Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da microbiologia, como, como um produto genético difícil de expressar em E.Coli purifica. As principais vantagens dessa técnica são que nenhuma reação enzimática, além do PCR, é o portador, e aplicações comuns para purificação de proteínas podem ser usadas. Embora este método possa fornecer uma visão sobre a purificação de proteínas em estreptococos mutans, também pode ser um informado para outras espécies de microbiota.
Demonstrando o procedimento será o Dr.Mamiko Yamashita, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Após o projeto de primer e extração genômica de DNA de estreptococo mutans, realize o primeiro PCR usando o estreptococo mutans do tipo selvagem e o genoma de estreptococos rompidos como os modelos PCR. Amplie as regiões que abrigam a parte a jusante do gene gtfC e aquelas que abrigam o gene de resistência à especttinomicina usando o gtfC-forward preparado e o primer reverso e o primer spc r-forward e reverso.
Em seguida, eletroforese cada produto PCR em gel de 1%agarose. Use um cortador de banda de gel para extirpa os fragmentos de DNA desejados de aproximadamente 1.000 pares de base e 2.000 pares de base do gel em tubos de microcentrifuuge. Adicione 500 microliters de tampão solubilizador em cada tubo e incuba-os por 10 minutos a 56 graus Celsius para dissolver as fatias de gel.
Purifique os fragmentos usando o método de extração de gel à base de membrana de sílica. Execute um segundo PCR usando os produtos do primeiro PCR como modelos PCR com os primers aninhados e invertidos aninhados. Quando o segundo produto PCR não pode ser confirmado por eletroforese, outro par de primer aninhado deve ser projetado.
eletroforese cinco microlitres da mistura PCR no gel de agarose. Confirme a geração do amplicon apropriado de aproximadamente 3.000 pares de base pela imagem de coloração de gel de brometo de ethidium e prossiga de acordo com o manuscrito. Agora, misture cinco microliters do segundo produto PCR concentrado ao aloquot de 50 microliteres de células de estreptococos de frio e frio e competente, congeladas anteriormente.
Adicione a mistura em uma cuvette de eletroporação e coloque a cuvette na câmara de cuvette do aparelho de eletroporação. Dê um único pulso elétrico de 1,8 quilovolts, 600 ohms e 10 microfarádis por 2,5 milissegundos para as células. Adicione 500 microliters de caldo de infusão cérebro-coração na cuvette.
Espalhe imediatamente de 10 a 100 microlitadores da suspensão em placas de infusão cérebro-coração contendo espectincina. Incubar as placas por dois a seis dias a 37 graus Celsius até que as colônias tenham crescido o suficiente para serem recolhidas. Após a geração de estreptococo mutans sequência de codificação de polihistidina incorporada tensão e inoculação durante a noite sem espectinomicina de acordo com o manuscrito, centrífuga a suspensão da cultura bacteriana por 20 minutos a 10.000 vezes g a quatro graus Celsius.
Transfira a cultura supernante para um copo de vidro de três litros. Para concentrar as proteínas da cultura supernasteante, coloque o supernanato de dois litros em um agitador magnético e comece a mexer vigorosamente. Adicione 1.122 gramas de sulfato de amônio e deixe que o precipitado se forme com agitação vigorosa a quatro graus Celsius durante um período de quatro horas ou durante a noite. Próximo.
centrífugas a solução precipitada de sulfato de amônio a 15.000 vezes g por 20 minutos a quatro graus Celsius. Decantar o supernatante. Com uma espátula, pegue o precipitado e transfira-o para um copo de vidro de 200 mililitros.
Resuspenda as pelotas em 35 mililitros de tampão de ligação. Em seguida, transfira cada um aproximadamente 25 mililitros da suspensão para um tubo de diálise de celulose regenerada. Coloque a tubulação de diálise em 2,5 litros do amortecedor de ligação em um agitador a quatro graus Celsius para dilisar a suspensão.
Substitua a solução de diálise após duas horas e continue a diálise durante a noite. Em seguida, transfira a suspensão dialisada da tubulação para tubos de centrífuga e coloque os tubos na centrífuga a 20.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Com o equipamento de filtragem da seção, despeje o supernascer sobre um filtro de membrana de 0,2 micrômetro para filtrar.
Transfira o filtrado para um frasco de 75 mililitros. Para fracionar o gtfSI marcado por polihistidina da suspensão filtrada, primeiro prepare uma cromatografia de afinidade metálica imobilizada. Depois de equilibrar a resina de acordo com o manuscrito, feche o pau de beliscar Hoffman.
Adicione cinco mililitros da suspensão filtrada na coluna para fazer um chorume. Em seguida, transfira todo o chorume para a suspensão filtrada restante e gire a mistura suavemente por 30 minutos a quatro graus Celsius. Coloque a mistura de volta na coluna.
Abra o pau de beliscar Hoffman para remover a suspensão pelo fluxo de gravidade. Lave a resina IMAC com 20 mililitros de tampão de ligação e, em seguida, elute 20 mililitros de tampão de elução para obter o gtfSI recombinante. Depois disso, carregue o eluato em um tubo de ultra filtração centrífugas e centrifugar a solução a 2.000 vezes g por um a cinco minutos para concentrar a solução.
Esvazie o recipiente de filtragem e adicione 15 mililitros de tampão de armazenamento no tubo. Centrifugar a amostra novamente e repetir o processo duas vezes adicionais. A solução gtfSI recombinante está finalmente concentrada em aproximadamente um mililitro.
Transfira o concentrado para um tubo de microcentrifuagem e armazene a quatro graus Celsius. Continue com o protocolo de restauração funcional restante. Neste protocolo, a eletroforese do gel agarose mostra que o tamanho de cada amplicon do primeiro PCR e do segundo PCR correspondia ao tamanho previsto.
As colônias de estreptococos mutans foram transformadas com o segundo produto PCR e banhadas nas placas de infusão cérebro-coração que continham espectinicina. Os produtos de PCR colônia executados no gel de agarose mostram que cada amplicon era do tamanho previsto. A proteína purificada com cromatografia de afinidade metálica imobilizada foi observada como uma única banda pela SDS-PAGE.
A mancha ocidental, executada usando o anticorpo anti-polihistidina, confirmou que a banda observada era a proteína esperada com marca de polihistidina de 160 kilodaltons. A capacidade de formação de biofilme derivado da sacarose só foi vista com estreptococo mutans do tipo selvagem e estreptococo mutans His-gtfC, que formou um biofilme aderente na parede do tubo na presença de 1% de sacarose. Isso não foi observado em estreptococos mutans delta gtfC.
No entanto, a adição de 25 microgramas do gtfSI recombinante restaurou a capacidade de formação de biofilme aderente em estreptococo mutans delta gtfC. Uma vez que o sucesso deste método depende da segunda amplificação pcr, o segundo produto PCR deve ser confirmado por eletroforese. Já a proteína do tipo histidina obtida por este método também está se reunindo para ácidos funcionais, como interações proteína-proteína.
Após seu desenvolvimento, essa técnica, em combinação com a disrupção genética, abriu caminho para pesquisadores do campo da microbiologia explorarem a função genética.
