Com este protocolo de imagem de difusão, é possível investigar alterações microestruturais no hipocampo de um rato com uma lesão cerebral traumática leve que de outra forma não são visíveis na ressonância magnética anatômica. Esta técnica pode detectar alterações no cérebro após um trauma leve e difuso que não pode ser detectado com tomografia computadorizada ou ressonância magnética anatômica. Esta técnica facilita o acompanhamento do processo de recuperação após a manutenção de uma lesão cerebral traumática leve de forma objetiva e quantitativa.
Essa técnica de difusão e análise de imagem também pode ser aplicada em outras doenças que afetam o cérebro, como demência e esclerose múltipla, não apenas em estudos pré-clínicos, mas também em humanos. Neste protocolo, é importante que a qualidade das varreduras de difusão e as etapas de correção seja alta, portanto, sugere-se orientação de técnicos e analistas experientes. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento Celsius de 37 graus depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé em um rato Wistar H de 12 semanas de idade e insira um cateter em uma veia traseira lateral.
Injete 100 microlitres de 2% lidocaína localmente no couro cabeludo raspado e desinfetado e faça uma incisão midline para expor o crânio. Use uma pequena tesoura para remover qualquer excesso de membranas e esfregue um broto de algodão no crânio até que o periosteum não esteja mais presente, em seguida, use uma gota de cola de tecido para anexar um diâmetro de 10 milímetros, três milímetros de espessura, disco metálico aproximadamente 1/3 na frente e 2/3 atrás do bregma. Para indução traumática de lesão cerebral, coloque o rato em uma cama feita sob medida com um colchão de espuma de uma constante específica de mola e coloque o rato diretamente sob um tubo plástico transparente com um peso de latão de 450 gramas com o capacete o mais horizontal possível.
Puxe o peso até um metro. Com um segundo experimentador presente, solte o peso e o segundo experimentador mova o rato para longe do tubo imediatamente após o impacto para evitar uma segunda lesão. Puxe suavemente o capacete do crânio e use uma gaze para conter qualquer sangramento.
Feche a pele com uma sutura e aplique gel de analgesia local à incisão. Coloque o rato no leito de um scanner de tomografia computadorizada e administre uma tomografia computadorizada de uso geral para descartar fraturas cranianas, em seguida, coloque o rato em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento Celsius de 37 graus com monitoramento até a recumbência total antes de devolver o animal à sua gaiola. Antes e um dia após a indução do trauma, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé no animal experimental e coloque o animal na cama do scanner MR em uma posição mais de cabeça e propensa.
Deslize a bobina de volume de quadratura sobre a cabeça e avance a cama do scanner para dentro do furo do scanner. Para garantir um posicionamento correto, obtenha uma varredura padrão de 3 aviões. Quando a varredura estiver concluída, carregue a varredura no visor da imagem e certifique-se de que a cabeça está em linha reta e que o cérebro esteja posicionado no centro do ímã e da bobina.
Adquira imagens ponderadas por T2 usando as configurações padrão, exceto o campo, a visualização e o tamanho da matriz que devem ser ajustados a uma resolução mais alta no plano de 109 por 109 micrômetros. Abra o Editor de Geometria e coloque o pacote de fatias na posição correta, incluindo o bulbo do cérebro e o cerebelo e carregue três novas sequências de eco-planar, ponderadas por difusão e spin-echo da pasta B_diffusion no protocolo de controle de varredura. Adquira imagens ponderadas por difusão usando as configurações padrão e abra a guia Editar varredura.
Defina a orientação da fatia para axial e o número de fatias para 25 para obter uma espessura de fatia de 500 micrômetros e uma distância interna de fatia de 600 micrômetros e altere a direção de leitura para a esquerda-direita. Sob a guia Geometria, ajuste os parâmetros geométricos e ajuste o campo de visão e tamanho da matriz para 105 por 105 para garantir uma resolução de 333 por 333 micrômetros. Clique na guia Difusão dentro da guia Pesquisa para cada uma das três conchas de difusão e ajuste o número de direções de difusão para 32 para a primeira concha, 46 para a segunda camada e 64 para a terceira camada.
