As células HC11 e EpH4 são linhas de células epiteliais de mama do rato que podem se diferenciar na cultura. Ao mesmo tempo, essas células podem ser transformadas por uma série de oncogenes. Essas células são ideais para o estudo da inter-relação entre diferenciação e transformação neoplásica.
Essas técnicas podem ser usadas em estudos de transdução de sinais para descobrir alvos para a terapia do câncer. Por exemplo, o pequeno GTPase Rac e outras moléculas podem desencadear a transformação de células epiteliais mamárias quando expressas em níveis elevados, mas surpreendentemente em níveis baixos, elas podem induzir diferenciação. Outros transdutores de sinal podem se comportar de maneira semelhante.
Os princípios podem se aplicar a outros tipos de diferenciação, bem como onde a confluência celular desempenha um papel importante, por exemplo, a diferenciação de adipócitos ou miotubes. Alguém que execute essa técnica pela primeira vez deve ter em mente que o revestimento das células HC11 é importante. Isso porque o contato celular-celular é importante para a diferenciação.
Outro ponto a ser observado é que a extração adequada de células EpH4 da matriz é fundamental para a quantitação proteica, pois quaisquer resíduos afetarão a determinação da proteína. A demonstração visual deste método é útil porque alguns detalhes do protocolo são difíceis de descrever no papel. Comece preparando uma garrafa de 50 mililitros de meio celular HC11 de acordo com as instruções do manuscrito.
Para emplacar as células, aspire o meio a partir de cinco placas petri 50% confluentes de seis centímetros e lave as células com aproximadamente 1,8 mililitros de trippsina usando uma pipeta Pasteur plugada de algodão de nove polegadas estéril. Em seguida, adicione 200 microliters de trippsina por placa e gire a placa para desalojar as células anexadas. Observe as células em fase de microscopia de contraste com um objetivo 4X para garantir que elas começaram a se desalojar.
Em seguida, aspire aproximadamente 1,5 mililitros de meio HC11 com uma pipeta Pasteur estéril de nove polegadas e esguichar verticalmente contra as células enquanto gira o prato certificando-se de evitar respingos. Transfira todas as células para a garrafa com meio HC11 e redemoinho para dispersar uniformemente na garrafa. Em seguida, aliquot a suspensão celular em 20 placas de Petri de três centímetros, pipetando dois mililitros de células por prato.
Balance as placas de Petri para espalhar as células e incuba-las a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, quando as células estiverem 90 a 100% confluentes, aspire o meio e substitua-o por médio por FBS, mas sem EGF. Depois de cultivar as células em médio sem EGF por 24 horas, adicione o meio de diferenciação a 10 pratos e cresça as células por até 10 dias mantendo os outros 10 pratos como controles.
Troque o meio a cada dois ou três dias com células tratadas e controladas pelo HIP. Para monitorar a diferenciação, observe as células com microscopia de contraste de fase. Use microscopia de fluorescência se as células estiverem expressando proteína fluorescente verde.
Além disso, quantifique o grau de diferenciação extraindo proteínas das células tratadas e controladas pelo HIP uma vez por dia e realizando a análise do Western Blot. Reúna e coloque o meio de crescimento EpH4, a matriz EHS, e dois tubos cônicos de 50 mililitros no gelo. Prechill as placas de cultura tecidual com pontas de pipeta a menos 20 graus Celsius e prepare o meio de crescimento EpH4 complementado com matriz de 10 ou 20% em dois tubos cônicos de 50 mililitros e mantê-los no gelo até estar pronto para usar.
Depois de recuperar as placas de cultura de tecido pré-estilhaçadas a menos 20 graus Celsius, cubra 10 poços da placa de 24 poços com 150 microliters de matriz não diluída espalhando a matriz com uma pipeta. Evite criar bolhas ao espalhar a matriz. Em seguida, bata suavemente nas laterais da placa e incubar a placa a 37 graus Celsius durante uma hora para permitir que a matriz se solidifique.
