Die HC11- und EpH4-Zellen sind Mausbrust-Epithelzelllinien, die sich in der Kultur unterscheiden können. Gleichzeitig können diese Zellen durch eine Reihe von Onkogenen transformiert werden. Diese Zellen sind ideal für die Untersuchung der Wechselbeziehung zwischen Differenzierung und neoplastischer Transformation.
Diese Techniken können in Signaltransduktionsstudien eingesetzt werden, um Ziele für die Krebstherapie zu entdecken. Zum Beispiel können die kleinen GTPase Rac und andere Moleküle die Transformation von Brustepithelzellen auslösen, wenn sie auf hohen Ebenen ausgedrückt werden, aber überraschenderweise auf niedrigen Niveaus, können sie Differenzierung induzieren. Andere Signalwandler können sich ähnlich verhalten.
Die Prinzipien können auch für andere Arten der Differenzierung gelten, wenn der Zellzusammenfluss eine wichtige Rolle spielt, z. B. die Differenzierung von Adipozyten oder Myotuben. Jemand, der diese Technik zum ersten Mal durchführt, sollte bedenken, dass die Beschichtung der HC11-Zellen wichtig ist. Dies liegt daran, dass der Zell-zu-Zell-Kontakt für die Differenzierung wichtig ist.
Ein weiterer Punkt, auf den Sie achten sollten, ist, dass die richtige Extraktion von EpH4-Zellen aus der Matrix für die Proteinquantitation von entscheidender Bedeutung ist, da Rückstände die Proteinbestimmung beeinflussen. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist nützlich, da einige Details des Protokolls auf dem Papier schwer zu beschreiben sind. Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer Flasche von 50 Milliliter HC11 Zellmedium nach Manuskript Anweisungen.
Um die Zellen zu verkachten, saugen Sie das Medium aus fünf sechs Zentimetern 50% konfluenten Petrischalen an und waschen Sie die Zellen mit etwa 1,8 Milliliter Trypsin mit einer sterilen Neun-Zoll-Baumwolle verstopften Pasteur Pipette. Dann fügen Sie 200 Mikroliter Trypsin pro Platte hinzu und wirbeln Sie die Platte, um die angeschlossenen Zellen zu lösen. Beobachten Sie die Zellen unter Phasenkontrastmikroskopie mit einem 4X-Objektiv, um sicherzustellen, dass sie begonnen haben, sich zu lösen.
Dann aspirieren Sie etwa 1,5 Milliliter HC11 Medium mit einer sterilen 9-Zoll-Pasteur-Pipette und spritzen Sie es vertikal gegen die Zellen, während Sie die Schale drehen, um sicherzustellen, dass Spritzer vermieden wird. Übertragen Sie alle Zellen auf die Flasche mit HC11 Medium und wirbeln, um gleichmäßig in der Flasche zu dispergieren. Dann aliquot die Zellsuspension in 20 drei Zentimeter Petrischalen durch Pipettieren zwei Milliliter Zellen pro Schale.
Die Petrischalen zu streuen, um die Zellen zu verbreiten und sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid über Nacht zu bebrüten. Am nächsten Tag, wenn die Zellen 90 bis 100% konfluent sind, aspirieren Sie das Medium und ersetzen Sie es durch Medium mit FBS, aber ohne EGF. Nach dem Anbau der Zellen in Medium ohne EGF für 24 Stunden, fügen Sie die Differenzierung Medium auf 10 Gerichte und wachsen die Zellen für bis zu 10 Tage halten die anderen 10 Gerichte als Kontrollen.
Ändern Sie das Medium alle zwei bis drei Tage mit HIP-behandelten und Kontrollzellen. Um die Differenzierung zu überwachen, beobachten Sie die Zellen mit Phasenkontrastmikroskopie. Verwenden Sie die Fluoreszenzmikroskopie, wenn die Zellen grünes fluoreszierendes Protein exdrücken.
Darüber hinaus quantifizieren Sie den Grad der Differenzierung, indem Sie Proteine einmal pro Tag aus den HIP-behandelten und Kontrollzellen extrahieren und Western Blot-Analysen durchführen. Sammeln und legen Sie das EpH4-Wachstumsmedium, die EHS-Matrix und zwei konische 50-Milliliter-Röhren auf Eis. Die Gewebekulturplatten mit Pipettenspitzen bei minus 20 Grad Celsius vorbereiten und EpH4-Wachstumsmedium mit 10 oder 20% Matrix in zwei 50 Milliliter konischen Röhren ergänzen und auf Eis halten, bis sie einsatzbereit sind.
Nach dem Abrufen der vorgechillten Gewebekulturplatten bei minus 20 Grad Celsius 10 Brunnen der 24-Well-Platte mit 150 Mikrolitern unverdünnter Matrix überziehen, indem Sie die Matrix mit einer Pipette verteilen. Vermeiden Sie blasen, wenn Sie die Matrix verteilen. Tippen Sie dann vorsichtig auf die Seiten der Platte und bebrüten die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, damit sich die Matrix erstarren kann.
