O uso da litografia de feixe de íons focalizado, ou FIB, permite aos pesquisadores melhorar a interação da superfície celular projetando superfícies materiais que aumentaram a biocompatibilidade e a integração com o tecido nativo. Com a FIB, as características podem ser gravadas em uma variedade de materiais, como silício, metais e polímeros. Superfícies não-planares também podem ser usadas e o pós-processamento pode ser realizado em dispositivos individuais.
Em geral, este método pode ser usado em outros microscópios. No entanto, diferentes fabricantes de microscópios têm versões únicas do software de padronização, que devem ser otimizadas para cada sistema. Demonstrando o procedimento, será a Srta. Shreya Mahajan, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.
Para se preparar para a montagem, use fórceps de vácuo de ponta fina para pegar cuidadosamente a tira limpa das sondas de silício. Coloque-os em um stub de alumínio limpo usado para digitalizar imagens e gravuras fib do microscópio eletrônico. Use um palito para colocar uma pequena gota de tinta prateada na borda do substrato de silício ao redor da sonda.
Proteja a tira espalhando a tinta prateada ao redor das laterais do substrato de silício ao redor da sonda. Deixe a tinta prateada secar completamente antes de colocar o stub de alumínio no SEM FIB. Em seguida, clique no botão Ventilação na guia Controle de feixe para ventilar a câmara SEM FIB.
Pressione Shift F3 para realizar o palco em casa. Confirme a seleção, selecionando o botão Home Stage na janela pop-up. Após a conclusão do Home Stage, mova o estágio para coordenar X=70 milímetros, Y=70 milímetros, Z=0 milímetros, T=0 graus, R=0 graus.
Uma vez que a câmara é ventilada, coloque luvas de nitrilo limpas e abra a porta da câmara. Insira o stub de alumínio segurando as sondas na parte superior do adaptador de palco. Fixar a barba de alumínio apertando o parafuso do conjunto na lateral do adaptador de palco.
Certifique-se de que a altura está ajustada adequadamente. Use a chave hexérica de 1,5 milímetros para esta tarefa. Balance cuidadosamente o braço da câmera de navegação aberto até que pare.
O estágio do microscópio se moverá automaticamente para uma posição abaixo da câmera. Assista a imagem ao vivo mostrada no Quadrante Três da interface do usuário do microscópio. Uma vez que o nível de brilho se ajuste automaticamente para um nível apropriado, adquira a imagem pressionando o botão para baixo no suporte da câmera.
Isso leva aproximadamente 10 segundos. Gire o braço da câmera de volta para a posição fechada. O palco voltará à posição original.
Feche cuidadosamente a porta da câmara do microscópio. Assista a imagem da câmera CCD no Quadrante Quatro enquanto fecha a porta. Certifique-se de que as amostras e o estágio estão a uma distância segura de qualquer componente crítico na câmara de microscópio.
Selecione o botão Bomba com Limpeza de Amostras no software de interface do usuário para iniciar a bomba de vácuo da câmara e o limpador de plasma embutido. Aguarde aproximadamente oito minutos para que o tempo de bombeamento e o ciclo de limpeza do plasma da câmara de microscópio sejam concluídos. Uma vez que o ícone no canto inferior direito da interface do usuário fique verde, pressione o botão Despertar para cima na guia de controle do feixe que liga os feixes eletrônicos e íons.
Selecione Quadrante Um e defina o sinal do feixe para o feixe de elétrons. Em seguida, defina Quadrante 2 a Ion Beam. Agora, ajuste a tensão SEM para cinco quilovolts, a corrente de feixe SEM para 0,20 nanoampes, o DETECTOR SEM para ETD e o Modo Detector para Elétrons Secundários.
Ajuste a Tensão FIB para 30 quilovolts, o feixe FIB para 24 picoamps, o detector FIB para detector de gelo e o modo detector para o Elétron Secundário. Clique duas vezes na sonda de silício na imagem da câmera de navegação, Quadrante Três para mover o palco para a localização aproximada da sonda. Clique no Quadrante Um para selecioná-lo como o quadrante ativo e aperte o botão de pausa para iniciar a varredura SEM.
Defina o tempo de hora da varredura para 300 nanossegundos e desligue o Digital Interlacing, a Integração de Linha e a Média de Quadros. Defina a rotação de varredura a zero na guia Controle de feixe. Clique com o botão direito do mouse no Ajustador 2D do Beam Shift e selecione zero.
Ajuste a ampliação ao valor mínimo girando o botão de ampliação no sentido anti-horário no painel de interface do usuário do microscópio. Ajuste o brilho e o contraste da imagem usando os botões no painel da interface do usuário ou no ícone da barra de ferramentas de brilho de contraste automático. Mova o palco duas vezes à esquerda clicando no mouse em um recurso para centralizar.
Em seguida, mova a sonda de silício desejada para ser padronizada no centro da imagem SEM. Localize uma borda ou outra característica, como uma partícula de poeira ou arranhão. Aumente a ampliação para 2000x girando o botão de ampliação no sentido horário.
Ajuste o foco do SEM girando os botões de foco grosseiro e fino na interface do usuário do microscópio, até que a imagem esteja em foco. Uma vez que a imagem esteja em foco, selecione a amostra link Z para o botão de distância de trabalho na barra de ferramentas. Confirme se a operação foi concluída olhando para a coordenada do eixo Z na guia de navegação.
O valor deve ser de aproximadamente 11 milímetros. Digite 4,0 milímetros na posição do eixo Z e aperte o botão Ir Para com o mouse. Mova o estágio em X e Y para localizar o ombro da sonda de silicone.
Posicione-o o mais próximo possível do centro do SEM. Altere a inclinação do palco para 52 graus digitando em 52 na coordenada T e acertando Enter. Observe se o ombro da sonda parece se mover para cima ou para baixo na imagem.
