Die Verwendung der fokussierten Ionenstrahllithographie (FIB) ermöglicht es Forschern, die Zelloberflächeninteraktion zu verbessern, indem sie Materialoberflächen entwerfen, die die Biokompatibilität und Integration mit dem nativen Gewebe erhöht haben. Mit FIB können Merkmale auf einer Vielzahl von Materialien wie Silizium, Metallen und Polymeren geätzt werden. Nicht planare Oberflächen können auch verwendet werden und die Nachbearbeitung kann auf einzelnen Geräten durchgeführt werden.
Im Allgemeinen kann diese Methode auf anderen Mikroskopen verwendet werden. Verschiedene Mikroskophersteller verfügen jedoch über einzigartige Versionen der Mustersoftware, die für jedes System optimiert werden müssen. Demonstrieren das Verfahren, wird Miss Shreya Mahajan, eine Studentin aus meinem Labor.
Zur Vorbereitung der Montage verwenden Sie feinspitzen Bohrungsvakuumzange, um den sauberen Streifen von Siliziumsonden sorgfältig aufzunehmen. Legen Sie sie auf einen sauberen Aluminiumstummel, der für das Rasterelektronenmikroskop FIB-Bildgebung und Ätzen verwendet wird. Verwenden Sie einen Zahnstocher, um einen winzigen Tropfen Silberfarbe am Rand des Siliziumsubstrats zu platzieren, das die Sonde umgibt.
Sichern Sie den Streifen, indem Sie die silberne Farbe um die Seiten des Siliziumsubstrats, das die Sonde umgibt, verteilen. Lassen Sie die silberne Farbe vollständig trocknen, bevor Sie den Aluminiumstummel in die SEM FIB legen. Klicken Sie als Nächstes auf die Entlüftungstaste in der Registerkarte Beam Control, um die SEM FIB-Kammer zu entlüften.
Drücken Sie Shift F3, um die Heimbühne durchzuführen. Bestätigen Sie die Auswahl, indem Sie im Popup-Fenster die Schaltfläche "Startphase" auswählen. Nachdem die Home-Phase abgeschlossen ist, verschieben Sie die Stufe auf die Koordinaten X=70 Millimeter, Y=70 Millimeter, Z=0 Millimeter, T=0 Grad, R=0 Grad.
Sobald die Kammer entlüftet ist, saubere Nitrilhandschuhe anziehen und die Kammertür öffnen. Stecken Sie den Aluminiumstummel, der die Sonden hält, in die Oberseite des Bühnenadapters. Sichern Sie den Aluminium-Stummel, indem Sie die eingestellte Schraube an der Seite des Bühnenadapters anziehen.
Stellen Sie sicher, dass die Höhe entsprechend angepasst ist. Verwenden Sie für diese Aufgabe den 1,5-Millimeter-Sechskantschlüssel. Schwenken Sie vorsichtig den Arm der Navigationskamera öffnen, bis er anhält.
Die Mikroskopstufe bewegt sich automatisch an eine Position unter der Kamera. Sehen Sie sich das Live-Bild in Quadrant Three der Mikroskop-Benutzeroberfläche an. Sobald sich die Helligkeitsstufe automatisch auf eine entsprechende Ebene anpasst, erfassen Sie das Bild, indem Sie die Taste auf der Kamerahalterung nach unten drücken.
Dies dauert ca. 10 Sekunden. Schwenken Sie den Kameraarm zurück in die geschlossene Position. Die Bühne kehrt zur ursprünglichen Position zurück.
Schließen Sie die Mikroskopkammertür vorsichtig. Beobachten Sie das CCD-Kamerabild in Quadrant Four, während Sie die Tür schließen. Stellen Sie sicher, dass die Proben und die Bühne einen sicheren Abstand von jeder kritischen Komponente in der Mikroskopkammer haben.
Wählen Sie die Pumpe mit Probenreinigungstaste in der Benutzeroberflächensoftware aus, um die Kammervakuumpumpe und den eingebauten Plasmareiniger zu starten. Warten Sie etwa acht Minuten, bis die Pumpzeit und der Plasmareinigungszyklus der Mikroskopkammer abgeschlossen sind. Sobald das Symbol in der unteren rechten Ecke der Benutzeroberfläche grün wird, drücken Sie die Wake Up-Taste in der Balkensteuerungs-Registerkarte, die den Elektronen- und Ionenstrahl einschaltet.
Wählen Sie Quadrant One und stellen Sie das Strahlsignal auf Elektronenstrahl ein. Legen Sie dann Quadrant Two auf Ionenstrahl fest. Stellen Sie nun die SEM-Spannung auf fünf Kilovolt, den SEM-Strahlstrom auf 0,20 Nanoamps, den SEM-Detektor auf ETD und den Detektormodus auf Sekundärelektronen.
Stellen Sie die FIB-Spannung auf 30 Kilovolt, den FIB-Strahl auf 24 Picoamps, den FIB-Detektor auf ICE-Detektor und den Detektormodus auf das Sekundärelektron ein. Doppelklicken Sie auf die Siliziumsonde im Navigationskamerabild Quadrant Three, um die Bühne an die ungefähre Position der Sonde zu bewegen. Klicken Sie auf Quadrant One, um ihn als aktiven Quadranten auszuwählen, und klicken Sie auf die Pause-Taste, um den SEM-Scan zu starten.
