Con questo protocollo di imaging di diffusione, è possibile indagare i cambiamenti microstrutturali nell'ippocampo di un topo con una lieve lesione cerebrale traumatica che altrimenti non sono visibili sulla risonanza magnetica anatomica. Questa tecnica può rilevare alterazioni nel cervello a seguito di un trauma lieve e diffuso che non può essere rilevato con TC o risonanza anatomica. Questa tecnica rende più facile monitorare il processo di recupero dopo aver subito una lieve lesione cerebrale traumatica in modo obiettivo e quantitativo.
Questa tecnica di imaging e analisi della diffusione può essere applicata anche in altri disturbi che colpiscono il cervello, come la demenza e la sclerosi multipla, non solo negli studi preclinici ma anche nell'uomo. In questo protocollo, è importante che la qualità delle scansioni di diffusione e dei passaggi di correzione sia elevata, pertanto viene suggerita la guida di tecnici e analisti esperti. Posizionare l'animale su una pastiglia riscaldante Celsius di 37 gradi dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piede in un ratto Wistar H di 12 settimane, femmina, e inserire un catetere in una vena laterale della coda.
Iniettare localmente 100 microlitri di lidocaina al cuoio capelluto rasato e disinfettato e fare un'incisione della linea mediana per esporre il cranio. Utilizzare una piccola forbice per rimuovere eventuali membrane in eccesso e strofinare un cotton fioc sul cranio fino a quando il periostio non è più presente, quindi utilizzare una goccia di colla tissutale per attaccare un diametro di 10 millimetri, tre millimetri di spessore, disco metallico circa 1/3 davanti e 2/3 dietro il bregma. Per l'induzione traumatica di lesioni cerebrali, posizionare il topo su un letto su misura con un materasso in schiuma di una specifica costante di molla e posizionare il topo direttamente sotto un tubo di plastica trasparente con un peso in ottone di 450 grammi con il casco il più orizzontale possibile.
Tirare il peso fino a un metro. Con un secondo sperimentatore presente, rilasciare il peso e fare in modo che il secondo sperimentatore sposti il topo lontano dal tubo immediatamente dopo l'impatto per prevenire una seconda lesione. Estrarre delicatamente il casco dal cranio e utilizzare una garza per arginare qualsiasi sanguinamento.
Chiudere la pelle con una sutura e applicare il gel di analgesia locale all'incisione. Posizionare il topo sul letto di uno scanner CT e somministrare una TAC generica e a basse dosi per escludere fratture del cranio, quindi posizionare il topo in una gabbia pulita su una pastiglia riscaldante Celsius di 37 gradi Celsius con monitoraggio fino a piena reclinanza prima di riportare l'animale nella sua gabbia. Prima e un giorno dopo l'induzione del trauma, confermare una mancanza di risposta al dito del dito nell'animale sperimentale e posizionare l'animale sul letto dello scanner MR in una posizione prona a capofitto.
Far scorrere la bobina del volume di quadratura sopra la testa e far avanzare il letto dello scanner nel foro dello scanner. Per garantire un posizionamento corretto, ottenere una scansione scout predefinita a 3 piano. Al termine della scansione, caricare la scansione nel display dell'immagine e assicurarsi che la testa sia dritta e che il cervello sia posizionato al centro del magnete e della bobina.
Acquisire immagini ponderate in T2 utilizzando le impostazioni predefinite, ad eccezione del campo, della vista e delle dimensioni della matrice che devono essere regolate in base a una risoluzione in piano più elevata di 109 per 109 micrometri. Aprite geometry editor e posizionate il pacchetto slice nella posizione corretta, incluso il bulbo del cervello e del cervelletto e caricate tre nuove sequenze eco-planari, ponderate per la diffusione e spin-echo dalla cartella B_diffusion nel protocollo di controllo della scansione. Acquisire immagini ponderate per la diffusione utilizzando le impostazioni predefinite e aprire la scheda Modifica analisi.
Impostare l'orientamento della fetta su assiale e il numero di fette su 25 per ottenere uno spessore della fetta di 500 micrometri e una distanza interna della fetta di 600 micrometri e modificare la direzione di lettura in sinistra-destra. Nella scheda Geometria regolare i parametri geometrici e regolare il campo visivo e le dimensioni della matrice a 105 per 105 per garantire una risoluzione di 333 per 333 micrometri. Fare clic sulla scheda Diffusione all'interno della scheda Ricerca per ciascuno dei tre gusci di diffusione e regolare il numero di direzioni di diffusione su 32 per la prima shell, 46 per la seconda shell e 64 per la terza shell.
