה מעל 24 שעות, זמן שינה כולל ב 24 שעות, ממוצע ומקסימום בשעות היום ולילה אורכים36.</li>
</ol>4. מניעת שינה והתאוששות
<ol><li>כמו זבובים ניתן להעריך שינה במשך פרקי זמן משתנים (למשל, 12 שעות, 24 שעות ו 36 שעות) ואת השינה התאוששות ניתן גם להעריך במרווחי זמן שונים (למשל, 6 שעות, 12 שעות, 24 שעות ו 48 שעות), לקבוע את משך ההחלמה על ידי צורך ניסיוני. ניתן לדמיין שחזור שינה באמצעות עלילת רווח/אובדן שינה או על ידי בחינת אחוז שינה התאושש על מרווח קבוע מראש (למשל, 6 שעות).</li>
	<li>אם השינה יציבה ביומיים הבסיסיים, ביום השלישי, מקם צגי פעילות לתוך SNAP למחסור בשינה למשך הלילה. הערה: זבובים יציגו ריבאונד שינה חזק על פני מגוון של שינה פעמים8,32,37,38, אבל השינה צריכה להיות יציבה כדי להעריך באופן אמין ריבאונד שינה. השינה יציבה כאשר ההבדל בשינה בין ימי הבסיס הוא ± 100 דקות.</li>
	<li>ודאו שמסכי הפעילות מאובטחים במקום עם סיכות מחזיקי צג, כבלי צג המחוברים לחשמל וצגים מכוונים נכון עם הסוף עם מזון מאחור, ומחסומי פלסטיק מלפנים(איור 1). הערה: ה-SNAP מתוכנן כך שהמצלמה מסתובבת אחת ל-10 s(איור 1). הכנסת הפלסטיק מאפסת את הצינורות על ידי דחיפת הצינורות בחזרה כאשר המנגנון נמצא במצב "למעלה". איפוס הצינורות חשוב כדי להבטיח כי כל הצינורות יש את טווח התנועה המלא בתחילת כל מחזור.</li>
	<li>נתק את צגי הפעילות והוציא את המסכים מה-SNAP מיד עם הדלקת האורות בעקבות מניעת שינה במהלך הלילה. הערה: זה קריטי כי מניעת שינה מסתיימת, וזבובים ממוקמים בהתאוששות מיד על אורות על בעקבות 12 שעות של מניעת שינה לילה. אפילו עיכוב של 20-30 דקות בהצבת זבובים בהתאוששות יכול להפריע להיקף השינה החוזרת.</li>
	<li>הנח זבובים בתא הקלטות שבו הם יהיו ללא הפרעה במשך יומיים (48 שעות) כדי לפקח על שנת ההתאוששות. הערה: אם תא ההקלטה משמש לניסויים אחרים, יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע גירוי זבובים מחלימים.</li>
	<li>חשב את כמות השינה שאבדה. עבור כל זבוב בודד, לחשב את ההבדל השעתי בין שינה המתקבלת במהלך מניעת שינה לבין השעה המקבילה במהלך קו הבסיס; לסכם את ההבדלים לשעה כדי לחשב את השינה הכוללת שאבדה.</li>
	<li>חשב את כמות השינה ששוחזרה. עבור כל זבוב בודד, לחשב את ההבדל השעתי בין שינה המתקבלת במהלך ההתאוששות לבין השעה המתאימה במהלך קו הבסיס; לסכם את ההבדלים לשעה כדי לחשב את השינה הכוללת שנצבר. הערה: אם זבוב הוא למעשה חסר שינה הוא אמפירי. לכן, הנסיין צריך לבחון אחוז שינה אבודה. אם הזבוב לא איבד כמות מספקת של שינה זה יכול להיות נשלל מהניתוח. למרות שזה עשוי להידרש עבור גישות אחרות מניעת שינה, זה רק לעתים רחוקות אם אי פעם נדרש עבור SNAP. בדרך כלל יותר, שינה לא יכול להיות יציב זבוב נתון לפני החניכה של מניעת שינה. אם השינה אינה יציבה, לא ניתן לחשב הומאוסטזיס. אנו מקבלים הבדל מרבי של ± 100 דקות שינה המחושב לפני תחילת מניעת השינה כמועמדים להכללה. לעיתים, שנתו של זבוב בודד מחולקת באופן לא אחיד על פני 24 שעות ביממה (למשל, אנשים מסוימים עשויים לקבל 60-70% ממכסת השינה שלהם במהלך היום ובכך לאבד רק חלק קטן ממכסת השינה שלהם 24 שעות כאשר נמנע מהם 12 שעות בלילה). זבובים אלה ניתן להעריך בנפרד.</li>
	<li>חשב את האחוז הממוצע של שינה התאוששה (יחסית לקו הבסיס) מעל 12 שעות, 24 שעות ו 48 שעות של תקופת ההתאוששות עבור כל גנוטיפ.</li>
	<li>מנתוני שינה, חשב את אורך השינה הממוצע והמקסימלי בשעות היום בקו הבסיס, ואת ימי ההתאוששות עבור כל גנוטיפ. הערה: שינה ריבאונד בזבובים מאופיינת בכמות שינה מוגברת, ועומק שינה מוגבר בימי ההתאוששות. איחוד שינה משמש כמדד של עומק שינה. סף עוררות יכול לשמש גם כמדד של עומק שינה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nath, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Jellyfish+Cassiopea+Exhibits+a+Sleep-like+State.">The Jellyfish Cassiopea Exhibits a Sleep-like State.</a> Current Biology. 27 (19), 2984-2990 (2017).</li><li>Vorster, A. P., Krishnan, H. C., Cirelli, C., Lyons, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+sleep+in+Aplysia+californica.">Characterization of sleep in Aplysia californica.</a> Sleep. 37 (9), 1453-1463 (2014).</li><li>Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+promotes+sleep-like+state+in+zebrafish.">Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish.</a> Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).</li><li>Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlates+of+sleep+and+waking+in+Drosophila+melanogaster.">Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster.</a> Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).</li><li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state.">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).</li><li>Ganguly-Fitzgerald, I., Donlea, J., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waking+experience+affects+sleep+need+in+Drosophila.">Waking experience affects sleep need in Drosophila.</a> Science. 313 (5794), 1775-1781 (2006).</li><li>Seugnet, L., Suzuki, Y., Vine, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1+receptor+activation+in+the+mushroom+bodies+rescues+sleep-loss-induced+learning+impairments+in+Drosophila.">D1 receptor activation in the mushroom bodies rescues sleep-loss-induced learning impairments in Drosophila.</a> Current Biology. 18 (15), 1110-1117 (2008).</li><li>Donlea, J. M., Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+sleep+by+remote+control+facilitates+memory+consolidation+in+Drosophila.">Inducing sleep by remote control facilitates memory consolidation in Drosophila.</a> Science. 332 (6037), 1571-1576 (2011).</li><li>Seidner, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Neurons+with+a+Privileged+Role+in+Sleep+Homeostasis+in+Drosophila+melanogaster.">Identification of Neurons with a Privileged Role in Sleep Homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Current Biology. 25 (22), 2928-2938 (2015).</li><li>Li, X., Yu, F., Guo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+deprivation+specifically+impairs+short-term+olfactory+memory+in+Drosophila.">Sleep deprivation specifically impairs short-term olfactory memory in Drosophila.</a> Sleep. 32 (11), 1417-1424 (2009).</li><li>Melnattur, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+role+for+sleep+in+supporting+Spatial+Learning+in+Drosophila.">A conserved role for sleep in supporting Spatial Learning in Drosophila.</a> Sleep. , 197 (2020).