激光捕获微分块RNA-测序空间和时间组织特异性基因表达分析

该协议使用激光捕获微分布与RNA测序相结合，利用少量生物材料，从感兴趣的植物中的特定细胞获取空间和时间转录组。激光技术的主要优点是，它便于在正常组织环境中直接可视化细胞，使离散细胞以自由接触的方式精确分离。虽然此协议针对植物细胞的分离进行了优化，但它可以应用于大多数可进行病理识别的细胞。

良好的样品制备至关重要。因此，在激光捕获微切除之前，首次执行此技术时，组织固定和嵌入的道具优化非常重要。在收集组织样本之前，准备适合要收获的物种和组织类型的固定器。

对于大麦种子，先将种子样品切成两半，然后再将样品淹没到至少10 X体积的冰冷固定液中。使用真空渗透加速固定装置的渗透。组织应在渗透结束时下沉，然后刷新固定装置进行隔夜孵育，然后将样品转移到盒式磁带中进行组织处理。

将装有组织的盒式磁带放入自动处理器的金属篮中，然后将金属篮连接到其支架上室 1 上方的支架上。将程序设置在组织处理器的控制面板上，然后按开始开始自动处理程序。系统将脱水样品，如所示，将盒式磁带浸入乙醇的梯度序列中，每浓度90分钟。

上次乙醇浸入后，系统将每溶液以二甲苯梯度浸入样品 90 分钟。随后在55至60摄氏度的熔融石蜡中浸泡290分钟。第二天早上，从组织处理器上取出石蜡渗入的盒式磁带，然后进入石蜡嵌入。

第二天早上，使用细钳将工艺样品转移到适当大小的模具中，并在每个样品上添加熔融石蜡。对于大麦种子，将石蜡中的样品纵向定向到切割方向，以方便获得纵向部分。将干净的盒式磁带放在模具上，确保整个盒式磁带完全覆盖，并充分覆盖足够的石蜡，将样品固定到盒式磁带上。

然后将模具放在冷板上 10 到 20 分钟，直到从模具中释放块之前设置石蜡。要准备 PEN 膜幻灯片，请将幻灯片淹没在 RNS 停用溶液中三秒钟，然后进行两次短暂清洗和 DEPC 处理水。然后在 370 摄氏度的培养箱中驱动幻灯片，以去除任何残留溶液，并在层流柜中处理幻灯片 30 分钟，以增强石蜡而不是粽子。

对于样品组织剖面，将石蜡块放在冷盘上，用 DEPC 处理的水填充水浴，然后加热至 42 摄氏度。将块修剪到感兴趣区域的深度，将石蜡块切到 6 到 10 微米厚度。井截块将在刀片边缘形成功能区。

使用细钳子轻轻地将丝带从微切转移到水浴，注意丝带平放在水面上。要收集各部分，请以 45 度角握住幻灯片，请使用向上运动将带状从水中抬到幻灯片上，并使用无绒组织小心地去除多余的水。收集所有部分后，用二甲苯洗涤320秒，然后用100%乙醇洗230秒，用70%乙醇洗230秒。

要从脱皮和干燥组织部分对感兴趣的微细胞进行微消毒，将三个 LCM 显微镜插槽上的负载幻灯片和负载收集管加载到可用的插槽中。移动舞台以定位需要切割的样品区域，并在膜幻灯片上切割一个无组织的空白段。优化激光压力弹射能量和焦点的切割速度和切削。

使用绘图工具勾勒出组织中感兴趣的区域，并使用优化的参数和 Robo LPC 函数将细胞弹射到粘合盖中。从元素列表中选择标志，以使用标志工具标记感兴趣的区域。检查盖检查按钮以检查粘合盖，以确认已捕获样品。

RNA提取通常需要每盖10至15个节。获得所有样品后，立即进行RNA提取，以避免RNA降解。RNA提取和RNA扩增后使用自动电泳系统，根据制造商的指示对反义RNA进行量化和鉴定。

在这项研究中，LCM，RNA测序被应用于来自三个胚胎器官的少数细胞，在发芽期间48小时过程中每8小时一次。正确调整切割参数非常重要，以便将感兴趣的组织精确切割并脱落到周围组织，而不会燃烧选定区域的边缘。在RNA扩增前对总RNA进行扩化，可以检测优质RNA样品中18和28S核糖体亚基的不同电泳带和荧光峰。

成功合成的抗义RNA将呈现从100到1000个核苷酸的单模对称大小分布，经过两轮扩增后，峰值约为300个核苷酸。在48小时发芽后，不同组织中表达的基因的多维尺度绘制表明，单个组织的样本与同一时间点样本之间的相似性更大，但组织不同。与组织的零小时时间点相比，每个组织在发芽过程中，不同表达基因的数量会逐渐增加。

在这个代表性的分析中，25%的李子、34%的弧度和41%的分色表达基因被发现在每个组织内只表达。正确调整切割参数以精确切除和从周围组织中分离选择区域，而不燃烧选定区域的边缘，这一点非常重要。通过改进的染色质和蛋白质纯化方法，增强质谱仪，LCM可用于细胞类型特异性表观和蛋白质组学研究植入物。