Dieses Modell kann verwendet werden, um zelluläre Mechanismen zu untersuchen, die die Pathogenese der immunvermittelten humanen posterioren Uveitis betreffen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die translationale Untersuchung der menschlichen Uveitis bei der Überwachung der Wirksamkeit neuartiger Medikamente und auf die Bereitstellung mechanistischer Einblicke in den chemischen Krankheitsverlauf. Der Hauptvorteil der Verwendung dieses Modells ist die Zuverlässigkeit der Krankheitsinduktion und die Verwendung nicht-invasiver endoskopischer Techniken, die es uns ermöglichen, das Fortschreiten der Krankheit zu überwachen.
Hier beschreiben wir, wie man die Krankheit induziert und die Pathologie anhand mehrerer Ablesungen beurteilt Um IRBP 1-20 vollständig Freund's Adjuvans oder CFA vorzubereiten, resuspendieren Sie eine berechnete Menge des Peptids in einem Mindestvolumen von 100% DMSO. Wenn sich das Pulver vollständig aufgelöst hat, geben Sie kleine Mengen PBS in das Röhrchen, bis das endgültige berechnete PBS-Volumen entsprechend der Anzahl der zu injizierenden Mäuse unter leichtem Rühren erreicht ist, um die Lösung zu mischen. Nach der Herstellung des vollständigen Freund'schen Adjuvans wird die Lösung vorsichtig und häufig pipettiert, um eine viskose und gleichmäßig verteilte Emulsion zu bilden, während die DMSO-PBS-Peptidlösung tropfenweise im Verhältnis eins zu eins zur Suspension gegeben wird.
Um die Lösungen zu belüften, verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, die auf 700 Mikroliter eingestellt ist, um die Lösung wiederholt zu pipettieren, bis eine dicke, cremige Emulsion erhalten wurde. Bevor Sie die Peptidsuspension injizieren, legen Sie jede Maus, die injiziert werden soll, in einen separaten Käfig und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 23-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um intraperitoneal 1,5 Mikrogramm Bordetella pertussis-Toxin in 100 Mikroliter RPMI 1640-Medium zu verabreichen, das mit 1% Mausserum ergänzt ist. Wenn Pertussis-Toxin-Lösung injiziert wurde, sollte die Maus in einer schmutzigen Position gehalten und die Haut eingeklemmt werden, um eine zeltartige Struktur im Nacken zu bilden.
Fädeln Sie die Nadel in den Raum zwischen Finger und Daumen und injizieren Sie 200 Mikroliter der IRBP-Emulsion auf die Zelthaut, halten Sie den Druck nach der Injektion aufrecht und drehen Sie den Nadelkopf, um die Haut vor dem Zurückziehen zu schließen. Um die klinische Erkrankung zu bewerten, bestätigen Sie am 21. Tag nach der Injektion eine fehlende Reaktion auf den Blütenreflex in der anästhesierten Peptid-injizierten Maus und halten Sie das Tier in einem Scruff zurück. Topisch 1% Tropicamid und 2% Phenylephrin unmittelbar nach der Injektion auf die Hornhaut jedes Auges auftragen.
Wenn sich die Pupillen vollständig erweitert haben, legen Sie die Maus auf einen speziell dafür angefertigten Mikroskoptisch. Positionieren Sie das Mikroskop so, dass Sie vollen Zugang zur Netzhaut haben. Passen Sie das Okular während des gesamten Bildgebungsprozesses nach Bedarf an, um die Sehscheibe und die Netzhaut zu sehen und Bilder des gesamten Netzhautbereichs aufzunehmen, wobei alle Ecken der Peripherie angepasst und abgedeckt werden.
Um die Gefäßleckage zu messen, verabreichen Sie 100 Mikroliter 2% Fluorescein subkutan im Nacken und positionieren Sie die Maus so, dass sich die Netzhaut in der Mitte des Livebildes befindet. Stellen Sie das Fundoskop auf einen Blaulicht-Anregungsfilter bei 465 bis 490 Nanometern ein, bevor Sie 1,5 und sieben Minuten nach der Fluoreszenzinjektion ein Bild von jedem aufnehmen. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, wird intraperitoneal eine Anti-Sedierungs-Injektion zur Genesung verabreicht und die Maus in einen Käfig auf einer vorgewärmten Matte mit Zugang zu nassgetränktem Futter mit Überwachung gesetzt, bis die Maus das Bewusstsein wiedererlangt.
Für die klinische Krankheitsbewertung der Bilder basiert die klinische Beurteilung auf dem Schweregrad der Entzündung der Sehscheibe, der retinalen Gefäßmanschette, des Infiltrats des Netzhautgewebes und der strukturellen Schädigung. Bewerten Sie jeden dieser Parameter auf einer Skala von eins bis fünf. Die Gesamtsumme ist repräsentativ für die klinische Erkrankung für das gesamte Auge mit einer maximalen Punktzahl von 20 pro Auge.
Nach der Fundusbildgebung für den letzten klinischen Endpunkt der Studie wird die Maus eingeschläfert. Für die histologische Analyse trennen Sie die Augenlider für den Zugang zum gesamten Auge, platzieren Sie dann eine gekrümmte Pinzette hinter der Kugel, um das orbitale Bindegewebe und den Sehnerv zu erfassen und das Auge zu enukleieren. Legen Sie das entkernte Auge für mindestens 15 Minuten in ein bis fünf Milliliter 4% Glutaraldehyd, bevor Sie das Organ für mindestens 24 Stunden auf ein bis fünf Milliliter 10% Formaldehyd übertragen.
Nach histologischer Gewebefärbung werden nach Standardprotokollen Werte auf einer Skala von null bis drei zugewiesen, basierend auf dem Grad der Infiltration von Immunzellen und dem Grad der Netzhautschädigung. Fundoskopische Veränderungen werden während des Fortschreitens der Erkrankung als entzündliche Veränderungen klassifiziert, die neben histologischen Veränderungen aufgrund infiltrierender Immunzellen und struktureller Beeinträchtigungen auch Netzhautgewebe und Gefäß- und Bandscheibenentzündungen sowie retinale Strukturschäden umfassen. Diese klinischen und histopathologischen Veränderungen können abgestuft und bewertet werden, um das Fortschreiten der Erkrankung zu beurteilen und die Wirksamkeit therapeutischer Interventionen zu bewerten.
Die vaskuläre Leckage ist auch ein pathologisches Merkmal des Modells und der menschlichen Uveitis. Wie in dieser Analyse dargestellt, kann Fluorescein verwendet werden, um vaskuläre Leckage als eine weitere Anzeige dieses Modells zu visualisieren. Für die Forscher ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Emulsion korrekt hergestellt wird, ohne Anzeichen einer Trennung zwischen den Lösungen.
Sie sollten gründlich gemischt werden und das Endprodukt sollte eine glatte Textur aufweisen. Dieses Verfahren kann mit anderen Methoden der Arzneimittelverabreichung und mit der Zytometrie zur Phänotypisierung infiltrierender retinaler Immunzellpopulationen kombiniert werden.