</li><li>Seugnet, L., Suzuki, Y., Donlea, J. M., Gottschalk, L., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+deprivation+during+early-adult+development+results+in+long-lasting+learning+deficits+in+adult+Drosophila.">Sleep deprivation during early-adult development results in long-lasting learning deficits in adult Drosophila.</a> Sleep. 34 (2), 137-146 (2011).</li><li>Donlea, J. M., Ramanan, N., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use-dependent+plasticity+in+clock+neurons+regulates+sleep+need+in+Drosophila.">Use-dependent plasticity in clock neurons regulates sleep need in Drosophila.</a> Science. 324 (5923), 105-108 (2009).</li><li>Bushey, D., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+and+synaptic+homeostasis:+structural+evidence+in+Drosophila.">Sleep and synaptic homeostasis: structural evidence in Drosophila.</a> Science. 332 (6037), 1576-1581 (2011).</li><li>Huang, S., Piao, C., Beuschel, C. B., G&#246;tz, T., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Active+Zone+Plasticity+Encodes+Sleep+Need+in+Drosophila.">Presynaptic Active Zone Plasticity Encodes Sleep Need in Drosophila.</a> Current Biology. 30 (6), 1077-1091 (2020).</li><li>Kirszenblat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+regulates+visual+selective+attention+in+Drosophila.">Sleep regulates visual selective attention in Drosophila.</a> Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>Singh, P., Donlea, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+Regulation+of+Sleep+and+Synapse+Pruning+after+Neural+Injury.">Bidirectional Regulation of Sleep and Synapse Pruning after Neural Injury.</a> Current Biology. 30 (6), 1063-1076 (2020).</li><li>Stanhope, B. A., Jaggard, J. B., Gratton, M., Brown, E. B., Keene, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+Regulates+Glial+Plasticity+and+Expression+of+the+Engulfment+Receptor+Draper+Following+Neural+Injury.">Sleep Regulates Glial Plasticity and Expression of the Engulfment Receptor Draper Following Neural Injury.</a> Current Biology. 30 (6), 1092-1101 (2020).</li><li>Kayser, M. S., Yue, Z., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+period+of+sleep+for+development+of+courtship+circuitry+and+behavior+in+Drosophila.">A critical period of sleep for development of courtship circuitry and behavior in Drosophila.</a> Science. 344 (6181), 269-274 (2014).</li><li>Kayser, M. S., Mainwaring, B., Yue, Z., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+deprivation+suppresses+aggression+in+Drosophila.">Sleep deprivation suppresses aggression in Drosophila.</a> Elife. 4, 07643 (2015).</li><li>Szuperak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sleep+state+in+Drosophila+larvae+required+for+neural+stem+cell+proliferation.">A sleep state in Drosophila larvae required for neural stem cell proliferation.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Vaccaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+Loss+Can+Cause+Death+through+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species+in+the+Gut.">Sleep Loss Can Cause Death through Accumulation of Reactive Oxygen Species in the Gut.</a> Cell. 181 (6), 1307-1328 (2020).</li><li>Kempf, A., Song, S. M., Talbot, C. B., Miesenb&#246;ck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potassium+channel+&#946;-subunit+couples+mitochondrial+electron+transport+to+sleep.">A potassium channel &#946;-subunit couples mitochondrial electron transport to sleep.</a> Nature. 568 (7751), 230-234 (2019).</li><li>Donlea, J. M., Pimentel, D., Miesenb&#246;ck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+machinery+of+sleep+homeostasis+in+Drosophila.">Neuronal machinery of sleep homeostasis in Drosophila.</a> Neuron. 81 (4), 860-872 (2014).</li><li>Liu, S., Liu, Q., Tabuchi, M., Wu, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+Drive+Is+Encoded+by+Neural+Plastic+Changes+in+a+Dedicated+Circuit.">Sleep Drive Is Encoded by Neural Plastic Changes in a Dedicated Circuit.</a> Cell. 165 (6), 1347-1360 (2016).</li><li>Pimentel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operation+of+a+homeostatic+sleep+switch.">Operation of a homeostatic sleep switch.</a> Nature. 536 (7616), 333-337 (2016).</li><li>Sitaraman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+Homeostatic+Sleep+Signals+by+Segregated+Synaptic+Microcircuits+of+the+Drosophila+Mushroom+Body.">Propagation of Homeostatic Sleep Signals by Segregated Synaptic Microcircuits of the Drosophila Mushroom Body.</a> Current Biology. 25 (22), 2915-2927 (2015).</li><li>Foltenyi, K., Greenspan, R. J., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+EGFR+and+ERK+by+rhomboid+signaling+regulates+the+consolidation+and+maintenance+of+sleep+in+Drosophila.">Activation of EGFR and ERK by rhomboid signaling regulates the consolidation and maintenance of sleep in Drosophila.</a> Nature Neuroscience. 10 (9), 1160-1167 (2007).</li><li>Seugnet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+modulates+sleep+homeostasis+and+learning+after+sleep+deprivation+in+Drosophila.">Notch signaling modulates sleep homeostasis and learning after sleep deprivation in Drosophila.</a> Current Biology. 21 (10), 835-840 (2011).</li><li>Seugnet, L., Galvin, J. E., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+short-term+memory+defects+following+sleep+deprivation+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson+disease.">Persistent short-term memory defects following sleep deprivation in a Drosophila model of Parkinson disease.</a> Sleep. 32 (8), 984-992 (2009).</li><li>Tabuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+interacts+with+a&#946;+to+modulate+intrinsic+neuronal+excitability.">Sleep interacts with a&#946; to modulate intrinsic neuronal excitability.</a> Current Biology. 25 (6), 702-712 (2015).</li><li>Melnattur, K., Zhang, B., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupting+flight+increases+sleep+and+identifies+a+novel+sleep-promoting+pathway+in+Drosophila.">Disrupting flight increases sleep and identifies a novel sleep-promoting pathway in Drosophila.</a> Science Advances. 6 (19), 2166 (2020).