Impostare il numero di immagini B0 su cinque per la prima shell, cinque per la seconda shell e sette per la terza shell e regolare le direzioni di sfumatura con file di direzione sfumati personalizzati. Regolare il valore B per direzione a 800 secondi per millimetro al quadrato per il primo guscio, 1.500 secondi per millimetro al quadrato per il secondo guscio e 2.000 secondi per millimetro al quadrato per il terzo guscio, quindi aprire l'Editor geometria e posizionare il campo visivo tra il bulbo e il cervelletto contenente solo il cerebro per ridurre il tempo di artefatto e scansione. Al completamento del protocollo di scansione, trasferire l'animale dal letto dello scanner a una gabbia pulita con una pastiglia riscaldante Celsius di 37 gradi con monitoraggio fino alla piena reclinabilità.
Per l'elaborazione delle immagini mri di diffusione, caricare le immagini in MRtrix3 ed eseguire la correzione del rumore e la correzione dello squillo di Gibbs sulle immagini ponderate per la diffusione nel programma software. Convertire le immagini corrette e ponderate per la diffusione nell'immagine T2 nel formato NIFTI come indicato. Per eseguire la correzione per l'imaging eco-planare, il movimento e le distorsioni della corrente parasospettica, nel menu Plug-in di ExploreDTI selezionare Correzione per le distorsioni EC/EPI del movimento soggetto e selezionare il file di dati di diffusione pre-elaborazione.
Per calcolare le metriche di imaging del tensore di diffusione per ogni ratto, fare clic su Plug-in ed Esporta cose in NIFTI, quindi selezionare le mappe parametriche del modello di imaging del tensore di diffusione ed esportare le mappe parametriche per i modelli di integrità della curtosi e del tratto di materia bianca. Per creare un file maschera per l'ippocampo di ogni ratto, caricare l'immagine di anisotropia frazionaria del ratto nel visualizzatore MRtrix e fare clic sul pulsante più per creare una nuova regione di interesse. Per estrarre le metriche di diffusione dell'ippocampo del ratto, importare il file della maschera creato nel software AMIDE e aprire le mappe parametriche e l'immagine della maschera del ratto.
Per aggiungere l'area di interesse del file maschera in AMIDE, selezionate l'immagine del file maschera, fate clic su Modifica (Edit), Aggiungi isocontorno area di interesse (Add Region Of Interest) e isocontorno 3D (3D isocontour) e assegnare all'area di interesse un nome significativo. Fare clic sull'area di interesse visualizzata nell'immagine della maschera e verificare che questo volume contenga solo voxel con un valore pari a uno. Per calcolare i valori medi delle metriche di diffusione nell'ippocampo, fare clic su Strumenti e Calcola statistiche regione di interesse e indicare le immagini e la regione di interesse da includere.
Dopo aver fatto clic su Esegui, verrà visualizzata una finestra popup con i valori calcolati che possono essere utilizzati per ulteriori analisi statistiche. In questo esperimento rappresentativo, non c'erano prove di frattura del cranio come valutato dall'imaging TC e le immagini T2 non mostravano anomalie nel sito di contusione un giorno dopo il trauma. Per esaminare la qualità del passaggio di co-registrazione non rigido tra l'immagine T2 e il set di dati di diffusione, è stata aggiunta una sovrapposizione dell'immagine T2 alla mappa di anisotropia frazionata codificata a colori.
Le mappe parametriche per l'anisotropia frazionale, la diffusività media, la diffusività assiale e le mappe parametriche della diffusività radiale potrebbero quindi essere calcolate. All'interno della regione di interesse, potrebbe essere eseguito anche il calcolo dei valori medi per i valori assiali, medi e radiali della kurtosi, nonché i valori per la frazione dell'acqua assonale, la diffusività extra-assionale assiale e radiale e la tortuosità dell'integrità del tratto di materia bianca. In questo esperimento rappresentativo, l'analisi delle metriche di imaging del tensore di diffusione ha rivelato un aumento significativo dei valori di anisotropia frazionaria e una diminuzione dei valori di diffusività a seguito dell'impatto nel gruppo delle lesioni cerebrali traumatiche lievi.
Le metriche di curtosi di diffusione hanno anche mostrato una significativa diminuzione della kurtosi radiale a seguito dell'impatto, mentre non sono stati osservati cambiamenti nella kurtosi assiale o media. Utilizzando il modello di integrità del tratto di materia bianca, la diffusività extra-assonale radiale ha mostrato una diminuzione significativa e la tortuosità ha dimostrato un aumento significativo del gruppo di lesioni cerebrali traumatiche lievi un giorno dopo l'impatto. Durante l'analisi delle immagini, è importante verificare se il formato dati di MRtrix è stato correttamente convertito e importato in ExploreDTI e che ogni passaggio di correzione è stato eseguito correttamente.
Invece dell'analisi basata sul ROI, è possibile applicare un'analisi voxel-by-voxel per indagare le alterazioni del cervello intero. Questa tecnica è molto preziosa nel campo della neuroimaging e può essere applicata anche ad altri disturbi cerebrali, ad esempio demenza e sclerosi multipla.
