Este modelo pode ser usado para estudar mecanismos celulares envolvendo a patogênese da uveíte posterior humana imunomediada. A implicação desta técnica se estende para o estudo translacional da uveíte humana no monitoramento da eficácia de novos medicamentos e para fornecer uma visão mecanicista sobre a progressão da doença química. A principal vantagem do uso desse modelo é a confiabilidade da indução da doença e o uso de técnicas endoscópicas não invasivas que nos permitem monitorar a progressão da doença.
Aqui descrevemos como induzir a doença e avaliar a patologia usando várias leituras Para preparar o IRBP 1-20 Adjuvante de Freund completo ou CFA, ressussuscite uma quantidade calculada do peptídeo em um volume mínimo de 100% de DMSO. Quando o pó tiver se dissolvido completamente, adicione pequenos volumes de PBS ao tubo até chegar ao volume final calculado de PBS de acordo com o número de camundongos a serem injetados usando agitação suave para misturar a solução. Depois de preparar o Adjuvante de Freund completo, pipete suave e frequentemente a solução para formar uma víscera e emulsão uniformemente distribuída enquanto adiciona a solução peptídica DMSO PBS gota a gota a uma proporção de um para um para a suspensão.
Para arejar as soluções, use uma pipeta de 1000 microlitros ajustada para 700 microlitros para pipetar repetidamente a solução até que uma emulsão espessa e cremosa tenha sido obtida. Antes de injetar a suspensão peptídica, coloque cada rato a ser injetado em uma gaiola separada e use uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 23 para fornecer por via intraperitoneal 1,5 microgramas de toxina Bordetella pertussis em 100 microlitros de meio RPMI 1640 suplementado com soro de rato a 1% para cada animal. Quando a solução de toxina pertussis foi injetada, o rato deve ser mantido em uma posição semelhante a um scruff e a pele comprimida para formar uma estrutura semelhante a uma tenda na parte de trás do pescoço.
Enfie a agulha no espaço entre o dedo e o polegar e injete 200 microlitros da emulsão IRBP na pele da tenda, mantendo a pressão após a injeção e girando a cabeça da agulha para fechar a pele antes da retração. Para pontuar a doença clínica, no dia 21 após a injeção, confirmar a falta de resposta ao reflexo pétalo no rato injetado peptídeo anestesiado e conter o animal em um scruff. Aplique topicamente 1%tropicamida e 2%fenilefrina na córnea de cada olho imediatamente após a injeção.
Quando as pupilas estiverem totalmente dilatadas, coloque o rato num palco de microscópio especialmente construído. Posicione o microscópio para acesso total à retina. Ajuste a ocular durante todo o processo de imagem, conforme necessário, para ver o disco óptico e a retina e adquira imagens de toda a área da retina, ajustando e cobrindo todos os cantos da periferia.
Para medir o vazamento do vaso, administrar 100 microlitros de fluoresceína a 2% por via subcutânea na parte de trás do pescoço e reposicionar o camundongo de modo que a retina esteja centrada no meio da imagem ao vivo. Ajuste o fundoscópio para um filtro de excitação de luz azul a 465 a 490 nanômetros antes de adquirir uma imagem de cada um em 1,5 e sete minutos após a injeção fluorescente. Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, por via intraperitoneal um anti-sedação injetável para recuperação e coloque o rato numa gaiola num tapete pré-aquecido com acesso a uma dieta húmida embebida com monitorização até que o rato recupere a consciência.
Para a pontuação clínica da doença das imagens, baseie a avaliação clínica na gravidade da inflamação do disco óptico, manguito do vaso da retina, infiltrado do tecido retiniano e dano estrutural. Pontuar cada um desses parâmetros em uma escala de um a cinco. O total coletivo é representativo da doença clínica para todo o olho, com uma pontuação máxima de 20 obteníveis por olho.
Após a imagem do fundo de olho para o desfecho clínico final do estudo, eutanasie o rato. Para análise histológica, afaste as pálpebras para o acesso a todo o olho, em seguida, coloque pinças curvas atrás do globo para agarrar o tecido conjuntivo orbital e o nervo óptico e enuclear o olho. Coloque o olho enucleado em um a cinco mililitros de glutaraldeído a 4% por um mínimo de 15 minutos antes de transferir o órgão para um a cinco mililitros de 10% de formaldeído por pelo menos 24 horas.
Após a coloração histológica do tecido, de acordo com os protocolos padrão, foram atribuídos escores em uma escala de zero a três com base no nível de infiltração de células imunes e no grau de dano à retina. As alterações fundososcópicas são classificadas durante a progressão da doença como alterações inflamatórias que incluem tecido da retina e inflamação vascular e do disco óptico e danos estruturais da retina, além de alterações histológicas baseadas na infiltração de células imunes e deficiências estruturais. Essas alterações clínicas e histopatológicas podem ser graduadas e pontuadas para avaliar a progressão da doença e a eficácia da intervenção terapêutica.
O vazamento vascular também é uma característica patológica do modelo e da uveíte humana. Como ilustrado nesta análise, a fluoresceína pode ser usada para visualizar o vazamento vascular como outra leitura deste modelo. É essencial que os pesquisadores garantam que a emulsão seja preparada corretamente, sem sinais de separação entre as soluções.
Eles devem ser misturados completamente e o produto final deve ser suave na textura. Este procedimento pode ser combinado com outros métodos de administração de drogas e com citometria para fenotipagem infiltrando populações de células imunes da retina.
