집중 이온 빔 리소그래피( FIB)를 사용하면 연구자가 생체 적합성및 네이티브 조직과의 통합을 증가시킨 물질 표면을 설계하여 세포 표면 상호 작용을 개선할 수 있습니다. FIB를 사용하면 실리콘, 금속 및 폴리머와 같은 다양한 재료에 피쳐를 새겨야 합니다. 평면이 아닌 표면도 사용할 수 있으며 개별 장치에서 포스트 프로세싱을 수행할 수 있습니다.
일반적으로,이 방법은 다른 현미경에 사용할 수 있습니다. 그러나, 다른 현미경 제조 업체는 각 시스템에 최적화해야 패터닝 소프트웨어의 독특한 버전을 가지고있다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생인 슈레이야 마하얀 양이 될 것입니다.
장착을 준비하려면 미세 팁보어 진공 집게를 사용하여 실리콘 프로브의 깨끗한 스트립을 조심스럽게 집어 들수 있습니다. 전자 현미경 FIB 이미징 및 에칭을 스캔하는 데 사용되는 깨끗한 알루미늄 스텁에 놓습니다. 이쑤시개를 사용하여 프로브를 둘러싼 실리콘 기판 가장자리에 작은 은 페인트 방울을 놓습니다.
프로브를 둘러싼 실리콘 기판의 측면 주위에 은페인트를 퍼감으로써 스트립을 확보하십시오. 알루미늄 스텁을 SEM FIB에 넣기 전에 실버 페인트가 완전히 건조되도록 합니다. 다음으로 빔 컨트롤 탭의 벤트 버튼을 클릭하여 SEM FIB 챔버를 배출합니다.
시프트 F3를 눌러 홈 스테이지를 수행합니다. 팝업 창에서 홈 스테이지 버튼을 선택하여 선택 항목을 확인합니다. 홈 스테이지가 완료되면 스테이지를 이동하여 X=70밀리미터, Y=70밀리미터, Z=0밀리미터, T=0도, R=0도 를 조정합니다.
챔버가 환기되면 깨끗한 니트릴 장갑을 착용하고 챔버 문을 엽니다. 프로브를 스테이지 어댑터 의 상단에 고정하는 알루미늄 스텁을 삽입합니다. 스테이지 어댑터 측면에 있는 세트 나사를 조이면 알루미늄 스텁을 고정하십시오.
높이가 적절하게 조정되었는지 확인합니다. 이 작업에 는 1.5 밀리미터 육포 렌치를 사용하십시오. 네비게이션 카메라 암이 멈출 때까지 조심스럽게 스윙합니다.
현미경 단계는 자동으로 카메라 아래 위치로 이동합니다. 현미경 사용자 인터페이스의 사분면 3에 표시된 라이브 이미지를 시청하십시오. 밝기 수준이 적절한 수준으로 자동 조정되면 카메라 브래킷의 버튼을 아래로 눌러 이미지를 얻습니다.
이 작업을 수행하려면 약 10초가 걸립니다. 카메라 팔을 닫힌 위치로 다시 스윙합니다. 스테이지는 원래 위치로 돌아갑니다.
현미경 챔버 도어를 조심스럽게 닫습니다. 문을 닫는 동안 쿼드런트 4에서 CCD 카메라 이미지를 시청하십시오. 샘플과 스테이지가 현미경 챔버의 중요한 구성 요소로부터 안전한 거리인지 확인합니다.
사용자 인터페이스 소프트웨어에서 샘플 클리닝 버튼이 있는 펌프를 선택하여 챔버 진공 펌프와 내장 플라즈마 클리너를 시작합니다. 현미경 챔버의 펌핑 시간 및 플라즈마 세척 주기가 완료될 때까지 약 8분 동안 기다립니다. 사용자 인터페이스의 오른쪽 하단 모서리에 있는 아이콘이 녹색으로 바뀌면 전자와 이온 빔을 켜는 빔 컨트롤 탭의 웨이크 업 버튼을 누릅니다.
사분면 하나를 선택하고 빔 신호를 전자 빔으로 설정합니다. 그런 다음 사분면 2개를 이온 빔으로 설정합니다. 이제 SEM 전압을 5킬로볼트로 설정하고 SEM 빔 전류를 0.20 나노앰프로, SEM 검출기는 ETD로, 검출기 모드를 이차 전자로 설정합니다.