</li><li>Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Seugnet, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perilipin+homologue,+lipid+storage+droplet+2,+regulates+sleep+homeostasis+and+prevents+learning+impairments+following+sleep+loss.">The perilipin homologue, lipid storage droplet 2, regulates sleep homeostasis and prevents learning impairments following sleep loss.</a> PLOS Biology. 8 (8), (2010).</li><li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+and+cycle+limit+starvation-induced+sleep+loss+in+Drosophila.">Clock and cycle limit starvation-induced sleep loss in Drosophila.</a> Current Biology. 20 (13), 1209-1215 (2010).</li><li>Shaw, P. J., Tononi, G., Greenspan, R. J., Robinson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+response+genes+protect+against+lethal+effects+of+sleep+deprivation+in+Drosophila.">Stress response genes protect against lethal effects of sleep deprivation in Drosophila.</a> Nature. 417 (6886), 287-291 (2002).</li><li>Andretic, R., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+sleep+recordings+in+Drosophila:+moving+beyond+sleep+time.">Essentials of sleep recordings in Drosophila: moving beyond sleep time.</a> Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).</li><li>Seugnet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+sleep+regulatory+genes+using+a+Drosophila+model+of+insomnia.">Identifying sleep regulatory genes using a Drosophila model of insomnia.</a> Journal of Neuroscience. 29 (22), 7148-7157 (2009).</li><li>Bushey, D., Huber, R., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Hyperkinetic+mutants+have+reduced+sleep+and+impaired+memory.">Drosophila Hyperkinetic mutants have reduced sleep and impaired memory.</a> Journal of Neuroscience. 27 (20), 5384-5393 (2007).</li><li>Geissmann, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethoscopes:+An+open+platform+for+high-throughput+ethomics.">Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics.</a> PLOS Biology. 15 (10), 2003026 (2017).</li><li>Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+does+your+mutant+sleep?+Probing+arousal+to+better+understand+sleep+defects+in+Drosophila.">How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila.</a> Scientific Reports. 5, 8454 (2015).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+homeostasis+in+Drosophila+melanogaster.">Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Sleep. 27 (4), 628-639 (2004).</li><li>Klose, M., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep-drive+reprograms+clock+neuronal+identity+through+CREB-binding+protein+induced+PDFR+expression.">Sleep-drive reprograms clock neuronal identity through CREB-binding protein induced PDFR expression.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Dissel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+restores+behavioral+plasticity+to+Drosophila+mutants.">Sleep restores behavioral plasticity to Drosophila mutants.</a> Current Biology. 25 (10), 1270-1281 (2015).</li><li>Gerstner, J. R., Vanderheyden, W. M., Shaw, P. J., Landry, C. F., Yin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty-acid+binding+proteins+modulate+sleep+and+enhance+long-term+memory+consolidation+in+Drosophila.">Fatty-acid binding proteins modulate sleep and enhance long-term memory consolidation in Drosophila.</a> PLoS One. 6 (1), 15890 (2011).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שינה בדרוסופילים אופיינה באופן עצמאי בשנת 2000, על ידי שתי קבוצות4,5. במחקרים חלוציים אלה, זבובים נשללו שינה על ידי טיפול עדין (כלומר, מניעת ידיים) והוכחו להפגין תגובה הומיאוסטטית חזקה למחסור בשינה בלילה. חשוב לציין, עם כל ניסוי מניעת שינה זה חיוני כדי לשלוט על השפעות מבלבלות פוטנציאליות של השיטה המשמשת כדי לשמור על החיה ערה. מחקרים על מניעת ידיים קובעים את אמת המידה למחקרים על הומאוסטזיס זבובים כאמצעי מינימלי לשיבוש שינה של זבובים. SNAP מונע ביעילות זבובים של שינה של >98% של שינה בלילה, וחשוב מכך גורמת ריבאונד שינה דומה לזה המתקבל עם מניעת יד4,7.
מאז מחקרי היסוד המגדירים שינה בזבובים, פותחו מספר שיטות להערכת הומאוסטזיס שינה בזבובים באופן תפוקה גבוהה7,9,39,40,41. סקרנו ~ 250 מאמרים על שינה בזבובים ומצאנו ~ 46% מהמאמרים שפורסמו אלה דיווחו באמצעות מניעת שינה כדי להעריך ויסות שינה או פונקציה (טבלה 1). מספר שיטות שונות גרמו ביעילות לריבוינד שינה בזבובים. מעניין, של המחקרים כי העריכו ריבאונד שינה, הפרוטוקולים המשמשים למחסור בשינה ריבאונד שינה שונה. באופן ספציפי, הן משך מניעת השינה (טבלה 2) והן משך הזמן שעבורו הוערך ריבאונד (טבלה 1) השתנו באופן משמעותי, מה שעלול לסבך השוואות של תוצאות שהושגו בפרוטוקולים שונים. שינה ריבאונד זבובים ידוע להתמיד עד 48 שעות בעקבות מניעת שינה5. בהתאם לכך, אנו חושבים תיאור יסודי של ההשפעות של מניפולציה שינה נתון על הומאוסטזיס מתקבלים בצורה הטובה ביותר כאשר ריבאונד הומיאוסטטי מוערך על פני תקופת התאוששות 48 שעות.
חשוב לציין כי מניעת זבובים של שינה במהלך היום אינו מגדיל בעקביות את כונן השינה4. לפיכך, הפעלת פרוטוקול מניעת שינה 24 שעות באור דולק והמשך עד למחרת לא תשפר בנוסף את שנת ההתאוששות בהשוואה לפרוטוקול מניעת שינה של 12 שעות החל מכיבוי אורות. למעשה, ריבאונד השינה המחושב עשוי להיות נמוך יותר שכן הוא יכלול שינה בשעות היום ללא הונוסטטיות בנוסף לשינה בלילה. התצפית כי מניעת שינה בשעות היום אינה גורמת ריבאונד הומיאוסטטי יכול לשמש עם זאת כדי לשלוט על השפעות מבלבלות פוטנציאליות של השיטה של מניעת שינה. לכן, זבובים שינה מקופחת לילה SNAP משווים זבובים שמקבלים גירוי דומה בשעות היום7.
בנוסף לשימוש עבור מניעת שינה מוחלטת, על ידי שינוי תדירות הגירוי, SNAP יכול לשמש גם כדי להגביל באופן כרוני ולשבור שינה7,42, ובכך לחקות תנאים של אובדן שינה כרוני בבני אדם. כמו כן, על ידי מתן גירויים בשלבים של הגדלת תדירות, SNAP יכול לשמש גם כדי למדוד סף עוררות8. ה- SNAP הוא אפוא דרך יעילה לשלול ולהגביל שינה של זבובים, להעריך את התגובה ההומיאוסטטית ולמדוד מאפייני שינה אחרים.
ה- SNAP יכול להתאים לאינקובטור זבובי מעבדה סטנדרטי, אך בהחלט יפריע לזבובים באינקובטור שאינם חלק מהניסוי. למרבה המזל, ה- SNAP יכול להיות ממוקם במיקום מבודד כדי למנוע מזבובים למחסור בשינה מבלי להפריע לניסויים מתמשכים אחרים. מאז שנת ההתאוששות היא שבירה, יש לנקוט זהירות כדי להבטיח כי שנת ההתאוששות מתרחשת במקום שקט.
מחקרים משלימים של מניעת שינה, כלים גנטיים ופרמקולוגיים פותחו כדי לשפר את השינה בזבובים8,43,44. לכן, היכולת לווסת שינה בקלות דו-כיוונית תאפשר מחקר שינה זבוב להמשיך לספק תובנות עמוקות על ויסות שינה ותפקוד.