Altere o número de imagens B0 para cinco para o primeiro shell, cinco para o segundo shell e sete para o terceiro shell, e ajuste as instruções gradientes com arquivos de direção gradiente personalizados. Ajuste o valor B por direção para 800 segundos por milímetro quadrado para a primeira concha, 1.500 segundos por milímetro quadrado para a segunda concha, e 2.000 segundos por milímetro quadrado para a terceira concha, em seguida, abra o Editor de Geometria e coloque o campo de visão entre o bulbo e o cerebelo contendo apenas o cerebrum para reduzir o artefato e o tempo de varredura. Na conclusão do protocolo de varredura, transfira o animal do leito do scanner para uma gaiola limpa com uma almofada de aquecimento Celsius de 37 graus Celsius com monitoramento até a recumedência total.
Para processamento de imagem de ressonância magnética de difusão, carregue as imagens no MRtrix3 e realize a correção de ruído e gibbs toque correção nas imagens ponderadas por difusão no programa de software. Converta as imagens corrigidas e ponderadas por difusão na imagem T2 para o formato NIFTI conforme indicado. Para executar a correção para distorções de imagem eco-planar, movimento e corrente de eddy, no menu Plug-ins do ExploreDTI selecione Correção para distorções EC/EPI de movimento de assunto e selecione o arquivo de dados de difusão pré-processado.
Para calcular as métricas de imagem do tensor de difusão para cada rato, clique em Plug-ins e Export stuff para NIFTI, selecione os mapas paramétricos do modelo de imagem tensor de difusão e exporte os mapas paramétricos para os modelos de integridade do trato de matéria branca e kurtose. Para criar um arquivo de máscara para o hipocampo de cada rato, carregue a imagem de anisotropia fracionada do rato no visualizador MRtrix e clique no botão plus para criar uma nova região de interesse. Para extrair as métricas de difusão do hipocampo do rato, importe o arquivo de máscara criado no software AMIDE e abra os mapas paramétricos e a imagem da máscara do rato.
Para adicionar a região de interesse do arquivo de máscara no AMIDE, selecione a imagem do arquivo da máscara, clique em Editar, Adicionar região de interesse e isocontour 3D e dar à região de interesse um nome significativo. Clique na região de interesse exibida na imagem da máscara e confirme que este volume deve conter apenas voxels com um valor de um. Para calcular os valores médios das métricas de difusão no hipocampo, clique em Ferramentas e Calcule estatísticas de interesse da região e indique as imagens e a região de interesse a serem incluídas.
Depois de clicar em Executar, aparecerá uma janela pop-up com os valores computados que podem ser usados para análises estatísticas adicionais. Neste experimento representativo, não houve evidência de fratura craniana conforme avaliado pela imagem da TC e as imagens T2 não mostraram nenhuma anormalidade no local da contusão um dia após o trauma. Para examinar a qualidade da etapa de co-registro não rígida entre a imagem T2 e o conjunto de dados de difusão, uma sobreposição da imagem T2 foi adicionada ao mapa de anisotropia fracionada codificada por cores.
Os mapas paramétricos para a anisotropia fracionada, a difusividade média, a difusividade axial e os mapas paramétricos de difusividade radial poderiam então ser calculados. Dentro da região de interesse, o cálculo dos valores médios para os valores axial, médio e radial kurtose, bem como valores para a fração de água axonal, difusividade extra-axonal axial e radial, e tortuosidade da integridade do trato de matéria branca também poderiam ser realizados. Neste experimento representativo, a análise das métricas de imagem tensor de difusão revelou um aumento significativo nos valores de anisotropia fracionada e uma diminuição nos valores de difusividade após o impacto no grupo de lesão cerebral traumática leve.
As métricas de kurtose difusão também mostraram uma diminuição significativa da kurtose radial após o impacto, enquanto não foram observadas alterações no axial ou médio kurtose. Usando o modelo de integridade do trato de matéria branca, a difusividade extra-axonal radial apresentou uma diminuição significativa e a tortuosidade demonstrou um aumento significativo no grupo de lesão cerebral traumática leve um dia após o impacto. Durante a análise da imagem, é importante verificar se o formato de dados do MRtrix foi devidamente convertido e importado para o ExploreDTI e que cada etapa de correção foi realizada corretamente.
Em vez de análise baseada em ROI, uma análise voxel-por-voxel pode ser aplicada para investigar alterações cerebrais inteiras. Essa técnica é muito valiosa no campo da neuroimagem e pode ser aplicada a outras doenças cerebrais também, como demência e esclerose múltipla.