FIB 전압을 30킬로볼트로 설정하고 FIB 빔을 24피코앰프로, FIB 검출기는 ICE 검출기로, 검출기 모드를 보조 전자로 설정합니다. 네비게이션 카메라 이미지의 실리콘 프로브를 두 번 클릭하면 쿼드런트 3을 클릭하여 스테이지를 프로브의 대략적인 위치로 이동합니다. 사분면 하나를 클릭하여 활성 사분면으로 선택하고 일시 중지 버튼을 눌러 SEM 스캔을 시작합니다.
스캔 거주 시간을 300나노초로 설정하고 스캔 인터레이스, 라인 통합 및 프레임 평균을 끕니다. 빔 컨트롤 탭에서 스캔 회전을 0으로 설정합니다. 빔 시프트 2D 조절기를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 0을 선택합니다.
현미경 사용자 인터페이스 패널에서 반시계 방향으로 배율 노브를 돌려 배율을 최소 값으로 조정합니다. 사용자 인터페이스 패널 또는 자동 대비 밝기 도구 모음 아이콘의 노브를 사용하여 이미지 밝기와 대비를 조정합니다. 피처의 마우스를 클릭하여 두 번 왼쪽으로 스테이지를 이동하여 중앙에 있습니다.
그런 다음 원하는 실리콘 프로브를 이동하여 SEM 이미지의 중심으로 패턴화합니다. 먼지 입자 또는 스크래치와 같은 가장자리 또는 기타 피쳐를 찾습니다. 배율 노브를 시계 방향으로 돌려 2000배배율을 늘립니다.
이미지가 초점이 될 때까지 현미경 사용자 인터페이스에 거칠고 미세한 초점 노브를 돌려 SEM의 초점을 조정합니다. 이미지가 포커스가 되면 도구 모음에서 작업 거리 버튼에 대한 링크 샘플 Z를 선택합니다. 탐색 탭에서 Z축 좌표를 확인하여 작업이 완료된지 확인합니다.
값은 약 11밀리미터여야 합니다. Z축 위치에 4.0밀리미터를 입력하고 마우스로 이동 버튼으로 이동 버튼을 누를 수 있습니다. 실리콘 프로브의 어깨를 찾기 위해 X와 Y의 스테이지를 이동합니다.
가능한 한 SEM의 중심에 가깝게 배치합니다. T 좌표에서 52도에 입력하여 스테이지 기울기를 52도로 변경하고 Enter. 프로브의 어깨가 이미지에서 위 또는 아래로 이동하는 것처럼 보이는지 관찰합니다.
스테이지 Z 슬라이더를 사용하여 프로브의 어깨를 SEM 이미지의 중심으로 다시 가져옵니다. Z 위치만 조정합니다. X, Y, T 또는 R 축을 이동하지 마십시오.
스테이지 드롭다운 메뉴에 있는 기본 제공 XT 정렬 기능을 실행합니다. 마우스를 사용하여 프로브 가장자리와 평행한 두 점을 클릭합니다. 매는 팝업 창에서 수평 라디오 버튼을 선택하고 마무리를 클릭합니다.
스테이지가 회전하여 프로브를 스테이지의 X축과 정렬합니다. 마우스를 사용하여 SEM 이미지의 중앙에 프로브의 하부 어깨를 다시 배치하여 XY의 스테이지를 조정합니다. 쿼드런트 2에서 FIB를 선택하고 빔 전류가 여전히 24 picoamps인지 확인합니다.
배율을 5000X로 설정하고 거주 시간을 100 나노초로 설정합니다. 키보드의 제어-F를 입력하여 FIB 포커스를 13mm로 설정합니다. 빔 컨트롤 탭에서 낙인 2D 어저스터를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 0을 선택합니다.
또한 빔 시프트 2D 어저스터를 마우스 오른쪽 으로 클릭하고 0을 선택합니다. 스캔 회전을 0도로 설정하고 도구 모음에서 자동 대비 밝기 버튼을 클릭합니다. 쿼드런트 2에서 프로브 숄더의 이미지를 찾습니다.
스냅샷 도구를 사용하여 FIB에서 이미지를 가져옵니다. 프로브 어깨가 FIB 이미지의 중심에 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 프로브 어깨를 두 번 클릭하여 중앙으로 이동합니다.
키보드의 왼쪽 화살표 키를 약 10~15회 밀어 스테이지를 왼쪽으로 이동합니다. 다른 스냅샷을 찍고 프로브 측이 FIB의 중심에 있는지 여부를 관찰합니다. 프로브 숄더의 가장자리가 스테이지의 X축과 완벽하게 정렬될 때까지 이러한 단계를 반복한 후 FIB를 사용하여 스테이지를 프로브의 하부 어깨로 다시 이동합니다.