השינה קרובה לאוניברסלית בבעלי חיים, אך תפקידה עדיין לא ברור. שינה הומאוסטזיס, עלייה מפצה בשינה בעקבות מניעת שינה, הוא מאפיין מגדיר של שינה, ששימש לאפיון מצבי שינה במספר בעלי חיים1,2,3,4,5.
לישון בזבוב יש קווי דמיון רבים עם שינה אנושית, כולל תגובה הומיאוסטטית חזקה לאובדן שינה4,5. מחקרים רבים של שינה בזבוב השתמשו במחסור בשינה הן כדי להסיק את תפקוד השינה על ידי בחינת ההשלכות השליליות המצטברות מהתעוררות ממושכת, והן כדי להבין את ויסות השינה על ידי קביעת המנגנונים הנוירוביולוגיים השולטים בוויסות ההומיאוסטטי של השינה. לכן זבובים מחוסרי שינה הוצגו להפגין ליקויים בלמידה ובזיכרון6,7,8,9,10,11,12, פלסטיות מבנית13,14,15, תשומת לב חזותית16, התאוששות מפגיעה עצבית17,18, הזדווגות והתנהגויות אגרסיביות19, 20, התפשטות תאים21, ותגובות ללחץ חמצוני22,23 אם להזכיר כמה. יתר על כן, חקירות של המנגנונים הנוירוביולוגיים השולטים על שינה ריבאונד הניבו תובנות קריטיות על המכונות העצביות המהוות את הומיאוסטטייק השינה8,9,23,24,25,26,27,28,29 . לבסוף, בנוסף לחשיפת תובנות בסיסיות על תפקוד השינה בבעלי חיים בריאים, מחקרים על מניעת שינה גם הודיעו תובנות על תפקוד השינה במצביםחולים 30,31.
בעוד מניעת שינה היא ללא ספק כלי רב עוצמה, עם כל ניסוי מניעת שינה, חשוב להבחין פנוטיפים הנובעים התעוררות ממושכת, מאלה המושרה על ידי הגירוי המשמש כדי לשמור על החיה ערה. מניעת שינה על ידי מניעת ידיים או טיפול עדין, נחשב בדרך כלל כקביעת התקן למחסור מינימלי בשינה. כאן אנו מתארים פרוטוקול למחסור בשינה זבובים באמצעות מנגנון ביטול השינה (SNAP). ה-SNAP הוא מכשיר המספק גירוי מכני לטסים כל 10s, ושומר על זבובים ערים על ידי גרימת גיאוטקסיס שלילי(איור 1). ה-SNAP מונעת ביעילות זבובים >98% משנת הלילה, אפילו בזבובים עם הנעה בשינה גבוהה8,32. ה-SNAP מכויל על זבובים רגישים למפץ, תסיסה של זבובים ב-SNAP לא פוגעת בזבובים; מניעת שינה עם SNAP מעורר ריבאונד דומה לזה המתקבל על ידי מניעת יד7. ה- SNAP הוא אפוא שיטה חזקה למניעת זבובים בשינה תוך שליטה על ההשפעות של הגירוי המעורר.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Locomotor activity tubes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher Tissue Prep Wax</td><td>Thermo Fisher</td><td>13404-122</td><td>Wax used for sealing tubes</td></tr><tr><td>Glass tubes</td><td>Wale Apparatus</td><td>244050</td><td>We cut 5mm diameter Pyrex glass&amp;nbsp;tubes into 65mm long tubes&amp;nbsp;to record sleep. Pre-cut tubes&amp;nbsp;can also be purchased.</td></tr><tr><td>Nutri Fly Bloomington Formulation fly food</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-113</td><td>Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in.</td></tr><tr><td>Rotary glass cutting tool</td><td>Dremel Multi Pro</td><td>395</td><td>Used to cut 65mm long glass tubes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Monitoring Sleep&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAM System and DAMFileScan software</td><td>Trikinetics</td><td></td><td>Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format</td></tr><tr><td>Data acquisition computer</td><td>Lenovo</td><td>Idea Centre AIO3</td><td>A equivalent computer from any manufacturer can substitute</td></tr><tr><td>Drosophila Activity Monitors</td><td>Trikinetics</td><td>DAM2</td><td>These monitors are used to record flies&#039; locomotor activity</td></tr><tr><td>Environment Monitor</td><td>Trikinetics</td><td>DEnM</td><td>Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded</td></tr><tr><td>Light Controller</td><td>Trikinetics</td><td>LC4</td><td>A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off</td></tr><tr><td>Power Supply Interface Unit for DAM</td><td>Trikinetics</td><td>PSIU-9</td><td>Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data</td></tr><tr><td>RJ11 connector</td><td>7001-64PC</td><td>Multicomp</td><td>DAM monitors accept RJ11 jacks</td></tr><tr><td>Splitters</td><td>Trikinetics</td><td>SPLT5</td><td>Used to connect upto 5 DAM monitors</td></tr><tr><td>Telephone cable wire</td><td>Radioshack</td><td>278-367</td><td>Phone cables to acquire data from DAM monitors</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sleep Deprivation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Gw INSTEK</td><td>GPS-30300</td><td>Power supply for the SNAP</td></tr><tr><td>Sleep Nullifying Apparatus</td><td>Washington University School of Medicine machine shop</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the sleep nullifying apparatus: a highly efficient method of sleep depriving drosophila

