As doenças cardiovasculares continuam sendo a causa número um de morte em todo o mundo. Modelos in vitro tradicionais dependem da cultura monocamadas. No entanto, o coração, especificamente o músculo cardíaco ou o miocárdio, é complexo em sua anisotropia 3D e composição celular.
Por isso, é fundamental melhorar a complexidade da composição tecidual dentro de modelos in vitro para melhor imitar tanto os constituintes celulares quanto a estrutura do miocárdio. Aqui neste trabalho, demonstramos um protocolo para o desenvolvimento de um tecido cardíaco humano 3D derivado de células-tronco dentro de um novo dispositivo microfluido. Este dispositivo incorpora um canal de tecido principal 3D com micropostos elípticos inatos que induzem altos graus de alinhamento das células cardíacas encapsuladas hidrogel circundante.
O canal principal é ladeado por canais de mídia com portas de injeção que permitem uma difusão de nutrientes em todo o tecido. Devido aos cuidados necessários no manuseio dos dispositivos microfluidos, a representação visual deste protocolo é útil para estabelecer adequadamente tecido cardíaco 3D dentro de um dispositivo microfluido com micropostos incorporados para maior alinhamento tecidual. Para dissociar o fibroblasto cardíaco humano, primeiro tire o frasco da incubadora.
Coloque dentro do armário de biossegurança e comece a aspirar a mídia gasta do frasco. Em seguida, pegue três MLs de PBS 1X para lavar o frasco. Feche a tampa e gire o frasco para que a parte inferior esteja devidamente revestida em PBS.
Aspire a PBS. Pegue três MLs de trippsina de 37 graus e adicione ao frasco. Em seguida, incline o frasco e gire para que a parte inferior esteja totalmente revestida.
Em seguida, coloque na incubadora por quatro a seis minutos. Neutralize o trypsin com FGM3 tomando três MLs e adicionando isso ao frasco. Pipeta a solução para cima e para baixo para desalojar todas as células que permanecem na parte de trás do frasco.
Colete a suspensão da célula em um tubo Falcon de 15 ML. Pegue 10 microlitros da suspensão celular e dispense em um hemótmetro para contar as células com um microscópio. Centrifugar a suspensão da célula a 250 G por quatro minutos.
Após a centrifugação, aspire o supernascedor tomando cuidado para não perturbar a pelota celular. Resuspense a pelota celular com FGM3 fresco para fazer uma desejada suspensão de 75 milhões de células por ML. Resuspend as células, em seguida, definir o tubo para baixo com uma tampa frouxamente encaixada.
Para dissociar os cardiomiócitos, tire a placa da incubadora e aspire a mídia. Pegue seis MLs de PBS e lave os poços para que haja um ML de PBS em cada poço. Aspire o PBS, tomando cuidado para não perturbar as células presas à placa.
Adicione seis MLs de trypLE Express aquecidos de modo que haja um ML em cada poço de uma placa de seis poços. Incubar as células com o trypLE por 10 minutos. Após 10 minutos, neutralize o trypLE com seis MLs de RPMI mais b27 mais insulina para que você esteja adicionando um ML de RMPI a cada poço.
Use uma pipeta ML para coletar a solução e explodi-la contra as costas dos poços para garantir que todas as células sejam retiradas. Colete a suspensão da célula em um tubo Falcon de 15 ML. Centrifugar o tubo a 300 G por três minutos.
Após centrifugação, aspire a mídia e o trypLE. Este passo é importante para lavar os cardiomiócitos sensíveis. Esta etapa garante que todo o trypLE se foi em formação de tecido cardíaco 3D.
Resuspend a pelota celular em cinco MLs de RPMI mais B27 mais insulina. Use uma pipeta de um ML para pipetar a solução para cima e para baixo para garantir uma suspensão celular homogênea. Pegue 10 microliters da suspensão celular para contar com o hemócito.