추가 단추를 클릭하여 위치 목록에서 스테이지 위치를 저장합니다. FIB 빔 전류를 2.5 나노앰브로 변경하고 FIB의 배율이 여전히 5000X인지 확인합니다. 자동 밝기 대비 기능을 실행하고 FIB 거주 시간을 100나노초로 설정합니다.
일시 중지 버튼을 눌러 스캔을 시작합니다. 사용자 인터페이스 패널의 거칠고 미세한 초점 노브와 X 및 Y 낙인 손잡이를 사용하여 FIB 초점과 난시를 가능한 한 빠르고 정확하게 조정합니다. 일시 중지 버튼을 눌러 FIB 스캔을 중지합니다.
Nanobuilder 소프트웨어 내에서 실리콘 프로브 를 패턴화하기 위한 파일을 엽니다. 현미경 드롭다운 메뉴를 선택하고 스테이지 오리진 설정을 선택합니다. 현미경 드롭다운 메뉴를 선택한 다음 교정 감지기를 선택합니다.
현미경 사용자 인터페이스에서 쿼드 원(Quad One)을 마우스로 한 번 클릭하여 쿼드 하나를 선택합니다. 확인을 클릭하여 교정을 시작합니다. 이 과정은 약 5분이 소요됩니다.
ETD 및 ICE 검출기가 교정되는지 확인합니다. 소프트웨어 내에서 현미경 드롭다운 메뉴를 선택하고 실행 실행을 선택하여 패터닝 시퀀스를 시작합니다. 패턴이 완료되면 소프트웨어를 닫습니다.
현미경 사용자 인터페이스 빔 제어 탭에서 통풍구를 누르고 현미경 빔을 종료하고 통풍구 주기를 시작합니다. 챔버가 환기하는 동안 스테이지를 적절한 좌표로 이동합니다. 챔버가 환기되면 깨끗한 니트릴 장갑을 착용하고 챔버 문을 열어 놓습니다.
1.5밀리미터 육각렌치를 사용하여 스텁 어댑터에 세트 나사를 느슨하게 합니다. 챔버에서 패턴 프로브가 들어 있는 알루미늄 스텁을 제거합니다. 현미경 챔버 도어를 조심스럽게 닫습니다.
문을 닫는 동안 쿼드런트 4에서 CCD 카메라 이미지를 시청하십시오. 스테이지 어댑터가 현미경 챔버의 중요한 구성 요소로부터 안전한 거리인지 확인합니다. 여기에 는 생크의 뒷면을 따라 FIB 에칭 나노 아키텍처와 비 기능 적 단일 생크 실리콘 프로브의 SEM 이미지가 표시됩니다.
에칭 나노 아키텍처의 최종 치수는 200 나노미터 폭 의 평행선이 300 나노미터 떨어져 있으며 깊이는 200 나노미터였습니다. 프로브 표면으로 나노 아키텍처를 에칭하는 것이 임플란트 주변의 신경 밀도에 미치는 영향을 결정하기 위해 뉴런 핵은 염색되고 정량화되었습니다. 신경 생존은 임플란트 부위로부터 멀리 떨어져 있는 50미크로너 빈의 동일한 동물 거리에서 배경 영역의 백분율로 제시된다.
이식 후 4주 동안 원활한 제어 임플란트와 비교하여 임플란트 부위로부터 100~150마이크로론 거리에서 나노 아키텍처 프로브 주변에 훨씬 더 많은 뉴런이 있었다. 나노 아키텍처는 또한 기능적인 단일 생크 실리콘 마이크로 전극및 전기 생리학적 측정의 뒷면을 따라 FIB에 새겨져 에칭 나노 아키텍처가 전극 성능에 미치는 영향을 조사하기 위해 정량화되었다. 전기 생리학적 결과는 매끄러운 제어 미세 전극에 비해 나노 아키텍처 미세 전극에서 단일 단위를 기록하는 채널의 증가 비율을 보였다.
개념 파일럿 연구의 증거를 위해 하나만 이식되었기 때문에 나노 아키텍처 마이크로 전극에 대한 통계 적 분석이 수행되지 않았습니다. FIB 에칭은 연구원이 의료 기기에 지형 큐를 추가하면 세포 반응과 궁극적으로 장치의 성능을 향상시킬 수있는 방법을 조사 할 수 있습니다. FIB는 다양한 재료, 표면 형상 및 가장 중요한 것은 이미 제조된 장치에서 수행할 수 있기 때문에 이러한 방법을 적용할 수 있는 의료 기기의 폭은 무한합니다.