הומאוסטזיס שינה, העלייה בשינה שנצפתה לאחר אובדן שינה, הוא אחד הקריטריונים המגדירים המשמשים לזיהוי שינה ברחבי ממלכת החיות. כתוצאה מכך, מניעת שינה והגבלת שינה הם כלים רבי עוצמה המשמשים בדרך כלל כדי לספק תובנה על תפקוד השינה. עם זאת, ניסויים מניעת שינה הם בעייתיים מטבעם בכך גירוי המחסור עצמו עשוי להיות הגורם לשינויים שנצפו בפיזיולוגיה ובהתנהגות. בהתאם לכך, טכניקות מוצלחות של מניעת שינה צריכות לשמור על בעלי חיים ערים, ובאופן אידיאלי, לגרום לריבויישן שינה חזק מבלי לגרום גם למספר רב של השלכות לא מכוונות. כאן, אנו מתארים טכניקה של מניעת שינה עבור Drosophila melanogaster. מנגנון ביטול השינה (SNAP) מנהל גירוי כל 10s כדי לגרום לגיאוטקסיס שלילי. למרות הגירוי צפוי, SNAP מונע ביעילות >95% של שינה בלילה אפילו זבובים עם כונן שינה גבוהה. חשוב לציין, התגובה ההומיאוסטטית הבאה דומה מאוד לזו שהושגה באמצעות מניעת ידיים. התזמון והמרווח של הגירויים ניתן לשנות כדי למזער את אובדן השינה ובכך לבחון השפעות לא ספציפיות של הגירוי על פיזיולוגיה והתנהגות. ה- SNAP יכול לשמש גם להגבלת שינה ולהעריך את סף העוררות. ה- SNAP היא טכניקה רבת עוצמה להפרעות שינה שניתן להשתמש בה כדי להבין טוב יותר את תפקוד השינה.