Bereiten Sie sich in der Zwischenzeit auf die Differenzierung vor, indem Sie die epH4-Zellen sowie die zuvor beschriebenen Trypsinisierungszellen versuchen und einzelzellige Suspensionen nach Resuspension von trypsinisierten Zellen sicherstellen. Als Nächstes zählen Sie die Zellen in Suspension mit einem Hämozytometer. Fünfmal 10 auf die vier Zellen pro Brunnen auf ein 1,5 Milliliter steriles konisches Zentrifugenrohr übertragen und fünf Minuten lang bei 250 mal g drehen.
Das überstande Medium vorsichtig ansaugen und die Röhre auf Eis legen. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um die Zellen in 350 Mikroliter EpH4-Wachstumsmedium mit 20% Matrix ergänzt, während die Rohre auf Eis zu halten, um sicherzustellen, dass Blasen zu vermeiden. Sobald sich die untere Schicht verfestigt hat, fügen Sie die 350 Mikroliter Zellsuspension zu jedem beschichteten Brunnen hinzu und legen Sie sie eine Stunde lang in einen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius, damit sich die 20%ige Matrixschicht erstarren lässt.
Beobachten Sie die Zellen mit Phasenkontrastmikroskopie, um sicherzustellen, dass einzelne Zellen sichtbar sind. Dann fügen Sie 200 Mikroliter EpH4 Medium mit 10%Matrix auf der Oberseite und inkubieren die Platte bei 37 Grad Celsius. Beginnen Sie die Differenzierungsinduktion einen Tag nach der Beschichtung der Zellen in der Matrix.
Entfernen Sie vorsichtig 150 Mikroliter des oberen 10%Matrix-Mediums und fügen Sie 200 Mikroliter EpH4-Medium mit HIP und 10%Matrix hinzu und fügen Sie für Kontrollen ein 10%Matrix-Medium ohne HIP hinzu. Ersetzen Sie das Medium alle zwei Tage für bis zu 10 Tage und überwachen Sie die Mammosphärenbildung durch Phasenkontrastmikroskopie. Um die Differenzierung zu quantifizieren, pipette vorsichtig aus dem 10%Matrix HIP Medium aus den Brunnen und spülen Sie die 20%Matrix-Schicht mit 350 Mikroliter eiskalte PBS.
Dann 70 bis 100 Mikroliter eiskalte SeiskalteS PBS mit einem Millimolaren EDTA direkt in die Brunnen geben und die untere Schicht von 100% Matrix vorsichtig mit einer Pipettenspitze lösen. Schütteln Sie die Platte 30 Minuten lang sanft bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie die Sphäroidsuspension vorsichtig auf ein konisches Rohr und spülen Sie die Brunnen mit 500 MikroliterPBS EDTA, um die verbleibenden Sphäroide wiederherzustellen.
Die Röhre für weitere 30 Minuten auf Eis schaukeln, um sicherzustellen, dass sich die Matrix vollständig auflöst. Wenn sichtbare Matrixklumpen zu sehen sind, fügen Sie weitere PBS-EDTA hinzu oder schütteln Sie länger. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 350 mal g, um die Sphäroide zu pellet.
Dann aspirieren Sie den Überstand, lysieren Sie die Sphäroide und untersuchen Sie die Zellen für Beta-Casein, Cyclin D1 und p120RasGAP durch Western Blotting. Es besteht eine auffallende Abhängigkeit der Differenzierung von der Stärke des Rac-Signals in HC11-Zellen. Während endogenes CRAC1 für die Differenzierung erforderlich ist und niedrige Mutationsniveaus racV12 eine Erhöhung der Differenzierungskapazität verursachen, lösen hohe RacV12-Spiegel einen Differenzierungsblock aus und induzieren Neoplasie.
Als die Differenzierungseigenschaften von EpH4-Zellen in einer 3D-Matrixkultur untersucht wurden, wurde festgestellt, dass die Beta-Casein-Produktion bei acht bis zehn Tagen ihren Höhepunkt erreichte und die Cyclin-D1-Expression vier bis sechs Tage nach der HIP-Stimulation maximal war. Um die Positionierung einzelner Zellen zu bestimmen, wurden sie mit DAPI befleckt und mit konfokaler Mikroskopie abgebildet. Der Tod der inneren Zellen und die Bildung von hohlen Lumen wurden in den Mammosphären beobachtet, während die Zugabe von HGF zur Bildung von röhrenförmigen Strukturen führte.
Jemand, der diese Technik zum ersten Mal durchführt, sollte bedenken, dass die Beschichtung der HC11-Zellen wichtig ist. Auch die richtige Extraktion der EpH4-Zellen aus der Matrix ist entscheidend für die Proteinquantifizierung, da Rückstände die Proteinbestimmung beeinflussen. Diese Technik kann verwendet werden, um andere Signalwandler zu untersuchen, die sich in ähnlicher Weise verhalten können.
Wenn es Treibermutationen bei einem Krebs gibt, dann wird ihre vollständige Hemmung nicht notwendig sein, da niedrige Verbleibende Werte tatsächlich differenzierungsinduziert würden.
