Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie telles que la façon dont un produit génétique difficile à exprimer dans E.Coli purifie. Les principaux avantages de cette technique sont qu’aucune réaction enzymatique, autre que pcr, n’est le porteur, et des applications communes pour la purification de protéine peuvent être employées. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la purification des protéines chez les mutagés streptocoques, elle peut également être une connaissance d’autres espèces de microbiotes.
Le Dr Mamiko Yamashita, un étudiant diplômé de notre laboratoire, démontrera la procédure. Après la conception de l’amorce et l’extraction de l’ADN génomique à partir de streptocoques mutans, effectuer le premier PCR en utilisant le streptocoque mutans de type sauvage et GFC perturbé le génome streptococcus mutans que les modèles PCR. Amplifiez les régions abritant la partie aval du gène gtfC et celles abritant le gène de résistance à la spectinomycine à l’aide de l’amorce préparée gtfC-forward et inverse et de l’amorce spc r-forward et inverse.
Ensuite, électrophorese chaque produit PCR sur 1% gel agarose. Utilisez un coupe-gel pour exciser les fragments d’ADN désirés d’environ 1000 paires de base et de 2000 paires de base du gel en tubes de microcentrifugeuse. Ajouter 500 microlitres de tampon solubilisant dans chaque tube et les incuber pendant 10 minutes à 56 degrés Celsius pour dissoudre les tranches de gel.
Purifier les fragments à l’aide d’une méthode d’extraction de gel à base de silice à base de membrane. Effectuez un deuxième PCR en utilisant les produits du premier PCR comme modèles PCR avec les amorces imbriquées vers l’avant et imbriquées. Lorsque le deuxième produit PCR ne peut pas être confirmé par électrophoresis, la paire d’une autre amorce imbriquée doit être conçue.
électrophorese cinq microlitres du mélange de PCR sur le gel d’agarose. Confirmez la généra tion de l’amplicon approprié d’environ 3000 paires de base par image de coloration de gel de bromure d’éthidium et procédez selon le manuscrit. Maintenant, mélangez cinq microlitres du deuxième produit concentré de PCR à l’aloquot de 50 microlitres des cellules muettes froides et compétentes de type sauvage de streptococcus mutan, congelées précédemment.
Ajouter le mélange dans une cuvette d’électroporation et placer la cuvette dans la chambre de cuvette de l’appareil d’électroporation. Donnez une seule impulsion électrique de 1,8 kilovolts, 600 ohms et 10 microfarades pendant 2,5 millisecondes aux cellules. Ajouter 500 microlitres de bouillon d’infusion cerveau-coeur dans la cuvette.
Étendre immédiatement 10 à 100 microlitres de la suspension sur des plaques d’auger d’infusion cerveau-coeur contenant de la spectinomycine. Incuber les plaques pendant deux à six jours à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les colonies aient suffisamment grandi pour être ramassées. Après la génération de streptocoques mutans polyhistidine séquence de codage incorporé souche et l’inoculation pendant la nuit sans spectinomycine selon le manuscrit, centrifuger la suspension de la culture bactérienne pendant 20 minutes à 10.000 fois g à quatre degrés Celsius.
Transférez le supernatant de culture dans un bécher en verre de trois litres. Pour concentrer les protéines de la culture supernatant, placez le supernatant de deux litres sur un agitateur magnétique et commencez à remuer vigoureusement. Ajouter 1 122 grammes de sulfate d’ammonium et laisser le précipité se former en remuant vigoureusement à quatre degrés Celsius sur une période de quatre heures ou pendant la nuit. prochain.
centrifugeuse le sulfate d’ammonium a précipité la solution à 15 000 fois g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Décanter le surnatant. À l’aide d’une spatule, recueillir le précipité et le transférer dans un bécher en verre de 200 millilitres.
Resuspendez les granulés en 35 millilitres de tampon de liaison. Ensuite, transférez chacun environ 25 millilitres de suspension dans un tube de dialyse à cellulose régénéré. Placez le tube de dialyse en 2,5 litres du tampon de liaison en remuant sur un agitateur à quatre degrés Celsius pour dialyser la suspension.
Remplacez la solution de dialyse après deux heures et continuez la dialyse pendant la nuit. Ensuite, transférez la suspension dialysée du tube aux tubes de centrifugeuse et placez les tubes dans la centrifugeuse à 20 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Avec l’équipement de filtration de section, versez le supernatant sur un filtre de membrane de 0,2 micromètre pour filtrer.
Transférer le filtrate dans un flacon de 75 millilitres. Pour fractionner le gtfSI marqué en polyhistidine de la suspension filtrée, préparez d’abord une chromatographie d’affinité métallique immobilisée. Après avoir équilibré la résine selon le manuscrit, fermez la bite hoffman pincée.
Ajouter cinq millilitres de la suspension filtrée dans la colonne pour faire un lisier. Ensuite, transférez toute la boue à la suspension filtrée restante et faites tourbillonner doucement le mélange pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Chargez le mélange dans la colonne.
Ouvrez la bite hoffman pincement pour enlever la suspension par le flux de gravité. Lavez la résine IMAC avec 20 millilitres de tampon de liaison, puis, elute 20 millilitres de tampon d’élitution pour obtenir le gtfSI recombinant. Après cela, charger l’allongement dans un tube centrifuge ultra filtration et centrifugeuse la solution à 2000 fois g pendant une à cinq minutes pour concentrer la solution.
Videz le contenant de filtrate et ajoutez 15 millilitres de tampon de stockage dans le tube. Centrifugez l’échantillon à nouveau et répétez le processus deux fois supplémentaires. La solution gtfSI recombinante est finalement concentrée à environ un millilitre.
Transférer le concentré dans un tube de microcentrifugeuse et le conserver à quatre degrés Celsius. Continuez avec le protocole de restauration fonctionnelle de repos. Dans ce protocole, l’électrophorèse de gel d’agarose montre que la taille de chaque amplicon du premier PCR et du deuxième PCR a correspondu à la taille prévue.
Les colonies de streptocoques mutans ont été transformées avec le deuxième produit PCR et plaquées sur les plaques d’auger d’infusion cerveau-coeur contenant de la spectinomycine. Les produits Colony PCR fonctionnent sur le gel agarose montre que chaque amplicon était de la taille prévue. La protéine purifiée avec la chromatographie immobilisée d’affinité de métal a été observée en tant que bande simple par SDS-PAGE.
La tache occidentale, effectuée à l’aide de l’anticorps antihistidine, a confirmé que la bande observée était la protéine prévue de 160 kilodaltons marquée par la polyhistidine. La capacité de formation de biofilm dérivée du saccharose n’a été vue qu’avec le streptocoque mutans de type sauvage et le streptocoque mutans His-gtfC, qui a formé un biofilm adhérent sur la paroi du tube en présence de 1% de saccharose. Ceci n’a pas été observé dans streptococcus mutans delta gtfC.
Cependant, l’ajout de 25 microgrammes du gtfSI recombinant a restauré la capacité de formation de biofilm adhérente dans le delta gtfC de delta de streptococcus mutans. Puisque le succès de cette méthode dépend de la deuxième amplification pcr, le deuxième produit PCR doit être confirmé par électrophoresis. Déjà, la protéine de type histidine obtenue par cette méthode se convoque également à des acides fonctionnels, tels que les interactions protéines-protéines.
Après son développement, cette technique, combinée à la perturbation génétique, a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la microbiologie pour explorer la fonction génétique.
