Este protocolo utiliza microdisseção de captura a laser juntamente com RNA-Sequenciamento para obter transcrições espaciais e temporais de células específicas em plantas de interesses, utilizando pequenas quantidades de materiais biológicos. A principal vantagem da técnica de laser é que facilita a visualização direta das células dentro do contexto normal do tecido, permitindo que as células discretas sejam precisamente isoladas de forma livre de contato. Embora este protocolo seja otimizado para o isolamento das células vegetais, ele pode ser aplicado à maioria das células que podem ser identificadas estologicamente.
Uma boa preparação para a amostra é fundamental. Portanto, uma realização desta técnica pela primeira vez, a otimização do suporte da fixação do tecido e a incorporação é importante antes da Microdisseção de Captura a Laser. Antes de coletar a amostra de tecido, prepare um fixador adequado à espécie e ao tipo de tecido a ser colhido.
Para a semente de cevada, corte as amostras de sementes ao meio antes de submergir as amostras em pelo menos um volume de 10 X de fixação gelada. Use infiltração a vácuo para acelerar a penetração do fixador. O tecido deve afundar até o final da infiltração, em seguida, refrescar o fixador para uma incubação durante a noite e transferir as amostras em para processamento de tecidos.
Coloque as fitas carregadas de tecido na cesta metálica de um processador automático e coloque a cesta de metal ao seu suporte acima da primeira câmara. Defina o programa nos painéis de controle do processador de tecido e pressione comece a iniciar o programa de processamento automático. O sistema desidratará as amostras mergulhando as fitas em uma série gradiente de etanol por 90 minutos por concentração, conforme indicado.
Após a última imersão do etanol, o sistema submergirá as amostras em gradientes de xileno por 90 minutos por solução, conforme indicado. Seguido por imersões de 290 minutos em parafina derretida a 55 a 60 graus Celsius. Na manhã seguinte, remova as fitas infiltradas da parafina do processador de tecido e prossiga para a incorporação da parafina.
Na manhã seguinte, use fórceps finos para transferir as amostras do processo em moldes de tamanho adequado e adicionar parafina derretida sobre cada amostra. Para sementes de cevada, oriente as amostras na parafina longitudinalmente à direção de corte para facilitar a aquisição de seções longitudinais. Coloque um limpo sobre o molde e certifique-se de que todo o esteja totalmente coberto com um volume suficiente de parafina para fixar a amostra no.
Em seguida, coloque o molde em uma placa fria por 10 a 20 minutos até que a parafina esteja definida antes de soltar o bloco do molde. Para preparar uma lâmina de membrana PEN, submergir os slides na solução desativação RNS por três segundos seguidos por duas lavagens breves e água tratada DEPC. Em seguida, dirija os slides em uma incubadora de 370 graus Celsius para remover qualquer solução restante e UV tratar os slides em um gabinete de fluxo laminar por 30 minutos para melhorar sua parafina não avelãs.
Para uma seção de tecido amostral, coloque os blocos de parafina na placa fria e encha o banho de água com a água tratada DO DEPC, depois aqueça até 42 graus Celsius. Corte blocos até a profundidade da região de interesse e separe os blocos de parafina a uma espessura de seis a 10 mícrons. Um bloco bem seccionado formará uma fita na borda da lâmina.
Use uma pinça fina para transferir suavemente fitas do microtome para o banho de água, tomando cuidado para que a fita fique plana sobre a superfície da água. Para coletar as seções, segurando um slide em um ângulo de 45 graus, use um movimento ascendente para levantar uma fita da água para fora da lâmina e use um tecido livre de fiapos para remover cuidadosamente o excesso de água. Quando todas as seções tiverem sido coletadas, lave os slides com 320 segundos de lavagem em xileno seguido de 230 segundos em 100% etanol e 230 segundos em 70% de etanol.
Para microdissectar células de interesse das seções de tecido desparrafinado e seco, carregue lâminas nos três slots de microscópio LCM e tubo de coleta de carga nos slots disponíveis. Mova o estágio para localizar a região da amostra que precisa ser cortada e cortar um segmento em branco livre de tecido na lâmina da membrana. Para otimizar a velocidade de corte e o corte na pressão a laser catapultando energia e foco.
Use as ferramentas de desenho para delinear a área de interesse no tecido e usar os parâmetros otimizados e a função Robo LPC para catapultar células para as tampas adesivas. Selecione a bandeira da lista de elementos para usar a ferramenta de sinalização para marcar as regiões de interesse. Verifique o botão de verificação da tampa para inspecionar a tampa adesiva, para confirmar se as amostras foram capturadas.
Normalmente são necessárias 10 a 15 seções por tampa para extração de RNA. Imediatamente após a aquisição de todas as amostras, proceda imediatamente à extração de RNA para evitar a degradação do RNA. Após a extração de RNA e a amplificação do RNA, use um sistema automatizado de eletroforese, de acordo com as instruções do fabricante para quantificar e qualificar o RNA antissense.
Neste estudo, LCM, o sequenciamento de RNA foi aplicado a um pequeno número de células de três órgãos embriões, a cada oito horas durante um curso de tempo de 48 horas durante a germinação. É importante ajustar corretamente os parâmetros de corte para permitir que o tecido de interesse seja precisamente cortado e desalojado do tecido circundante sem queimar a borda da área selecionada. A ramificação do RNA total antes da amplificação do RNA permite a detecção de bandas eletroforéticas distintas e picos fluorescentes de subunidades ribossômicas de 18 e 28S em amostras de RNA de boa qualidade.
O RNA antissense sintetizado com sucesso exibirá uma distribuição de tamanho simétrico unimodal de 100 a 1000 nucleotídeos com um pico em torno de 300 nucleotídeos após duas rodadas de amplificação. A plotagem em escala multidimensional de genes expressos nos diferentes tecidos ao longo de 48 horas de germinação, ilustra uma maior semelhança entre amostras de um único tecido do que entre amostras do mesmo ponto de tempo, mas tecidos diferentes. O número de genes expressos diferencialmente aumenta progressivamente ao longo da germinação em cada tecido em relação ao ponto de tempo de zero hora do tecido.
Nesta análise representativa, 25% da plumule, 34% de radículo e 41% dos genes expressos diferencialmente foram expressos exclusivamente dentro de cada tecido. É importante ajustar corretamente os parâmetros de corte para uma excisão precisa e desalojadeira da área seletora do tecido circundante sem queimar a borda da região selecionada. Com métodos aprimorados de cromatina e purificação de proteínas, e o aprimoramento do instrumento de espectrometria de massa, o LCM pode ser usado para implantes de estudos epigenômicos e proteômicos específicos do tipo celular.
