Desenvolvemos um protocolo definido, reprodutível e de longa data para sequenciamento de RNA pequeno e para análise de leituras normalizadas usando ferramentas de bioinformática de código aberto. As principais vantagens de nossa estratégia são que ela coleta com precisão microRNAs através da purificação de gel e que a análise bioinformática pode ser aplicada independentemente de como as microRNAs são coletadas. O sequenciamento de alto rendimento das microRNAs pode revelar a percepção sobre os mecanismos da doença, o processamento de microRNAs e a quantificação precisa de abordagens de terapia genética que fornecem pequenas RNAs.
Certifique-se de trabalhar em um ambiente livre de RNase e manter todos os produtos de RNA no gelo durante todo o procedimento. Visualizar as etapas de corte de gel ajudará os espectadores a identificar o tamanho correto dos produtos necessários para aplicações a jusante. Para três ligaduras principais adaptadores, combine 11 microliters de RNA com 1,5 microliters de tampão de reação ligase ATP free 10X T4RNA, um microliter de polietileno glicol e 0,5 microliters de três elos principais.
Aqueça as amostras a 95 graus Celsius em um termociclador por 30 a 40 segundos, seguido de resfriamento no gelo por um minuto. Adicione um microliter de ligase T4RNA dois e incubar a reação à temperatura ambiente por duas horas. Enquanto as amostras estão incubando, despeje um gel de poliacrilamida de 15% entre placas de vidro separadas de 0,8 milímetros em um molde plástico e insira um pente.
Quando o gel se solidificar, adicione 0,5 5X TBE ao tanque e a pipeta vigorosamente para lavar os poços de ureia residual. Depois de pré-executar o gel de poliacrilamida por 25 minutos a 375 volts, carregue as amostras deixando pelo menos uma faixa entre cada amostra. Carregue 20 microliters de pelo menos dois conjuntos de marcadores em um padrão assimétrico para acompanhar a orientação do gel e executar o gel a uma constante de 375 volts.
Após 15 minutos, aumente para 425 volts constantes para o resto da corrida e execute o gel por cerca de duas horas. No final da corrida, use um separador de placas para remover o gel das placas de vidro e coloque o gel em um protetor de página de plástico. Diluir cinco microliters de brometo de etídio em 500 microliters de água destilada e adicionar o corante nas pistas de marcadores logo acima do marcador azul claro superior.
Em seguida, use uma lâmina de barbear limpa para cortar os géis do marcador superior para inferior em cada pista sob luz ultravioleta e transfira as peças para um quadrado de quatro por quatro centímetros de filme de vedação de laboratório. Corte o gel com cerca de três cortes horizontalmente e dois cortes verticalmente para produzir 12 pequenos quadrados. Adicione 400 microliters de 0,3 cloreto de sódio molar na máquina de selar e guie as peças de gel em tubos siliconados de 1,5 mililitro.
Agitar as amostras em um nutador a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, transfira 400 microliters de cada supernatante para novos tubos. Adicione um mililitro de 100% de etanol e um microliter de 15 miligramas por mililitro glycogen co-precipitante por tubo.
Em seguida, armazene os tubos a menos 80 graus Celsius por uma hora. Para cinco ligaduras de linker prime, primeiro gire as amostras descongeladas e resuspenque as pelotas na água. Em seguida, adicione 0,5 microliters de 100 micromolar cinco prime linker, um microliter de tampão ligase T4RNA, um microliter de 10 milimólares ATP, e um microliter de polietileno glicol para cada amostra.
Aqueça as reações a 90 graus Celsius por 30 segundos antes de colocá-las no gelo. Em seguida, adicione um microliter de ligase T4RNA um a cada tubo e incubar as reações à temperatura ambiente por duas horas. Para transcrição reversa, colete as amostras por centrifugação e resuspenja a pelota seca de ar em 8,25 microliters de água livre de nuclease.
Adicione 0,5 microliters de 100 primer de transcriptase reversa micromolar e cinco microliters de mistura de reação de transcriptase reversa 2X de um kit de síntese de DNA complementar. Após três minutos a 42 graus Celsius, adicione 1,5 microliters de enzima transcriptase reversa de 10X a cada amostra para uma incubação de 30 minutos a 42 graus Celsius em um termociclador. Após a neutralização, preparar uma reação pcr com 29,5 microliters de água, cinco microliters de tampão taq 10X, um microliter de triphosfato nucleosídeo, dois microliters de 25 primer dianteiro micromolar, dois microliters de 25 primer reverso micromolar, 0,5 microliters de poliase taqmer, e 10 microliters do DNA reverso transcrito.
Em seguida, execute duas reações pcr. Para purificação de gel de agarose, prepare um gel de 4% de agarose com baixa ágarose de fusão e carregue 40 microliters ou mais do produto PCR no gel com corante de carga e par de 100 bases e 25 marcadores de tamanho de par de base. Depois de executar o gel, corte a banda acima da faixa de 125 bases e use um kit de extração de gel de acordo com as instruções do fabricante.
Agite para dissolver a banda de gel em tampão à temperatura ambiente antes de usar o equipamento apropriado para quantificar a biblioteca de sequência final. Em seguida, use as ferramentas de bioinformática de código aberto apropriadas para analisar os dados de sequência. Nesta reação representativa do PCR em gel de agarose de baixo derretimento, pode-se observar a aquisição do produto clonado correto em comparação com o produto linker obtido e amostras insaturadas versus saturadas.
Após o alinhamento com os grampos de microRNA humanos, pode-se observar uma forte concordância entre as contagens de leitura de microRNA em cada réplica. Um total de 306 espécies de microRNA foram detectadas com o maior número de leituras mapeando para microRNA 122. É importante lembrar de cortar os géis no tamanho apropriado para permitir uma recuperação precisa das microRNAs.
Após o sequenciamento das microRNAs, os usuários podem aplicar uma análise bioinformática para caracterizar a distribuição de microRNAs dentro de seus tecidos de interesse. Esta técnica tem sido usada para identificar como microRNAs são processadas e quais conjuntos de microRNAs são alterados em certos cânceres. Certifique-se de exercitar os cuidados ao manusear o brometo de ethidium e ao olhar para os géis sob luz ultravioleta.