Use o controle deslizante estágio Z para trazer o ombro da sonda de volta ao centro da imagem SEM. Apenas ajuste a posição Z. Não mova o eixo X, Y, T ou R.
Execute o recurso de alinhamento XT embutido, localizado no menu suspenso do palco. Use o mouse para clicar em dois pontos paralelos à borda da sonda. Certifique-se de que o botão de rádio horizontal está selecionado na janela pop-up e clique em Concluir.
O palco irá girar para alinhar a sonda com o eixo X do palco. Ajuste o estágio em XY usando o mouse para colocar o ombro inferior da sonda no centro da imagem SEM novamente. Selecione o FIB no Quadrante Dois e certifique-se de que a corrente do feixe ainda esteja em 24 picoamps.
Defina a ampliação para 5000X e o tempo de moradia para 100 nanossegundos. Digite controle-F no teclado para definir o foco FIB para 13 milímetros. Na guia Controle de feixe, clique com o botão direito do mouse no ajustador 2D Stigmator e selecione zero.
Além disso, clique com o botão direito do mouse no ajustador Beam Shift 2D e selecione zero. Defina a rotação da varredura em zero graus e clique no botão de brilho de contraste automático na barra de ferramentas. Procure uma imagem do ombro da sonda no Quadrante 2.
Use a ferramenta snapshot para adquirir uma imagem no FIB. Confirme se o ombro da sonda está no centro da imagem FIB. Se não, clique duas vezes no ombro da sonda para movê-lo para o centro.
Mova o palco para a esquerda empurrando a tecla de seta esquerda no teclado aproximadamente 10 a 15 vezes. Tire outra foto e observe se o lado da sonda ainda está no centro da FIB. Depois de repetir esses passos até que a borda do ombro da sonda esteja perfeitamente alinhada com o eixo X do estágio, use o FIB para mover o palco de volta para o ombro inferior da sonda.
Salve a posição do estágio na lista de posição clicando no botão Adicionar. Altere a corrente de feixe FIB para 2,5 nanoampes e certifique-se de que a ampliação da FIB ainda é de 5000X. Execute a função de contraste de brilho automático e defina o tempo de moradia fib para 100 nanossegundos.
Aperte o botão de pausa para iniciar a varredura. Ajuste o foco fib e o astigmatismo o mais rápido e precisamente possível usando os botões de foco grosseiro e fino e os botões estigmator X e Y no painel de interface do usuário. Aperte o botão de pausa para parar a varredura FIB.
Dentro do software Nanobuilder, abra o arquivo para padronizar as sondas de silício. Selecione o menu suspenso do microscópio e selecione Definir Origem do Palco. Selecione o menu suspenso do microscópio e selecione Calibrar detectores.
Na interface do usuário do microscópio, clique em Quad One uma vez com o mouse para selecionar Quad One. Clique em OK para iniciar a calibração. O processo levará cerca de cinco minutos.
Certifique-se de calibrar os detectores ETD e ICE. Dentro do software, selecione o menu suspenso do microscópio e escolha Executar para iniciar a sequência de padronagem. Quando o padrão estiver completo, feche o software.
Aperte a ventilação na guia Controle de feixe da interface do usuário do microscópio para desligar os feixes do microscópio e iniciar o ciclo de ventilação. Enquanto a câmara está ventando, mova o palco para as coordenadas adequadas. Uma vez que a câmara é ventilada, coloque luvas de nitrilo limpas e abra a porta da câmara.
Solte o parafuso do conjunto no adaptador de stub usando a chave hexam. Remova o stub de alumínio contendo a sonda padronizada da câmara. Feche cuidadosamente a porta da câmara do microscópio.
Assista a imagem da câmera CCD no Quadrante Quatro enquanto fecha a porta. Certifique-se de que o adaptador de palco esteja a uma distância segura de qualquer componente crítico na câmara de microscópio. São mostradas aqui imagens SEM das sondas de silício de haste única não funcionais com nanoarquites gravadas por FIB ao longo da parte de trás da haste.
As dimensões finais da nanoarquitetologia gravada foram 200 nanômetros de linhas paralelas de largura espaçadas a 300 nanômetros e tinham uma profundidade de 200 nanômetros. Para determinar como a gravação de nanoarquites na superfície da sonda afeta a densidade neuronal imediatamente ao redor do implante, os núcleos neuronais foram manchados e quantificados. A sobrevivência neuronal é apresentada como uma porcentagem da região de fundo das mesmas distâncias de 50 micron bins longe do local do implante.
Havia significativamente mais neurônios ao redor das sondas de nanoarar arquitetura a 100 a 150 mícrons de distância do local do implante em comparação com os implantes de controle suave em quatro semanas após a implantação. As nanoarquitações também foram gravadas ao longo da parte de trás de microeletrodos funcionais de silício de haste única e medidas eletrofisiológicas foram quantificadas para investigar como as nanoarquites de gravura afetam o desempenho do eletrodo. Os resultados eletrofisiológicos mostraram aumento de percentuais de canais registrando unidades únicas a partir das microeletrodos nano-arquitetura em comparação com os microeletrodos de controle suave.
Não foi realizada análise estatística para a microeletrância nanoartécnica porque apenas uma foi implantada para um estudo piloto de prova de conceito. A gravação de FIB permite que os pesquisadores investiguem como a adição de pistas topográficas em dispositivos médicos pode melhorar a resposta celular e, finalmente, o desempenho do dispositivo. A amplitude dos dispositivos médicos aos os mesmos métodos é ilimitada, uma vez que a FIB pode ser realizada em uma variedade de materiais, geometrias superficiais e, o mais importante, dispositivos já fabricados.
