Este procedimento pode nos ajudar a identificar a função de circuito neurológico específico que está envolvido na regulação da vigília do sono com manipulação menos invasiva e alta resolução temporal. Este método nos permite a superfície de monitoramento EEG em tempo real em conjunto com a manipulação de um circuito neurológico específico para examinar a relação causal entre circuitos e estados de vigília do sono. Shota Kodani vai demonstrar o procedimento.
Depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do pé, aplique pomada nos olhos do animal e use as barras de ouvido e o pino do nariz para o aparelho estereotático para estabilizar a cabeça do rato anestesiado em uma almofada absorvente. Quando a cabeça estiver fixada na posição, faça uma incisão sagital no couro cabeludo para confirmar que a intersecção entre a sutura sagittalis e sutura coronalis ou sutura lambdoidea estão em uma linha horizontal no mesmo nível. Para evitar uma abertura de posicionamento, ajuste a beliscada do nariz e as barras de ouvido conforme necessário.
Em seguida, usando grampos serafins para segurar a pele aberta desinfetar a superfície exposta do crânio para permitir que as suturas cranianas sejam visualizadas com mais clareza. Para injetar o vetor do vírus associado ao adeno, carregue uma seringa esterilizada de etanol de 10 mililitros com dois microliters de óleo mineral, seguido pelo volume experimental do vírus a ser injetado. Use a bomba de microinjeção para ajustar a ponta da agulha de microinjeção sobre o bregma e observar as coordenadas como o ponto de origem.
Em seguida, mova a ponta para o local de injeção designado e coloque a ponta da agulha sobre a posição. Marque o crânio no local da injeção e use uma broca dentária equipada com um cortador de carboneto de 0,7 milímetros para perfurar um buraco de aproximadamente dois milímetros de diâmetro no crânio. Depois de remover sangue ao redor do orifício com um cotonete, mova lentamente a agulha para o núcleo do leito da estria terminalis ou BSNT e injete lentamente o volume designado da solução do vírus.
Em seguida, deixe a agulha no lugar por cinco minutos para permitir que a solução se infiltre suficientemente no tecido BNST antes de retirar cuidadosamente a agulha. Para eletroencefalograma, ou EEG, e eletromyograma, ou EMG, implantação de eletrodos, primeiro solda dois fios de aço inoxidável dos quais um milímetro de isolamento foi retirado de ambas as extremidades para os eletrodos EMG e colocar o centro dos eletrodos sobre o bregma. Em seguida, marque a posição para cada eletrodo EEG.
Para determinar a posição do implante de fibra óptica, conecte uma ferrule de fibra óptica ao manipulador e gire o braço manipulador para um ângulo de mais ou menos 30 graus contra uma linha horizontal. Coloque a ponta de fibra na bregma e grave as coordenadas. Mova a ponta para a linha de inserção direcionada e marque a posição no crânio e a posição para o parafuso de âncora ao lado do local de inserção.
Use a broca dentária para perfurar o crânio em cada local e use o manipulador para inserir suavemente a fibra óptica até chegar acima do BNST. O ferrule deve repousar sobre o crânio restante. Fixar a fibra no crânio com um parafuso de âncora, tomando cuidado para não quebrar a dura ou danificar qualquer tecido.
Em seguida, cubra a fibra e aparar com cimento dental foto-curável. Em seguida, faça furos para eletrodos EEG/EMG e insira a ponta do primeiro eletrodo em um orifício. Segurando o implante com uma mão, aplique o adesivo de cianoacrilato no espaço entre o crânio e o eletrodo e insira o eletrodo o resto do caminho, tomando cuidado para não danificar nenhum tecido.
Quando todos os eletrodos tiverem sido colocados, cubra a circunferência dos eletrodos e das fibras ópticas com adesivos de cianoacrilato adicional e acelerador de cianoacrilato para evitar causar qualquer interrupção no ferrule para cabo óptico e eletrodo para as zonas de conexão do fio de chumbo. Agora exponha os músculos do pescoço e insira os fios para o eletrodo EMG sob o músculo. Ajuste o comprimento do eletrodo EMG para que ele se encaixe logo abaixo dos músculos nucal e encha os implantes com mais adesivo de cianoacrilato e acelerador.
Em seguida, coloque o mouse em uma almofada de calor com monitoramento até a recomposição completa. Para o monitoramento EEG/EMG durante a foto-excitação de neurônios direcionados, primeiro use um escalar para ajustar a intensidade do laser e use uma ferrule para amarrar a ponta do cabo laser a uma fibra óptica não usada. Confirme se não há espaço na junção entre a fibra e o cabo.
Após 20 minutos, emita o laser aquecido ao verificador de intensidade e ajuste a intensidade para 10 miliwatts por milímetro ao quadrado. Defina a duração do pulso de luz para 10 milissegundos, o período de descanso para 40 milissegundos, o ciclo para 20 e a repetição para 20. Mude o modo laser para a lógica transistor e confirme que os pulsos de luz são emitidos a partir da fibra controlada pelo regulador de padrões.
Conecte o eletrodo implantado e o adaptador de cabo, em seguida, cubra a junção com material leve impermeável para evitar vazamento de laser. E quando o laser estiver pronto, mova os ratos para a câmara experimental para gravação de EEG/EMG. Para avaliar a latência da vigília a partir do movimento dos olhos não rápido ou do sono de movimento rápido dos olhos, limitar o tempo de gravação e otimizar o tempo de ganho do local e deixar os ratos se moverem livremente na câmara experimental por pelo menos uma hora.
Durante o período experimental, monitore os sinais EEG e EMG na mesma tela de gravação. Avalie o estado do camundongo como vigília, sono de movimento não rápido dos olhos ou sono de movimento rápido dos olhos usando o controle de ganho para cada onda para facilitar a distinção de cada estado. Para medir o sono de movimento ocular não rápido até a latência da vigília, observe o sono estável não rápido do movimento dos olhos por 40 segundos, em seguida, ligue o gerador padrão para estimulação fotográfica e confirme a emissão de laser para as fibras ópticas implantadas.
Em seguida, registo os sinais EEG/EMG até que o estado de sono mude para a vigília. Aqui são mostrados traços de EEG/EMG antes e depois da estimulação da foto durante o sono de movimento não rápido dos olhos. Um EEG de alta tensão e frequência lenta sem sinais EMG, representa o sono de movimento não rápido dos olhos.
A estimulação fotográfica desencadeou uma transição aguda para a vigília cerca de dois segundos após a estimulação em channelrhodopsin-2 expressando camundongos enquanto os ratos de controle não demonstravam essa transição, sugerindo que a excitação dos neurônios BNST GABA durante o sono de movimento não rápido dos olhos desencadeia uma rápida indução da vigília. Por outro lado, a estimulação fotográfica durante o sono de movimento rápido dos olhos não teve efeito, então um efeito de transição só surgiu no sono de movimento não rápido dos olhos. É importante ter cuidado com as coordenações precisas para as etapas de injeção do vírus e implantação de fibras ópticas.
Os traços de EEG/EMG capturados durante a análise do sono podem ser usados para avaliar as consequências da manipulação de fotos nos diferentes estados vigilantes em camundongos. Essa técnica também nos ajudará a identificar outros componentes e circuitos envolvidos na regulação dos estados de vigília do sono. Use óculos de proteção para evitar danos a laser no olho e certifique-se de sempre autoclave esterilizar o recipiente vetorial de vírus associado ao adeno após o uso.
