Wir haben ein definiertes, reproduzierbares und langjähriges Protokoll für die kleine RNA-Sequenzierung und zur Analyse normalisierter Lesevorgänge mit Open-Source-Bioinformatik-Tools entwickelt. Die Hauptvorteile unserer Strategie sind, dass sie microRNAs durch Gelreinigung genau sammelt und dass die Bioinformatik-Analyse unabhängig davon angewendet werden kann, wie die microRNAs gesammelt werden. Die hohe Durchsatzsequenzierung von microRNAs kann Einblicke in Krankheitsmechanismen, die Verarbeitung von microRNAs und die genaue Quantifizierung von Gentherapieansätzen, die kleine RNAs liefern, aufzeigen.
Achten Sie darauf, in einer RNase freien Umgebung zu arbeiten und alle RNA-Produkte während des gesamten Verfahrens auf Eis zu halten. Die Visualisierung der Gelschneideschritte hilft den Betrachtern, die richtige Größe der Produkte zu ermitteln, die für nachgelagerte Anwendungen erforderlich sind. Kombinieren Sie für drei Prime-Adaptor-Ligation11 Mikroliter RNA mit 1,5 MikroliterAT-freiem 10X T4RNA-Ligase-Reaktionspuffer, einem Mikroliter Polyethylenglykol und 0,5 Mikrolitern dreier Hauptlinker.
Erhitzen Sie die Proben bei 95 Grad Celsius auf einem Thermocycler für 30 bis 40 Sekunden, gefolgt von einer Abkühlung auf Eis für eine Minute. Fügen Sie einen Mikroliter T4RNA Ligase zwei hinzu und inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Während die Proben inkubieren, gießen Sie ein 15%polyacyrilamidgel zwischen 0,8 Millimeter getrennten Glasplatten in einen Kunststoffguss und legen Sie einen Kamm ein.
Wenn das Gel erstarrt ist, 0,5 5X TBE in den Tank und Pipette kräftig hinzufügen, um die Brunnen von Restharnstoff zu waschen. Nachdem Sie das Polyacrylamid-Gel 25 Minuten lang bei 375 Volt vorlaufen lassen, laden Sie die Proben und lassen Sie dabei mindestens eine Spur zwischen jeder Probe zurück. Laden Sie 20 Mikroliter von mindestens zwei Sätzen von Markern in einem asymmetrischen Muster, um die Gelausrichtung zu verfolgen und das Gel mit konstanten 375 Volt auszuführen.
Nach 15 Minuten auf konstante 425 Volt für den Rest des Laufs erhöhen und das Gel für etwa zwei Stunden laufen. Verwenden Sie am Ende des Laufs einen Plattenabscheider, um das Gel von den Glasplatten zu entfernen und das Gel auf einen Kunststoffseitenschutz zu legen. Fünf Mikroliter Ethidiumbromid in 500 Mikroliter destilliertem Wasser verdünnen und den Farbstoff auf die Markerspuren direkt über dem oberen hellblauen Marker geben.
Als nächstes verwenden Sie eine saubere Rasierklinge, um die Gele von der oberen zur unteren Markierung in jeder Spur unter ultraviolettem Licht zu schneiden und die Stücke auf ein vier mal vier Zentimeter großes Quadrat Labordichtungsfolie zu übertragen. Schneiden Sie das Gel mit etwa drei Schnitten horizontal und zwei Schnitten vertikal, um 12 kleine Quadrate zu produzieren. 400 Mikroliter 0,3 Mol-Natriumchlorid auf den Dichtfilm geben und die Gelstücke in 1,5 Milliliter silikonisierte Röhren leiten.
Die Proben auf einem Nutator bei vier Grad Celsius über Nacht aufmachen. Am nächsten Morgen 400 Mikroliter jedes Überstandes in neue Schläuche übertragen. Fügen Sie einen Milliliter 100% Ethanol und einen Mikroliter von 15 Milligramm pro Milliliter Glykogen Co-Gefälltmirat pro Tube.
