우리는 환자 샘플과 유사한 혈전을 생성하고 임상적 관련 혈전용해 요법에 반응하는 뇌졸중 모델을 만들고자 합니다. 따라서 우리는 고전적인 광혈전 뇌졸중 모델을 수정하고 광활성화 전에 트롬빈과 광역학적 염료 로즈 벵골을 혼합합니다. 우리는 이 시술이 실제로 tPA 매개 혈전용해에 매우 민감한 혈전을 생성한다는 것을 기쁘게 생각합니다.
이 수정된 광혈전 뇌졸중 모델은 사망률이 낮은 매우 간단한 수술 절차를 사용하여 매우 일관된 경색 크기와 위치를 생성했습니다. 또한 급성 뇌졸중 환자와 유사한 피브린과 혈소판이 혼합된 혈전이 생성됩니다. 따라서 전임상 뇌졸중 연구에서 보다 효과적인 혈전용해 치료법을 개발하는 데 매우 유용하다고 생각합니다.
더 많은 사람들이 우리 모델을 사용하기를 바랍니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 그룹의 연구 조교수인 Dr.Yu-Yo Sun이 될 것입니다. 수술 30분 전에 진통제를 주사하여 쥐를 준비합니다.
마우스를 마취한 후 발가락 꼬집기를 수행하여 완전히 마취되었는지 확인합니다. 그런 다음 제모 크림으로 왼쪽 목과 머리의 털을 제거합니다. 작은 동물 어댑터에 마우스를 누운 자세로 놓고 포비돈 요오드와 70% 에탄올을 번갈아 세 번 번갈아 가며 문질러 수술 피부 부위를 소독합니다.
해부 현미경으로 정중선 측면 약 0.2cm에서 마이크로 가위와 직선 집게를 사용하여 0.5cm 왼쪽 경추를 절개합니다. 그런 다음 미세한 톱니 모양의 집게를 사용하여 연조직과 근막을 당겨 LCCA를 노출시킵니다. 그런 다음 한 쌍의 가늘고 부드러운 집게를 사용하여 LCCA를 미주 신경에서 조심스럽게 분리합니다.
5-0 실크 봉합사를 사용하여 LCCA 주위에 영구적인 이중 매듭 봉합사를 놓습니다. 마우스를 엎드린 자세로 뒤집고 노즈 클립 롤을 15도 회전합니다. 그런 다음 베타딘과 70% 에탄올을 번갈아 세 번 번갈아 가며 문질러 수술 부위를 소독합니다.
왼쪽 눈과 귀를 따라 마이크로 가위와 직선 집게를 사용하여 두피를 0.8cm 절개하여 측두근을 노출시킵니다. 다음으로 왼쪽 두정골의 측두근 가장자리를 따라 0.5cm 절개합니다. 그런 다음 측두근을 0.3cm 수직으로 절개하고 근육을 수축시켜 정수리골과 편평골의 가장자리를 노출시킵니다.
전두골과 두정골 사이의 관상동맥 봉합사의 랜드마크를 시각화해야 합니다. 다음으로, 멸균 식염수를 발라 두개골을 적셔 왼쪽 MCA를 드러내고 편평 뼈의 근위 MCA 가지를 마커로 표시합니다. 공압 치과 드릴로 이 표시된 영역을 둘러싸는 직경 1mm의 원을 부드럽게 그립니다.
그런 다음 두개골 아래쪽을 건드리지 않고 약 0.2mm 깊이로 두개골을 얇게 만듭니다. 매우 얇은 뼈 층이 남아 있으면 드릴링을 중지하십시오. 다음으로, 쥐의 체중에 따라 트롬빈과 로즈 벵골 용액을 혼합하고 31게이지 바늘로 혼합물을 후안와 부비동에 천천히 주입합니다.
건조함을 방지하기 위해 양쪽 눈에 눈 연고를 바릅니다. 2인치 거리 내에서 천공된 부위에 532나노미터 레이저 광으로 조명기를 20분 동안 적용합니다. 레이저 프로젝션 고글을 통해 MCA의 근위 분기에서 조명을 시각화합니다.
20분 후 레이저 조명을 멈춥니다. 두개골의 두정골에 직경 3mm의 두개골 창을 만들고 그 위에 덮개 유리를 놓습니다. 그런 다음 20x 침수 대물렌즈 아래에서 원위 MCA를 찾습니다.
