Qualquer projeto de ciência da vida que exija a investigação de ultraestrutura 3D de uma região específica de interesse em uma amostra biológica complexa pode fazer uso dessa técnica. O procedimento de preparação da amostra é o mesmo para duas modalidades de imagem sendo SBF/SEM e FIB-SEM. O uso do micro-ondas acelera substancialmente a parte de processamento da amostra.
Embora mostrado aqui para dicas básicas, este protocolo pode ser usado para qualquer sistema de modelo biológico com ajustes mínimos. Antes de utilizar este fluxo de trabalho para correlacionar sbf/SEM e FIB-SEM, deve-se estar familiarizado com as tecnologias individuais. A execução de certos passos é facilmente demonstrada, mas difícil de descrever em texto escrito.
Demonstrando o procedimento será Peter Borghgraef, que é técnico em nosso laboratório. Para começar, corte as pontas radiculares das mudas de arabidopsis thaliana fixas em placas de ágar e coloque de duas a três pontas em tubos Eppendorf contendo o mesmo fixador durante a noite em quatro graus Celsius. Pela manhã, com uma pipeta, substitua fixativo por 0,1 tampão molar fosfato no pH 6.8 nos tubos com os tubos em uma mesa rotativa a 100 RPM e lave por 10 minutos.
Em seguida, repita a lavagem usando tampão fosfato fresco cinco vezes. Em um capô de fumaça, corrija as pontas raiz substituindo o tampão fosfato por 2%tetroxida de ósmio e 0,2% vermelho rutênio em 0,1 tampão de fosfato molar no pH 6.8 com os tubos com tampas abertas em um micro-ondas e iniciar o programa. Em seguida, descarte a solução nos tubos e lave as pontas das raízes duas vezes com água dupla destilada por cinco minutos cada.
Para a terceira e quarta lavagem dupla de água destilada, use o micro-ondas para auxiliar na lavagem. Após a primeira lavagem dupla de água destilada de 40 segundos, tire as amostras de ponta raiz do micro-ondas e substitua a água dupla destilada por água destilada dupla. Coloque as amostras de volta no micro-ondas e continue o programa.
Em seguida, prepare a solução TCH adicionando 0,1 grama de tiocarbohydrazida a 10 mililitros de água dupla destilada em um tubo de 15 mililitros. Coloque o tubo em um forno e aqueça a 60 graus Celsius durante uma hora para dissolver. Em seguida, filtre a solução TCH usando um filtro de seringa de 0,22 micrômetros.
Substitua imediatamente a solução nos tubos de amostra pela solução TCH filtrada e continue com o protocolo. Agora mergulhe as amostras no etanol e coloque-as no micro-ondas para desidratar em etapas classificadas de 50%70%90% e depois duas vezes de tratamento de 100% de etanol. Após o tratamento de desidratação do óxido de propileno, adicione 50% de resina spurr nos tubos para iniciar a infiltração das pontas da raiz por um mínimo de duas horas.
Após a incubação final na resina 100% Spurr, coloque as pontas raiz na incorporação de moldes e encha os moldes com resina fresca 100% Spurr e polimerize em um forno a 65 graus Celsius por 36 a 48 horas. Primeiro, use uma lâmina de barbear para aproximadamente aparar a amostra polimerizada em um bloco fino. Com o lado tendo tecido exposto voltado para baixo, conecte a amostra ao centro de um pino metálico com resina epóxi condutiva para que o tecido toque no pino metálico.
Coloque a amostra em um forno a 65 graus Celsius para curar o epóxi durante a noite. Pela manhã, carregue o pino de metal no porta-aviões e use uma lâmina de barbear para remover qualquer excesso de epóxi da amostra. Para suavizar ainda mais a face da amostra, carregue o portador com o pino metálico no suporte para o ultramicrotome.
No ultramicrotome, use uma faca de vidro ou diamante para suavizar a face dos lados do bloco formando uma pirâmide. Certifique-se de que pelo menos parte do tecido já está exposto na face do bloco. Em seguida, coloque o bloco de amostra aparado no revestimento sputter e ajuste as configurações para platina em dois a cinco nanômetros para revestir a amostra com uma camada fina.
Insira a transportadora no microscópio SBF-SEM. Leve a faca de diamante perto da superfície da amostra e corte a porção superior da amostra para remover a camada de platina e expor parte do tecido. Em seguida, coloque a tensão acelerada para 1,5 a 2 quilovolts.
Capture uma imagem do tecido e configure uma corrida de imagem. Usando o software Fiji, selecione arquivo, importe, sequência de imagens e localize a pilha de imagens para carregar as imagens. Depois de ajustar a imagem de acordo com o manuscrito, verifique o alinhamento percorrendo o conjunto de dados.
Use o comando salvar no menu de arquivos para salvar o conjunto de dados alinhado como um arquivo TIFF 3D. Analise cuidadosamente o conjunto de dados para ver se o ROI está incluído e contém as informações necessárias para a questão biológica. Na última imagem da pilha, que é a face do bloco atual no microscópio SBF-SEM, selecione um novo ROI para FIB-SEM.
Após o revestimento com platina novamente, carregue a amostra no FIB-SEM e use o detector de elétrons secundário a 15 kilovolts e um nanoamp para localizar o ROI identificado no SBF-SEM na face do bloco. Mova-se e incline o palco para trazer o ROI na amostra para o ponto de coincidência das vigas FIB e SEM, utilizando o feixe FIB e o sistema de injeção de gás. Deposite uma camada protetora de um micrômetro de platina na superfície acima do ROI.
Em seguida, usando uma corrente de fresagem baixa que varia de 50 a 100 picoamps, mote linhas finas na deposição de platina para autofoco e rastreamento 3D durante a execução de imagens. Em seguida, usando uma alta corrente de fresagem de 30 nanoampes, mote uma trincheira de 30 micrômetros em frente ao ROI criando a superfície de imagem para o feixe SEM. Depois de suavizar a superfície da imagem, inicie a execução de imagens e monitore a estabilidade do processo durante as primeiras 50 a 100 seções.
Uma vez que o sistema esteja funcionando sem problemas, saia da sala e certifique-se de que há o mínimo de perturbação possível na sala. As imagens do SBF-SEM fornecem uma visão geral do tecido que fornece uma visão sobre a orientação espacial das células e conexões intracelulares. A imagem FIB-SEM subsequente em uma nova região adiciona detalhes de alta resolução de células e estruturas específicas.
Os dados do SBF-SEM mostram diferentes renderizações dos voxels não isotrópicos dos dados isotrópicos voxel FIB-SEM. O SBF-SEM apresenta um efeito de escada na superfície, enquanto os dados FIB-SEM com as seções de cinco nanômetros garantem que a renderização pareça muito mais suave e seções individuais se misture completamente na superfície. Este protocolo descreve a imagem de uma região única em uma única amostra e qualquer desvio do fluxo de trabalho pode causar danos à amostra, impossibilitando a realocação da região de interesse.
