Préparation de tissus cardiaques en forme de maille dérivés de cellules iPS humaines pour la réparation myocardique in vivo

Ce protocole décrit une méthode noble et facile pour créer des tissus cardiaques conçus en forme de maille dérivés de parties du corps induites par l’homme et de cellules SOUCHES dérivées de cellules cardiaques. La flexibilité de la géométrie tissulaire et l’évolutivité de la fonction tissulaire préservée sont les principaux avantages de cette technique. Les ECTs implantés en forme de maille peuvent restaurer une structure cardiaque et fonctionner dans un modèle d’infarctus du myocarde du rat.

Confirmation de sa faisabilité pour une utilisation en thérapie régénérative cardiaque. Ces techniques nécessitent un traitement reproductible des cellules SOUCHES humaines et les compétences de culture tissulaire pour des résultats cohérents. Commencez par couper une feuille PDMS durcie à la taille appropriée pour permettre à la feuille d’être collée avec de l’adhésif en silicone pour fabriquer un plateau rectangulaire de 21 par 20,5 millimètres avec sept millimètres de long de 0,5 millimètre de large et 2,5 millimètres de haut poteaux rectangulaires à des positions décalées.

L’espacement horizontal entre deux lignes de poteaux doit être de 2,5 millimètres. Autoclave le plateau à 120 degrés Celsius pendant 20 minutes avant d’enduire le moule avec 1%Poloxamer 407 en PBS pendant une heure. Rincez ensuite soigneusement le moule avec PBS et placez le moule dans un puits d’une plaque de six puits.

Pour l’analyse de lignée, combinez les cellules du cardiomyocyte plus les protocoles endothelial et vasculaires de cellules murales. De sorte que la concentration finale de cellules murales est de 10 à 20% dans un nombre total de cellules de six fois 10 pour les six cellules par construction. Mélanger 133 microlitres de solution de collagène acid soluble rat tail type 1 et 17 microlitres d’Alkali Buffer à 17 microlitres de 10X Minimum Essential Medium sur glace.

Ajouter ensuite 67 microlitres de matrice membranaire de sous-sol à la solution de collagène. Ensuite, centrifugez les cellules et réutilisez la pastille dans 167 microlitres du milieu essentiel minimal de High Glucose Dulbecco complétés par du sérum bovin fœtal et des antibiotiques. Mélanger les cellules sur la solution matricielle sur la glace.

Versez ensuite soigneusement 400 microlitres de la suspension de matrice cellulaire sur le moule en tissu PDMS enduit de poloxamer 407. Incuber le mélange de matrice cellulaire dans un incubateur standard de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 60 minutes. Lorsque le tissu s’est formé, tremper soigneusement le moule avec quatre millilitres de milieu de culture ECT et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant 14 jours.

Avant l’implantation ECT, vous avez stérilisé les forceps fins pour retirer soigneusement l’ECT des postes de chargement. Les moules de tissu peuvent être fabriqués avec divers modèles, longueurs de poteau et espacement de poteau pour générer différentes géométries finales d’ECT. Pour cette analyse, un moule avec des poteaux de sept millimètres de long avec des intervalles de 2,5 millimètres de large a été utilisé.

Poloxamer 407 empêche l’adhérence des cellules au moule et permet la formation d’une structure de maille caractéristique, après compactage rapide de gel en 14 jours. La structure est maintenue même après que l’ECT est libéré du moule. La construction en tissu fabriqué mesure environ 1,5 centimètre de large et 0,5 millimètre d’épaisseur.

Et la largeur de chaque faisceau dans le maillage est d’environ 0,5 millimètre en moyenne. Il est possible de générer un maillage de largeur finale de 3 centimètres ECT contenant 24 millions de cellules à partir d’un moule quatre fois plus grand avec la même conception de poteau décalé. Ce maillage plus grand ECT peut également être facilement retiré du moule et génère un acte de force local équivalent à la maille plus petite ECT.

Il est important de verser le mélange de matrice cellulaire uniformément dans le moule de tissu sans générer des bulles pour empêcher des défauts de sensation dans le gel final. Caractérisation fonctionnelle de l’entrepreneur. et les relations de quatrième fréquence peuvent être effectuées à l’aide de systèmes intégrés.

Notre but ultime est la traduction des paradigmes ECT en thérapies cliniques qui utilisent de grandes études précliniques animales.