Enquanto isso, prepare-se para a diferenciação, experimentando as células EpH4, bem como descrito anteriormente e garantindo suspensões de células únicas após a ressuspensão de células experimentpsinizadas. Em seguida, conte as células em suspensão com um hemótmetro. Transfira cinco vezes 10 para as quatro células por poço para um tubo de centrífuga cônica estéril de 1,5 mililitro e gire-os a 250 vezes g por cinco minutos.
Aspire cuidadosamente o meio supernante e coloque o tubo no gelo. Use uma ponta de pipeta de um mililitro para resuspensar as células em 350 microliters de meio de crescimento EpH4 complementados com matriz de 20%, mantendo os tubos no gelo certificando-se de evitar bolhas. Uma vez que a camada inferior tenha se solidificado, adicione os 350 microliters de suspensão celular a cada poço revestido e coloque-o em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma hora para permitir que a camada de matriz de 20% se solidifique.
Observe as células com microscopia de contraste de fase para garantir que as células únicas sejam visíveis. Em seguida, adicione 200 microliters de meio EpH4 com matriz de 10% em cima e incubar a placa a 37 graus Celsius. Comece a indução de diferenciação um dia depois de emplacar as células na matriz.
Remova cuidadosamente 150 microliters de meio de matriz superior de 10% e adicione 200 microliters de meio EpH4 contendo HIP e matriz de 10% e para controles adicione um meio de matriz de 10% sem HIP. Substitua o meio a cada dois dias por até 10 dias monitorando a formação da mamografia por microscopia de contraste de fase. Para quantificar a diferenciação, pipeta cuidadosamente fora do meio HIP de matriz de 10% dos poços e enxágue a camada de matriz de 20% com 350 microliters de PBS gelado.
Em seguida, adicione 70 a 100 microliters de PBS gelado com um EDTA milimola diretamente nos poços e desprende suavemente a camada inferior de matriz de 100% com uma ponta de pipeta. Agite a placa suavemente a quatro graus Celsius por 30 minutos. Transfira cuidadosamente a suspensão esféide para um tubo cônico e enxágue os poços com 500 microliters de PBS EDTA para recuperar quaisquer esferoides restantes.
Balance o tubo no gelo por mais 30 minutos, certificando-se de que a matriz se dissolve totalmente. Se forem vistas aglomerações de matriz visível, adicione mais PBS EDTA ou agite mais tempo. Centrifugar a solução a 350 vezes g para pellet os esferoides.
Em seguida, aspire o supernasciente, lise os esferoides, e teste as células para beta-caseína, cíclin D1 e p120RasGAP por manchas ocidentais. Há uma dependência impressionante da diferenciação sobre a força do sinal Rac nas células HC11. Enquanto crac1 endógeno é necessário para diferenciação e baixos níveis de RacV12 ativados mutacionáriamente causam um aumento na capacidade de diferenciação, altos níveis de RacV12 desencadeiam um bloco de diferenciação e induzem neoplasia.
Quando as propriedades de diferenciação das células EpH4 foram exploradas em uma cultura de matriz 3D, descobriu-se que a produção de beta-caseína atingiu o pico de oito a dez dias e a expressão cyclin D1 foi máxima em quatro a seis dias após a estimulação do QUADRIL. Para determinar o posicionamento de células individuais, elas foram manchadas com DAPI e imagens com microscopia confocal. A morte celular interna e a formação de lúmens ocos foram observadas nas mammosféricas, enquanto a adição de HGF resultou na formação de estruturas tubulares.
Alguém que execute essa técnica pela primeira vez deve ter em mente que o revestimento das células HC11 é importante. Também a extração adequada das células EpH4 da matriz é fundamental para a quantitação proteica, pois quaisquer resíduos afetarão a determinação da proteína. Esta técnica pode ser usada para investigar outros transdutores de sinal que podem se comportar de forma semelhante.
Se houver mutações de driver em um câncer, então sua inibição completa não será necessária, uma vez que baixos níveis restantes realmente induziriam a diferenciação.