Dann lagern Sie die Rohre bei minus 80 Grad Celsius für eine Stunde. Für fünf Hauptlinker-Ligation, drehen Sie zuerst die aufgetauten Proben und setzen Sie die Pellets in Wasser wieder aus. Als nächstes fügen Sie 0,5 Mikroliter von 100 Mikromolaren fünf Prime Linker, einen Mikroliter T4RNA Ligase Puffer, einen Mikroliter von 10 Millimolar ATP und ein Mikroliter Polyethylenglykol zu jeder Probe hinzu.
Erhitzen Sie die Reaktionen bei 90 Grad Celsius für 30 Sekunden, bevor Sie sie auf Eis legen. Dann fügen Sie einen Mikroliter T4RNA Ligase eins zu jeder Röhre und inkubieren die Reaktionen bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Für die umgekehrte Transkription die Proben per Zentrifugation sammeln und das luftgetrocknete Pellet in 8,25 Mikroliter nukleasefreiem Wasser wieder aufhängen.
Fügen Sie 0,5 Mikroliter 100 Mikromolar Reverse Transkriptase Primer und fünf Mikroliter 2X Reverse Transkriptase Reaktionsmischung aus einem komplementären DNA-Synthese-Kit. Nach drei Minuten bei 42 Grad Celsius 1,5 Mikroliter 10-faches Reverse-Transkriptase-Enzym zu jeder Probe für eine 30-minütige Inkubation bei 42 Grad Celsius in einem Thermocycler hinzufügen. Nach der Neutralisation eine PCR-Reaktion mit 29,5 Mikroliter Wasser, fünf Mikroliter 10X Taq Puffer, einem Mikroliter Nukleosidtriphosphat, zwei Mikrolitern 25 Mikromolaren-Vorwärtsprimer, zwei Mikroliter 25 Mikromollar-Reverseprimer, 0,5 Mikroliter Taq-Polymerase und 10 Mikroliter der umgekehrten transkribierten komplementären DNA vorbereiten.
Führen Sie dann zwei PCR-Reaktionen aus. Für die Agarose-Gel-Reinigung bereiten Sie ein 4%Agarose-Gel mit niedrigschmelzender Agarose vor und laden Sie 40 Mikroliter oder mehr des PCR-Produkts mit Ladefarbstoff und 100 Basispaar- und 25 Basispaar-Größenmarkern auf das Gel. Nach dem Ausführen des Gels schneiden Sie das Band über dem 125 Basispaarband und verwenden Sie ein Gel-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Schütteln, um das Gelband im Puffer bei Raumtemperatur aufzulösen, bevor Sie die entsprechende Ausrüstung verwenden, um die endgültige Sequenzbibliothek zu quantifizieren. Verwenden Sie dann die entsprechenden OpenSource-Bioinformatik-Tools, um die Sequenzdaten zu analysieren. In dieser repräsentativen PCR-Reaktion auf Niedrigschmelz-Agarorose-Gel kann die Erfassung des richtigen geklonten Produkts im Vergleich zum erhaltenen Linker-Linker-Produkt und ungesättigten im Vergleich zu gesättigten Proben beobachtet werden.
Nach der Ausrichtung an menschlichen microRNA-Haarnadeln kann eine starke Übereinstimmung zwischen den microRNA-Lesezahlen in jeder Replikation beobachtet werden. Insgesamt wurden 306 microRNA-Arten mit der größten Anzahl von Lesekarten auf microRNA 122 nachgewiesen. Es ist wichtig, daran zu denken, die Gele in der entsprechenden Größe zu schneiden, um eine genaue Wiederherstellung der microRNAs zu ermöglichen.
Nach der Sequenzierung der microRNAs können Anwender eine Bioinformatik-Analyse anwenden, um die Verteilung von microRNAs in ihrem Gewebe von Interesse zu charakterisieren. Diese Technik wurde verwendet, um zu identifizieren, wie microRNAs verarbeitet werden und welche Sätze von microRNAs bei bestimmten Krebsarten verändert werden. Achten Sie darauf, beim Umgang mit dem Ethidiumbromid und beim Betrachten der Gele unter ultraviolettem Licht Vorsicht walten zu lassen.