Stellen Sie die Scanverweilzeit auf 300 Nanosekunden ein, und deaktivieren Sie Scan-Interlacing, Line Integration und Frame Averaging. Legen Sie die Scanrotation auf null in der Registerkarte Beam Control fest. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Beam Shift 2D Adjuster und wählen Sie Null aus.
Passen Sie die Vergrößerung auf den Minimalwert an, indem Sie den Vergrößerungsknopf gegen den Uhrzeigersinn auf dem Bedienfeld der Mikroskop-Benutzeroberflächen drehen. Passen Sie die Bildhelligkeit und den Kontrast mit den Knöpfen auf dem Bedienfeld der Benutzeroberfläche oder dem Symbol der Automatischen Kontrasthelligkeitssymbolleiste an. Bewegen Sie die Bühne, indem Sie mit der Linken auf ein Feature klicken, um sie zu zentrieren.
Bewegen Sie dann die gewünschte Siliziumsonde, die in die Mitte des SEM-Bildes gemustert werden soll. Suchen Sie eine Kante oder ein anderes Feature, z. B. ein Staubpartikel oder Kratzer. Erhöhen Sie die Vergrößerung auf 2000x, indem Sie den Vergrößerungsknopf im Uhrzeigersinn drehen.
Passen Sie den Fokus des SEM an, indem Sie die groben und feinen Fokusknöpfe auf der Mikroskop-Benutzeroberfläche drehen, bis das Bild im Fokus steht. Sobald das Bild im Fokus ist, wählen Sie die Schaltfläche Beispiel Z mit Arbeitsabstand in der Symbolleiste verknüpfen aus. Bestätigen Sie, dass der Vorgang abgeschlossen wurde, indem Sie sich die Z-Achsen-Koordinate auf der Navigationsregisterkarte ansehen.
Der Wert sollte etwa 11 Millimeter betragen. Geben Sie 4,0 Millimeter in der Z-Achsenposition ein und drücken Sie die Taste Go To mit der Maus. Bewegen Sie die Bühne in X und Y, um die Schulter der Siliziumsonde zu lokalisieren.
Positionieren Sie es so nah wie möglich an der Mitte des SEM. Ändern Sie die Neigung der Stufe auf 52 Grad, indem Sie in der T-Koordinate 52 eingeben und enter drücken. Beobachten Sie, ob sich die Schulter der Sonde im Bild nach oben oder unten zu bewegen scheint.
Verwenden Sie den Schieberegler Stage Z, um die Schulter der Sonde wieder in die Mitte des SEM-Bildes zu bringen. Passen Sie nur die Z-Position an. Bewegen Sie die X-, Y-, T- oder R-Achse nicht.
Führen Sie das integrierte XT Align Feature aus, das sich im Dropdown-Menü "Bühne" befindet. Klicken Sie mit der Maus auf zwei Punkte parallel zum Rand der Sonde. Mae sicher, dass das horizontale Optionsfeld im Popup-Fenster ausgewählt ist, und klicken Sie auf Fertig stellen.
Die Bühne wird gedreht, um die Sonde an der X-Achse der Bühne auszurichten. Passen Sie die Stufe in XY an, indem Sie die Maus verwenden, um die untere Schulter der Sonde wieder in die Mitte des SEM-Bildes zu stellen. Wählen Sie die FIB in Quadrant Two und stellen Sie sicher, dass der Strahlstrom immer noch 24 Picoamps ist.
Stellen Sie die Vergrößerung auf 5000X und die Verweilzeit auf 100 Nanosekunden ein. Geben Sie Control-F auf der Tastatur ein, um den FIB-Fokus auf 13 Millimeter einzustellen. Klicken Sie auf der Registerkarte Beam Control mit der rechten Maustaste in den Stigmator 2D-Einsteller, und wählen Sie Null aus.
Klicken Sie außerdem mit der rechten Maustaste in die Beam Shift 2D-Einstellertaste, und wählen Sie Null aus. Legen Sie die Scandrehung auf null Grad fest, und klicken Sie in der Symbolleiste auf die Schaltfläche für die automatische Kontrasthelligkeit. Suchen Sie nach einem Bild der Sondenschulter in Quadrant Two.
Verwenden Sie das Snapshot-Tool, um ein Bild in der FIB zu erfassen. Bestätigen Sie, dass sich die Sondenschulter in der Mitte des FIB-Bildes befindet. Wenn nicht, doppelklicken Sie auf die Sondenschulter, um sie in die Mitte zu verschieben.
Bewegen Sie die Bühne nach links, indem Sie die linke Pfeiltaste auf der Tastatur etwa 10 bis 15 Mal drücken. Erstellen Sie einen weiteren Schnappschuss und beobachten Sie, ob sich die Sondenseite noch in der Mitte der FIB befindet. Nachdem Sie diese Schritte wiederholt haben, bis der Rand der Sondenschulter perfekt an der X-Achse der Bühne ausgerichtet ist, verwenden Sie die FIB, um die Bühne zurück zur unteren Schulter der Sonde zu bewegen.