קנטון S (Cs) שימש כזן פראי. הזבובים נשמרו באור של 12 שעות: לוח זמנים חשוך של 12 שעות, ושינה נמנעה במשך 12 שעות בלילה. בדיקת פרופילי השינה של זבובי Cs ביום הבסיס (bs), יום מניעת שינה (sd) ושני ימי התאוששות (rec1 ו rec2) (איור 2A) עולה כי זבובים היו למעשה מניעת שינה SNAP, ושינה התאוששה במהלך היום עולה בקנה אחד עם דיווחים שנצפו בספרות4,5. האפקטיביות של ה-SNAP בשמירה על זבובים ערים ניכרת גם בפעילות הגבוהה (300-350 ספירות/שעה) המוצגת על ידי זבובים במהלך מניעת שינה(איור 2B). ואכן, ניטור ספירת הפעילות של זבובים במהלך מניעת שינה יכול להיות ברומטר שימושי של האפקטיביות של פרוטוקול הקיפוח ו / או מידה עקיפה של כונן שינה. כאשר מניעת השינה אינה יעילה, הזבובים אינם פעילים באותה מידה במהלך תקופת המחסור. זבובים שנמצאים תחת כונן שינה גבוהה נרדמים במהירות לאחר כל גירוי ואינם חוצים את הצינור ככל35. הן זווית ההטיה של המנגנון, והן מהירות הירידה הם קריטיים כדי להבטיח כי זבובים נשמרים ערים ביעילות מבלי לפגוע בהם. כל מעבדה יכולה לייעל את הזווית והמהירות על ידי התאמת הקפיץ (איור 1B) ו/או הגודל והצורה של המצלמה(איור 1C ואיור 1D,ימינה).
כדי להעריך כמותית את האפקטיביות של מניעת שינה והתאוששות, שינה שאבדה במהלך המחסור ולאחר מכן הוחזרה בימי ההחלמה חושבה עבור כל זבוב בודד (איור 2C). חשוב לציין, לא חל שינוי משמעותי בשינה הבסיסית בין יום המחסור ליום הבסיס (ראו 0-12 שעות באיור 2C)המציין כי השינה יציבה בזבובים אלה. הבדל גדול בשינה בתקופה זו של 12 שעות (למשל, ± 100 דקות) יציע כי השינה לא יציבה. ה-SNAP למעשה מנע מזבובים >98% משנת הלילה שלהם. זבובים התאוששו ~ 20% משנתם ב 12 השעות הראשונות ולא לשחזר שינה נוספת במהלך הלילה, כפי שדווח בעבר. עם זאת, זבובים החלו להתאושש שינה למחרת, כך שהם התאוששו ~ 36% משנתם מעל 48 שעות של התאוששות (איור 2D). 30 - 40% שינה התאוששה מעל 48 שעות אופייני למדי עבור זבובים מסוג בר שינה מקופח באמצעות SNAP.
הומאוסטזיס שינה מאופיין הן על ידי משך שינה מוגברת ועל ידי עומק שינה מוגבר במהלך תקופת ההחלמה לאחר מחסור. איחוד שינה בשעות היום משמש בדרך כלל כהקראה של עומק השינה. ניתן להעריך את איחוד השינה כמשך השינה הממוצע לאורך כל היום(איור 2E). עם זאת, כמו לחץ השינה מתפוגג במהלך ההתאוששות, משך התקף השינה הממוצע יופחת ככל שהיום מתקדם. לכן, לעתים קרובות כדאי לבחון שינויים במשך השינה המרבי שיכול לספק מדד רגיש יותר (איור 2F).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שיטת מניעת שינה</td>
			<td>סה"כ # של ניירות</td>
			<td>% ניירות / טכניקה</td>
			<td>התאוששות ממוצעת מוערכת</td>
		</tr>
<tr>
<td>הצמד</td>
			<td>52</td>
			<td>37.14%</td>
			<td>33 ± 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>מערבולת/רעד אקראי</td>
			<td>49</td>
			<td>35.00%</td>
			<td>18 ± 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>מניעת ידיים</td>
			<td>9</td>
			<td>6.43%</td>
			<td>36 ± 11</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD תרמוגנטי</td>
			<td>15</td>
			<td>10.71%</td>
			<td>36 ± 12</td>
		</tr>
<tr>
<td>לא צוין</td>
			<td>15</td>
			<td>10.71%</td>
			<td>29 ± 10</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: סקירת שיטות שונות של מניעת שינה המשמשות בספרות. רק 116/254 ניירות השתמשו במחסור בשינה. מספר הניירות המשתמשים בכל שיטה = "סה"כ # של ניירות". שבריר הניירות בכל שיטה = "% ניירות / טכניקה". אורך ההתאוששות הממוצע המוערך עבור כל שיטה = "התאוששות ממוצעת מוערכת". SD - מניעת שינה. SNAP - מנגנון ביטול שינה
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>אורך SD</td>
			<td>סה"כ לימודים</td>
		</tr>
<tr>
<td>< 6 שעות</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 שעות</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>>6 שעות ו-< 12 שעות</td>
			<td>17</td>
		</tr>
<tr>
<td>12 שעות</td>
			<td>69</td>
		</tr>
<tr>
<td>>12 שעות ו-<24 שעות</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>24 שעות</td>
			<td>19</td>
		</tr>
<tr>
<td>> 24 שעות</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD כרוני</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>כל SD</td>
			<td>160</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2. משך מניעת השינה המבוצע במחקרים שונים. SD - מניעת שינה
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62105/62105fig01.jpg"> איור 1. השינה מבטלת את האפארטוס (SNAP). A) מבט קדמי על המנגנון. ה- SNAP יכול להכיל 8 צגי פעילות בשתי שורות; סיכות מחזיק לרסן את המסכים במקום. ניתן להתאים את הרגליים כדי לסייע במיקום המנגנון בכיוון הנכון. ב)מבט מקרוב על המנוע והאביב שמטלטלים את המנגנון הלוך ושוב. המנוע הופך מצלמה שמטה את המנגנון בחזרה לעמדה "למעלה" ודוחס את הקפיץ. שחרור הקפיץ מדחיסה מצמיד את המנגנון בחזרה לעמדה "למטה". ג)מבט צדדי שמאלי על המנגנון במצב "למטה". סיכות מחזיק צגי ריסון; חריץ כבל צג מבטיח שכבבי הצג מוחזקים במקומם. רפידות עוזרות לרפד את ההשפעה של המנגנון המתפרץ לעמדה 'למטה'. מימין - מבט מקרוב על המצלמה. ד) מבט בצד שמאל של המנגנון במצב "למעלה". מימין - סיבוב הנגד בכיוון השעון של המצלמה מטה את המנגנון לעמדה 'למעלה'. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/62105/62105fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62105/62105fig02.jpg"> איור 2. תוצאות ניסוי. A) חלקות שינה של Cs טסות במשך ארבעת ימי הניסוי: יום הבסיס (bs), יום מניעת שינה (sd) ויומיים של התאוששות (rec1 ו rec2). ב) פעילות לוקומוטור ממוצעת סופרת זבובים ביום של מחסור בשינה. הזבובים היו מחוסרי שינה משעות 12-24. ג)זמן כמובן של מניעת שינה והתאוששות. זבובי CS היו מחוסרי שינה משעות 12 - 24, והותר להם להתאושש משעה 24 - 72. ה- SNAP מנע למעשה זבובים של >98% שינה, אשר התאושש חלקית מעל 48 שעות (n = 12 זבובים, צעדים חוזרים ונשנים ANOVA לזמן, F [70,1470]= 12.97, p < 10-15). D) אחוז השינה התאושש מעל 48 שעות. זבובים התאוששו ~ 20% משנתם מעל 12 שעות, ו ~ 36% משנתם מעל 48 שעות E) איחוד שינה עבור כל יום של הניסוי כפי שנמדד על ידי משך השינה הממוצע במהלך היום. השינה מאוחדת יותר ביום ההתאוששות הראשון בהשוואה לקו הבסיס (p <0.05, t-test). ו) איחוד שינה עבור כל יום של הניסוי כפי שנמדד על ידי משך שינה מקסימלי במהלך היום. השינה מאוחדת יותר ביום ההתאוששות הראשון בהשוואה לקו הבסיס (p <0.05, t-test). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/62105/62105fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila at JoVE.com

