Queremos criar um modelo de AVC que produza coágulo sanguíneo semelhante às amostras de pacientes e responda à terapia trombolítica clinicamente relevante. Portanto, modificamos o modelo clássico de AVC fototrombótico e misturamos trombina e o corante fotodinâmico rosa bengala antes da fotoativação. Estamos satisfeitos que este procedimento realmente cria coágulos sanguíneos que são altamente sensíveis à trombólise mediada por tPA.
Este modelo de AVC fototrombótico modificado usa procedimentos cirúrgicos muito simples com uma baixa taxa de mortalidade produziu um tamanho e localização do infarto altamente consistentes. Você também produz um coágulo sanguíneo misto de fibrina e plaquetas que são semelhantes aos do paciente com AVC agudo. Portanto, achamos que é bastante útil para a pesquisa pré-clínica de AVC desenvolver terapias trombolíticas mais eficazes.
Esperamos que mais pessoas usem nosso modelo. Quem demonstrará o procedimento será o Dr. Yu-Yo Sun, nosso professor assistente de pesquisa em nosso grupo. 30 minutos antes da cirurgia, prepare o rato injetando um analgésico.
Depois de anestesiar o mouse, execute uma pinça do dedo do pé para garantir que ele esteja totalmente anestesiado. Em seguida, remova os pelos do pescoço esquerdo e da cabeça com creme de depilação. Coloque o rato sobre o adaptador de pequenos animais em posição supina e esterilize a área da pele cirúrgica limpando-a com três toques alternados de iodopovidona e etanol a 70%.
Sob um microscópio dissecante, faça uma incisão cervical esquerda de 0,5 centímetro usando uma microtesoura e pinça reta a cerca de 0,2 centímetros lateral à linha média. Em seguida, com um par de pinças finas serrilhadas, afaste o tecido mole e a fáscia para expor a ACCE. Em seguida, usando um par de pinças lisas finas, separe cuidadosamente a ACCE do nervo vago.
Coloque uma sutura permanente de duplo nó ao redor da ACE usando uma sutura de seda 5-0. Vire o mouse para uma posição prona e gire o rolo do clipe do nariz em 15 graus. Em seguida, esterilize a área cirúrgica limpando a pele com três toques alternados de Betadine e etanol 70%.
Faça uma incisão de 0,8 centímetro no couro cabeludo usando uma microtesoura e pinça reta ao longo do olho esquerdo e orelha para expor o músculo temporal. Em seguida, fazer uma incisão de 0,5 centímetro ao longo da borda do músculo temporal no osso parietal esquerdo. Em seguida, faça uma segunda incisão vertical de 0,3 centímetro no músculo temporal e retraia o músculo para expor a borda do osso parietal e do osso escamoso.
Certifique-se de visualizar o ponto de referência da sutura coronal entre os ossos frontal e parietal. Em seguida, umedeça o crânio aplicando soro fisiológico estéril para revelar a ACM esquerda e marque o ramo proximal da ACM no osso escamoso com um marcador. Desenhe suavemente um círculo de um milímetro de diâmetro ao redor desta área marcada com uma broca dentária pneumática.
Em seguida, afinar o crânio cerca de 0,2 milímetros de profundidade sem tocar a dura-máter por baixo. Pare a perfuração quando uma camada muito fina de osso permanecer. Em seguida, misture a solução de trombina e rosa bengala com base no peso corporal do camundongo e injete lentamente a mistura no seio retroorbital com uma agulha de calibre 31.
Aplique pomada ocular em ambos os olhos para evitar o ressecamento. Aplique o iluminador com uma luz laser de 532 nanômetros no local perfurado a uma distância de duas polegadas por 20 minutos. Visualize a iluminação no ramo proximal da ACM através de óculos de projeção a laser.
Após 20 minutos, pare a iluminação a laser. Faça uma janela craniana de três milímetros de diâmetro no osso parietal do crânio e coloque um vidro de cobertura sobre ele. Em seguida, localize a ACM distal sob uma lente objetiva de imersão em água 20x.
Rotular a plaqueta circulante por injeção na veia caudal do anticorpo conjugado anti-GP1b-beta DyLight 488 cinco minutos antes da aquisição de imagens. Em seguida, injetar retro-orbitalmente a mistura de trombina e solução de rosa bengala. Fotoative a ACM usando um sistema de laser de 532 nanômetros com um feixe de laser de 10 micrômetros de diâmetro e registre a imagem até a formação do trombo.
Para a administração de tPA, coloque o animal anestesiado em uma almofada quente de 37 graus Celsius. Envolva sua cauda com uma gaze úmida quente de 45 graus Celsius por um minuto no ponto de tempo pós-fotoativação selecionado. Em seguida, injete o tPA humano recombinante através da veia da cauda.
Injetar 50% em bolus e infundir os restantes 50% durante 30 minutos utilizando uma bomba de perfusão. Para monitorar o fluxo sanguíneo cerebral, faça uma incisão na linha média do couro cabeludo com o crânio exposto. Hidrate o crânio com soro fisiológico estéril e aplique suavemente o gel de ultrassom sobre ele, evitando bolhas de cabelo ou ar no gel.
Monitore o fluxo sanguíneo cerebral em ambos os hemisférios cerebrais sob o imageador de contraste speckle laser por 10 minutos. A marcação por imunofluorescência mostra que, na fototrombose baseada no corante rosa bengala, o ramo da ACM estava densamente preenchido com plaquetas CD41-positivas e pouca fibrina. Em contraste, na fototrombose de trombina mais rosa bengala, o ramo da ACM foi ocluído por coágulos de plaquetas e fibrina aleatoriamente misturados.
A análise de immunoblotting mostrou um aumento maior que duas vezes na deposição de fibrina no hemisfério ipsilateral na fototrombose de trombina mais rosa bengala em comparação com a rosa bengala isoladamente. Imagens intravitais baseadas em microscópio confocal mostraram que uma injeção intravenosa de trombina falhou em induzir agregados plaquetários, mesmo sob iluminação a laser. As plaquetas formaram coágulos homogêneos no modelo de fototrombose da rosa bengala, mas agregados desiguais com múltiplas regiões tênues no modelo trombina mais rosa bengala.
O FSC do mesmo camundongo pré e 24 horas pós-tPA versus tratamento com veículo foi medido por meio de contraste speckle laser e normalizado para o hemisfério contralateral. Na fototrombose da rosa bengala, o tratamento com tPA levou a uma tendência de recuperação do FSC, particularmente na área de borda isquêmica em comparação com camundongos tratados com veículo. Na fototrombose da trombina associada à rosa bengala, a recuperação do FSC em camundongos tratados com tPA foi mais proeminente, e os ramos proximais da ACM frequentemente tornaram-se visíveis em 24 horas.
Na fototrombose de rosa bengala, um tamanho de infarto semelhante foi detectado em camundongos tratados com veículo e tPA. Em contraste, na trombina associada à fototrombose de rosa bengala, o tratamento lítico tPA reduziu significativamente o infarto em 0,5, uma ou duas horas, mas não em seis horas após a fotoativação em comparação com camundongos tratados com veículo, a geração de fibrina mediada por trombina é crucial para a formação de trombo nesse procedimento. Este método pode ser usado para investigar a composição do coágulo e para estudar mais profundamente tratamentos trombolíticos.
Após esse procedimento, outros métodos de terapia de trombólise podem ser aplicados e a eficácia posterior determinada. A adição de trombina torna possível ajustar a composição do coágulo de pobre em fibrina para rica em fibrina, permitindo que os pesquisadores desenvolvam estratégias terapêuticas clinicamente relevantes.