이미징 5분 전에 DyLight 488 접합 항-GP1b-베타 항체의 꼬리 정맥 주사로 순환 혈소판에 라벨링합니다. 그런 다음 트롬빈과 로즈 벵골 용액 혼합물을 역궤도로 주입합니다. 직경 10마이크로미터의 레이저 빔이 있는 532나노미터 레이저 시스템을 사용하여 MCA를 광활성화하고 혈전이 형성될 때까지 이미지를 기록합니다.
tPA 투여를 위해 마취된 동물을 섭씨 37도의 따뜻한 패드에 놓습니다. 선택한 광활성화 후 시간 지점에서 섭씨 45도의 따뜻한 젖은 거즈로 꼬리를 1분 동안 감쌉니다. 다음으로, 꼬리 정맥을 통해 재조합 인간 tPA를 주입합니다.
50%를 볼루스로 주입하고 나머지 50%를 주입 펌프를 사용하여 30분에 걸쳐 주입합니다. 뇌 혈류를 모니터링하려면 두개골이 노출된 두피에 정중선을 절개합니다. 멸균 식염수로 두개골에 수분을 공급하고 초음파 젤을 부드럽게 바르고 젤에 머리카락이나 기포가 생기지 않도록 합니다.
10분 동안 레이저 스페클 콘트라스트 이미저 아래에서 양쪽 대뇌 반구의 대뇌 혈류를 모니터링합니다. 면역형광 표지는 로즈 벵골 염료 기반 광혈전증에서 MCA 가지가 CD41 양성 혈소판과 약간의 피브린으로 조밀하게 채워져 있음을 보여줍니다. 대조적으로, 트롬빈과 로즈 벵골 광혈전증에서 MCA 가지는 무작위로 혼합된 혈소판과 피브린 혈전에 의해 폐색되었습니다.
면역블로팅 분석 결과, 로즈 벵골 단독에 비해 트롬빈과 로즈 벵골 광혈전증의 동측 반구에서 피브린 침착이 2배 이상 증가한 것으로 나타났습니다. 컨포칼 현미경 기반 생체 내 이미징은 정맥 주사 트롬빈 주사가 레이저 조명 아래에서도 혈소판 응집체를 유도하지 못하는 것을 보여주었습니다. 혈소판은 로즈 벵골 광혈전증 모델에서는 균질한 응고를 형성했지만, 트롬빈과 로즈 벵골 모델에서는 여러 희미한 영역을 가진 고르지 않은 응집체를 형성했습니다.
tPA 치료 전 및 24시간 후 동일한 마우스의 CBF와 차량 치료 대비 레이저 스페클 조영제 이미징으로 측정하고 반대측 반구로 정규화했습니다. 로즈 벵골 광혈전증에서 tPA 치료는 특히 차량 처리 마우스에 비해 허혈성 경계 영역에서 CBF 회복 추세를 이끌었습니다. 트롬빈 플러스 로즈 벵골 광혈전증에서, tPA 처리 마우스에서 CBF의 회복이 더 두드러졌으며, 근위 MCA 가지가 종종 24시간에 가시화되었습니다.
로즈 벵골 광혈전증(rose bengal photothrombosis)의 경우, 비히클 처리된 마우스와 tPA를 처리한 마우스에서 유사한 경색 크기가 검출되었습니다. 대조적으로, 트롬빈과 로즈 벵골 광혈전증의 경우, tPA 용해 처리는 0.5시간, 1시간 또는 2시간에 경색을 유의하게 감소시켰지만, 비히클 처리된 마우스에 비해 광활성화 후 6시간에는 감소하지 않았으며, 이 과정에서 혈전 형성에 혈전 형성에 중요한 혈전 매개 피브린 생성이 중요합니다. 이 방법은 혈전 조성을 조사하고 혈전 용해 치료를 추가로 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
이 시술 후, 혈전용해 요법의 다른 방법을 적용할 수 있고 나중에 효능을 결정할 수 있습니다. 트롬빈을 첨가하면 혈전 조성을 피브린 부족에서 피브린 풍부로 조정할 수 있어 연구자들이 임상적으로 관련된 치료 전략을 개발할 수 있습니다.