The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila

מניעת שינה היא כלי רב עוצמה לחקור את תפקוד השינה ואת הרגולציה. אנו מתארים פרוטוקול למחסור בשינה Drosophila באמצעות מנגנון ביטול שינה, ולקבוע את היקף השינה ריבאונד הנגרמת על ידי מחסור.

מנגנון ביטול השינה: שיטה יעילה ביותר למניעת שינה של דרוסופילה

Sleep homeostasis, the increase in sleep observed following sleep loss, is one of the defining criteria used to identify sleep throughout the animal ...

the-sleep-nullifying-apparatus-highly-efficient-method-sleep

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila

3.3K Views.  Washington University School of Medicine. מניעת שינה היא כלי רב עוצמה לחקור את תפקוד השינה ואת הרגולציה. אנו מתארים פרוטוקול למחסור בשינה Drosophila באמצעות מנגנון ביטול שינה, ולקבוע את היקף השינה ריבאונד הנגרמת על ידי מחסור.

Video: The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Assaying פעילות של תנועה כדי ללמוד בקצב היממה ושינה פרמטרים תסיסנית</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה<em&gt; דרוזופילה</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Immunology and Infection

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, and issues commands to start or stop feeding. Deciphering the processes underlying the decision-making of timely and moderate feeding carries major implications in our understanding of physiological and psychological disorders related to feeding control. Simple, quantitative, and robust methods are required to measure the food ingestion of animals after experimental manipulation, such as forcibly increasing the activities of certain target neurons. Here, we introduced dye-labeling-based feeding assays to facilitate the neurogenetic study of feeding control in adult fruit flies. We review available feeding assays, and then describe our methods step-by-step from setup to analysis, which combine thermogenetic and optogenetic manipulation of neurons controlling feeding motivation with dye-labeled food intake assay. We also discuss the advantages and limitations of our methods, compared with other feeding assays, to help readers choose an appropriate assay.

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Quantitative food-intake assays with dyed food provide a robust and high-throughput means to evaluate feeding motivation. Combining the food consumption assay with thermogenetic and optogenetic screens is a powerful approach to investigate the neural circuits underlying appetite in adult Drosophila melanogaster.

שילוב של צריכת המזון כמותיים מבחני והפעלת בכפייה נוירונים ללמוד תיאבון בשנת דרוזופילה

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

Behavior

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Assay העדפות אור לחקר Photobehavior מוסדר מולדת ויממה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

The FlyBar: Administering Alcohol to Flies

Fruit flies (Drosophila melanogaster) are an established model for both alcohol research and circadian biology. Recently, we showed that the circadian clock modulates alcohol sensitivity, but not the formation of tolerance. Here, we describe our protocol in detail. Alcohol is administered to the flies using the FlyBar. In this setup, saturated alcohol vapor is mixed with humidified air in set proportions, and administered to the flies in four tubes simultaneously. Flies are reared under standardized conditions in order to minimize variation between the replicates. Three-day old flies of different genotypes or treatments are used for the experiments, preferably by matching flies of two different time points (e.g., CT 5 and CT 17) making direct comparisons possible. During the experiment, flies are exposed for 1 hr&#160;to the pre-determined percentage of alcohol vapor and the number of flies that exhibit the Loss of Righting reflex (LoRR) or sedation are counted every 5 min. The data can be analyzed using three different statistical approaches. The first is to determine the time at which 50% of the flies have lost their righting reflex and use an Analysis of the Variance (ANOVA) to determine whether significant differences exist between time points. The second is to determine the percentage flies that show LoRR after a specified number of minutes, followed by an ANOVA analysis. The last method is to analyze the whole times series using multivariate statistics. The protocol can also be used for non-circadian experiments or comparisons between genotypes.

Drosophila has emerged as a significant model system for dissecting the cellular and molecular underpinnings of behavioral responses to alcohol. Here we present a protocol for the collection of alcohol sensitivity data in a circadian context that can be easily applied to other experiments and is well-suited for undergraduate research.

FlyBar: מתן אלכוהול לזבובים

Fruit flies (Drosophila melanogaster) are an established model for both alcohol research and circadian biology. Recently, we showed that the circadian ...