Centrifugar as células a 300 G por três minutos. Aspire a mídia após centrifugação pela segunda vez. Adicione a quantidade apropriada de RPMI mais b27 mais insulina para alcançar uma suspensão de 75 milhões de células por ML, em seguida, resuspend.
Para preparar a solução de colágeno para encapsulamento, tenha todos os reagentes em uma geladeira no capô. Em seguida, pegue 75 microliters do colágeno de estoque. O colágeno é muito viscoso, tão lentamente absorção com a pipeta, em seguida, dispense em um tubo de microcentrifuuge no gelo.
Pegue 13,85 microliters de RPMI e adicione ao colágeno no tubo Falcão. Em seguida, pegue 10 microliters de fenol vermelho e adicione à mistura no gelo e resuspend. Por fim, pegue 1,15 microliters de um NaOH normal e adicione à suspensão para neutralizar.
Em seguida, pegue uma ponta de pipeta de 200 microliter e resuspenque a suspensão. O próximo passo é o encapsulamento das células dentro do metrogel de colágeno. Em seguida, pegue uma alíquota de oito microliters de CMs e adicione a um tubo Falcon fresco no gelo.
Em seguida, pegue dois microliters de CS e adicione a essa mistura celular. Resuspend a suspensão celular e pegue 5,6 microliters da suspensão celular e coloque em um tubo Falcon fresco. Então pegue o colágeno que acabou de preparar, pegue quatro microliters do colágeno, e pegue 2,4 microliters de metrogel.
Pipetar a mistura para cima e para baixo para garantir uma distribuição homogênea da suspensão do hidrogel celular. Uma vez que a injeção de gel esteja preparada, você pode inserir em dispositivos. Pegue uma nova dica e resuspend.
Pegue a placa de Petri dos dispositivos, insira a ponta na porta de injeção e injete lentamente e de forma constante. Você verá como o canal do dispositivo se enche com a suspensão do hidrogel celular. Uma vez que a outra porta esteja cheia, pare a injeção e remova a ponta.
Após a injeção, gire os dispositivos com pinças e coloque dentro da placa petri maior com água na incubadora por nove minutos. Após nove minutos, tire os dispositivos da incubadora e vire ereto, depois coloque de volta na incubadora por mais nove minutos para completar a polimerização do hidrogel. Agora é hora de adicionar a mídia.
Então, pegue RMPI mais B27 e insira a ponta na porta de mídia e comece a empurrar lentamente. Então faça isso na porta de mídia oposta. Você pode descobrir que a mídia não está injetando, então você pode colocar uma gota de mídia no topo da porta e, em seguida, pegar a pipeta e usar pressão negativa para puxar a mídia através do outro lado.
Então você vai ver como a mídia começa a ser puxado através do canal. Uma vez adicionadas as mídias a todos os canais de mídia, os dispositivos serão colocados de volta na incubadora a 37 graus. O dispositivo microfluido é mostrado no canto superior esquerdo.
Nos dias um, sete e 14 da cultura são mostrados esta imagem. Após 14 dias de cultura, as células devem se condensar em estruturas altamente alinhadas que se formam ao redor dos micropostos. Traços do dia 14 são mostrados aqui em C de contração espontânea, bem como imagens imunofluorescentes de tecidos manchados de actin e marcador cardíaco.
O que deve ser visto são fibras atuarinas altamente alinhadas que se formam após 14 dias na cultura, bem como sarcomeres maduros estriados paralelos e junções de lacunas localizadas. Durante este procedimento, é fundamental manter todos os materiais a baixas temperaturas no gelo durante a injeção de hidrogel celular para evitar a polimerização prematura. Os dispositivos microfluidos devem ser manuseados com cuidado, tanto durante a fabricação, injeção e cultura de tecido estendido.
As injeções celulares devem ser um processo constante para garantir que todo o canal tenha sido preenchido enquanto realizado rapidamente para evitar a polimerização prematura ou a secagem de hidrogel antes da adição da mídia.