Speichern Sie die Bühnenposition in der Positionsliste, indem Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen klicken. Ändern Sie den FIB-Strahlstrom auf 2,5 Nanoamps und stellen Sie sicher, dass die Vergrößerung der FIB immer noch 5000X beträgt. Führen Sie die Auto-Helligkeits-Kontrastfunktion aus und stellen Sie die FIB-Verweilzeit auf 100 Nanosekunden ein.
Drücken Sie die Pause-Taste, um mit dem Scannen zu beginnen. Passen Sie den FIB-Fokus und den Astigmatismus so schnell und präzise wie möglich mit den groben und feinen Fokusknöpfen und den X- und Y-Stigmatorknöpfen auf dem Bedienfeld der Benutzeroberfläche an. Drücken Sie die Pause-Taste, um das FIB-Scannen zu stoppen.
Öffnen Sie in der Nanobuilder-Software die Datei zum Patterning der Silikonsonden. Wählen Sie das Dropdown-Menü Mikroskop und Stellen Sie Stage Origin ein. Wählen Sie das Dropdown-Menü Mikroskop und dann Diekdetektoren kalibrieren.
Klicken Sie auf der Mikroskop-Benutzeroberfläche einmal mit der Maus auf Quad One, um Quad One auszuwählen. Klicken Sie auf OK, um die Kalibrierung zu starten. Der Vorgang dauert etwa fünf Minuten.
Stellen Sie sicher, dass die ETD- und ICE-Detektoren kalibriert werden. Wählen Sie innerhalb der Software das Dropdown-Menü Mikroskop aus und wählen Sie Ausführen aus, um die Musterfolge zu starten. Wenn das Muster abgeschlossen ist, schließen Sie die Software.
Drücken Sie Vent in der Beam Control-Registerkarte des Mikroskops, um die Mikroskopstrahlen herunterzufahren und den Entlüftungszyklus zu starten. Während die Kammer entlüftet, bewegen Sie die Bühne auf die entsprechenden Koordinaten. Sobald die Kammer entlüftet ist, saubere Nitrilhandschuhe anziehen und die Kammertür öffnen.
Lösen Sie die Eingestelltschraube am Stubenadapter mit dem 1,5-Millimeter-Sechskantschlüssel. Entfernen Sie den Aluminiumstummel, der die gemusterte Sonde enthält, aus der Kammer. Schließen Sie die Mikroskopkammertür vorsichtig.
Beobachten Sie das CCD-Kamerabild in Quadrant Four, während Sie die Tür schließen. Stellen Sie sicher, dass der Bühnenadapter einen sicheren Abstand zu jeder kritischen Komponente in der Mikroskopkammer hat. Hier sind SEM-Bilder der nicht-funktionalen Einschenkelsiliziumsonden mit FIB-geätzten Nano-Architekturen entlang der Rückseite des Schafts zu sehen.
Die endletzten Dimensionen der geätzten Nanoarchitektur waren 200 Nanometer breite Parallellinien im Abstand von 300 Nanometern und hatten eine Tiefe von 200 Nanometern. Um zu bestimmen, wie sich das Ätzen von Nano-Architekturen in die Oberfläche der Sonde auf die neuronale Dichte unmittelbar um das Implantat auswirkt, wurden die neuronalen Nukleii gebeizt und quantifiziert. Das neuronale Überleben wird als Prozentsatz der Hintergrundregion aus den gleichen Tierabständen von 50 Mikron-Behältern von der Implantatstelle dargestellt.
Es gab deutlich mehr Neuronen um die Nano-Architektur-Sonden in 100 bis 150 Mikron Entfernungen von der Implantatstelle im Vergleich zu den glatten Kontrollimplantaten bei vier Wochen nach der Implantation. Nano-Architekturen wurden auch an der Rückseite funktioneller Einzelschaftsilizium-Mikroelektroden geätzt und elektrophysiologische Messungen wurden quantifiziert, um zu untersuchen, wie sich das Ätzen von Nano-Architekturen auf die Elektrodenleistung auswirkt. Elektrophysiologische Ergebnisse zeigten einen erhöhten Prozentsatz von Kanälen, die einzelne Einheiten der Nanoarchitektur-Mikroelektroden im Vergleich zu den glatten Kontrollmikroelektroden aufzeichneten.
Für die Nanoarchitektur-Mikroelektrode wurde keine statistische Analyse durchgeführt, da nur eine für eine Proof-of-Concept-Pilotstudie implantiert wurde. FiB-Ätzen ermöglicht es Forschern zu untersuchen, wie die Zugabe von topografischen Cues auf medizinischen Geräten das zelluläre Ansprechen und letztlich die Leistung des Geräts verbessern kann. Die Breite der medizinischen Geräte, auf die diese Methoden angewendet werden können, ist grenzenlos, da FIB auf einer Reihe von Materialien, Oberflächengeometrien und vor allem bereits hergestellten Geräten durchgeführt werden kann.