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human populations, the Drosophila model allows strict control over genetic background, and virtually unlimited numbers of individuals of the same genotype can be reared rapidly under well-controlled environmental conditions without regulatory restrictions and at relatively low cost. Flies exposed to ethanol undergo physiological and behavioral changes that resemble human alcohol intoxication, including loss of postural control, sedation, and development of tolerance. Here, we describe a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The assay is based on video recording of single flies introduced without anesthesia in 24-well cell culture plates in a set-up that enables synchronous initiation of alcohol exposure. The system enables a single person to collect individual ethanol sedation data on as many as 2,000 flies within an 8 h work period. The assay can, in principle, be extended to assess the effects of exposure to any volatile substance and applied to measure effects of acute toxicity of volatiles on other insects, including other fly species.

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Current methods to measure alcohol sensitivity in Drosophila are designed to test groups of flies. We present a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The method does not require specialized tools and can be performed in any laboratory using common materials.

שיטת תפוקה גבוהה עבור מדידת אלכוהול הרגעה זמן של הפרט דרוזופילה מלאנוגסטר

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human ...

An Adjustable High-Definition Imaging System for Behavioral Studies of Drosophila Adults

Drosophila melanogaster is a very powerful model in biological research, but a bad model for photography or videography. This paper describes a simple but effective method to observe and document the behavior or morphology of flies. Flies were placed in a translucent observation chamber c.a. &#216;15 x 5mm (no food inside) or &#216;15 x 12 mm (with an 8 mm-high piece of food inside). After covering with an ultraviolet (UV)/clear filter with high light transmittance, the chamber was placed under a 5-50x zoom stereo microscope, and mini light-emitting diode (LED) video lights were placed on both sides of the microscope to illuminate the chamber to obtain uniform, soft, bright, and nearly shadow-free light. Then, a compact digital camera with 3-5x optical zoom, which can record 1080 P high-definition or higher resolution video (at a frame rate of &#8805;30 fps), was connected to the eyepiece of microscope through a bracket, and photographs or videos were taken through the eyepiece. By adjusting the zoom knob of the zoom stereo microscope, it was very easy to track the flies and take panoramic or detailed close-up images as needed, while the camera recorded everything under the microscope. Because the flies can stay at any position in the chamber, they can be observed and recorded from all directions. The photographs or videos taken are of good image quality. This method can be used both for scientific research and teaching.

An Adjustable High-Definition Imaging System for Behavioral Studies of Drosophila Adults

This protocol describes how to make a simple adult Drosophila behavior observation chamber, and how to take high-definition photographs/videos of the morphology or behavior of different types of fruit flies in the observation chamber through relatively simple and affordable methods.

מערכת הדמיה מתכווננת בחדות גבוהה למחקרים התנהגותיים של מבוגרים Drosophila

Drosophila melanogaster is a very powerful model in biological research, but a bad model for photography or videography. This paper describes a simple but ...

קידום טיפולים בהפרעות שינה: גישת סינון מבוססת דרוזופילה

High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders characterized by shortened sleep duration and fragmented patterns. These sleep disruptions also correlate with an increased risk of various illnesses in the elderly, including diabetes, cardiovascular diseases, and psychological disorders. Unfortunately, existing drugs for sleep disorders are associated with significant side effects such as cognitive impairment and addiction. Consequently, the development of new, safer, and more effective sleep disorder medications is urgently needed. However, the high cost and lengthy experimental duration of current drug screening methods remain limiting factors.
This protocol describes a cost-effective and high-throughput screening method that utilizes Drosophila melanogaster, a species with a highly conserved sleep regulation mechanism compared to mammals, making it an ideal model for studying sleep disorders in the elderly. By administering various small compounds to aged flies, we can assess their effects on sleep disorders. The sleep behaviors of these flies are recorded using an infrared monitoring device and analyzed with the open-source data package Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). This protocol offers a low-cost, reproducible, and efficient screening approach for sleep regulation. Fruit flies, due to their short life cycle, low husbandry cost, and ease of handling, serve as excellent subjects for this method. As an illustration, Reserpine, one of the tested drugs, demonstrated the ability to promote sleep duration in elderly flies, highlighting the effectiveness of this protocol.

מחבר זרקור: התגברות על אתגרים במדידת שינה דרוזופילה באמצעות מערכת DAM 

Presented is a protocol for high-throughput drug screening to improve sleep by monitoring the sleep behavior of fruit flies in an elderly Drosophila model.

בדיקת תרופות במולקולות קטנות בתפוקה גבוהה להפרעות שינה הקשורות לגיל באמצעות Drosophila melanogaster

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders ...

מנגנון ביטול השינה: שיטה יעילה ביותר למניעת שינה של דרוסופילה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Assaying פעילות של תנועה כדי ללמוד בקצב היממה ושינה פרמטרים תסיסנית

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה

שילוב של צריכת המזון כמותיים מבחני והפעלת בכפייה נוירונים ללמוד תיאבון בשנת דרוזופילה

Assay העדפות אור לחקר Photobehavior מוסדר מולדת ויממה ב

FlyBar: מתן אלכוהול לזבובים

שיטת תפוקה גבוהה עבור מדידת אלכוהול הרגעה זמן של הפרט דרוזופילה מלאנוגסטר

מערכת הדמיה מתכווננת בחדות גבוהה למחקרים התנהגותיים של מבוגרים Drosophila

בדיקת תרופות במולקולות קטנות בתפוקה גבוהה להפרעות שינה הקשורות לגיל באמצעות Drosophila melanogaster

בדיקת תרופות במולקולות קטנות בתפוקה גבוהה להפרעות שינה הקשורות לגיל באמצעות Drosophila melanogaster

בדיקת תרופות במולקולות קטנות בתפוקה גבוהה להפרעות שינה הקשורות לגיל באמצעות Drosophila melanogaster