Preparação de tecidos cardíacos projetados em forma de malha derivados de células iPS humanas para reparo de miocárdio in vivo

Este protocolo descreve um método nobre e fácil para criar tecidos cardíacos projetados em forma de malha derivados de partes do corpo induzidas pelo homem e células-TRONCO derivadas de células. A flexibilidade da geometria tecidual e a escalabilidade da função tecidual preservada são as principais vantagens dessa técnica. Os ECTs de forma de malha implantados podem restaurar uma estrutura cardíaca e funcionar em um modelo de infarto do miocárdio de rato.

Confirmando sua viabilidade para uso em terapia regenerativa cardíaca. Essas técnicas requerem processamento de células STEM humanas reprodutíveis e habilidades de cultura tecidual para resultados consistentes. Comece cortando uma folha PDMS curada ao tamanho adequado para permitir que a folha seja ligada com adesivo de silicone para fabricar uma bandeja retangular de 21 por 20,5 milímetros com sete milímetros de largura e 2,5 milímetros de altura em posições retangulares escalonadas.

O espaçamento horizontal entre duas linhas de postes deve ser de 2,5 milímetros. Autoclave a bandeja a 120 graus Celsius por 20 minutos antes de revestir o molde com 1% Poloxamer 407 em PBS por uma hora. Em seguida, enxágue completamente o molde com PBS e coloque o molde em um poço de uma placa de seis poços.

Para análise de linhagem, combine as células do cardiomiócito mais protocolos de células mural endoteliais e vasculares. De modo que a concentração final de células mural é de 10 a 20% em um número celular total de seis vezes 10 para as seis células por construção. Misture 133 microliters de ácido solúvel Rat Tail solução tipo um e 17 microliters de Tampão alcalino a 17 microliters de 10X Mínimo Essencial Médio no gelo.

Em seguida, adicione 67 microliters de Basement Membrane Matrix à solução de colágeno. Em seguida, centrifugar as células e resuspensar a pelota em 167 microliters do Medium Essencial Mínimo de Alta Glicose Dulbecco complementado com soro bovino fetal e antibióticos. Misture as células na solução matricial no gelo.

Em seguida, despeje cuidadosamente 400 microliters da suspensão da matriz celular no molde de tecido PDMS revestido poloxamer 407. Incubar a mistura de matriz celular em uma incubadora de cultura celular padrão a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 60 minutos. Quando o tecido for formado, mergulhe cuidadosamente o molde com quatro mililitros de cultura ECT e devolva a placa à incubadora de cultura celular por 14 dias.

Antes da implantação da ECT, você esterilizasse fórceps finos para remover cuidadosamente o ECT dos postes de carregamento. Moldes de tecido podem ser fabricados com vários padrões, comprimentos postais e pós-espaçamento para gerar diferentes geometrias finais de ECT. Para esta análise, utilizou-se um molde com postes longos de sete milímetros com intervalos de 2,5 milímetros de largura.

Poloxamer 407 previne a adesão das células ao molde e permite a formação de uma estrutura de malha característica, após compactação rápida de gel em 14 dias. A estrutura é mantida mesmo após a liberação da ECT do molde. A construção de tecido fabricado tem aproximadamente 1,5 centímetros de largura e 0,5 milímetros de espessura.

E a largura de cada feixe na malha é de aproximadamente 0,5 milímetros em média. É possível gerar um ECT de malha de largura final de 3 centímetros contendo 24 milhões de células de um molde quatro vezes maior com o mesmo design de post escalonado. Esta malha maior ECT também pode ser facilmente removida do molde e gera um ato local de força equivalente à malha menor ECT.

É importante despejar a mistura da matriz celular uniformemente no molde do tecido sem gerar bolhas para evitar sentir defeitos no gel final. Caracterização funcional do contratante. e as relações de quarta frequência podem ser realizadas usando sistemas embutidos.

Nosso objetivo final é a tradução dos paradigmas da ECT em terapias clínicas que utilizam grandes estudos pré-clínicos animais.