We thank Dr. Larry D. Frye for editorial help with this manuscript. This work was supported by Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research 24300129 (to M.L.), 25890005 (to Y.O.) and 26640025 (to Y.T.), the National Agriculture and Food Research Organization (to Y.U.), the World Premier International Research Center Initiative (WPI) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology (to Y.O., Y.T., Y.U. and M.L.) and the Nestl&#233; Nutrition Council, Japan (to M.L.).

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional Experimentação Animal da Universidade de Tsukuba. 1. Preparação de eletrodos e cabos de EEG / EMG Recordings <ol><li> Prepare eléctrodo de registo de EEG / EMG de acordo com o seguinte procedimento. Nota: O eléctrodo é descartável e pode ser usado somente para um animal. Planejar cuidadosamente a configuração de fiação para todos os conectores. Coloque marcas nos conectores para a orientação correta. <ol><li> Solde cada pino de um cabeçalho de 4 pinos para um fio de aço inoxidável de 2 cm. Em breve, segure uma extremidade do fio para o pino, coloque um ferro de solda quente para o conjunto do fio-pin, e derreter um pouco de solda de solda para garantir que apenas o suficiente corre sem problemas na articulação. Tenha cuidado para não aplicar muita calor para o pino; caso contrário, o plástico em torno dos pinos vai derreter. </li><li> Soldar a extremidade livre de cada um de 2 fios ligados ao cabeçalho pino na cabeçade um parafuso de aço inoxidável de 1,0 mm de diâmetro. Em breve, segure a extremidade livre do fio para o segmento abaixo da cabeça do parafuso, coloque um ferro de solda quente para o conjunto do fio de rosca, e derreter um pouco de solda de solda para garantir que apenas o suficiente corre sem problemas na articulação. Os 2 fios com parafusos servem como eletrodos de registro EEG, enquanto que os 2 fios sem parafusos servir como EMG eletrodos de registro. </li><li> Utilize uma tesoura para retirar 1 mm do isolamento na extremidade dos eléctrodos EMG para aumentar a qualidade do sinal de EMG. </li><li> Completamente cobrir todos os pinos soldados com adesivo epóxi usando uma vara ou dente de madeira palheta fina para reduzir o ruído elétrico durante as gravações EEG / EMG. </li></ol></li><li> Preparar um cabo para a ligação do eléctrodo com o anel de deslizamento, tal como descrito abaixo. Este cabo pode ser reutilizado. <ol><li> Solde cada pino de um conector FFC / FPC 4 pinos com um fio de um cabo plano de 30 cm. Em breve, segure a extremidade descascada do fio para o pino, coloque um ferro de solda quentepara o conjunto do fio-pin, e derreter um pouco de solda para garantir que apenas solda suficiente corre sem problemas na articulação. Nota: Escolha o comprimento do cabo plano que é apropriado para a altura da gaiola animal experimental usado para gravações de EEG / EMG. </li><li> Solda friso tomadas a uma ponta de um dos fios sobre a outra extremidade do cabo chato. Em breve, realizar uma tomada friso para a extremidade livre listrada do fio, coloque um ferro de solda quente para o conjunto do fio-socket, e derreter um pouco de solda para garantir que apenas solda suficiente corre sem problemas na articulação. </li><li> Insira cada tomada em um friso de 4 posições friso habitação. </li><li> Completamente cobrir o friso soquetes com adesivo epóxi usando uma vara ou dente de madeira palheta fina. </li></ol></li></ol> 2. Implantação de eletrodos na cabeça de rato (Duração: Aprox. 20 min) <ol><li> Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos em um esterilizador quente talão antes da cirurgia. Anestesiar um rato do sexo masculino (10 - 20 semanas de idade, 20 - 30 g)com uma injecção intraperitoneal de pentobarbital (50 mg / kg). Depois de verificar que o rato está profundamente anestesiados por beliscar um dedo do pé, raspar o cabelo na cabeça e no pescoço com clippers. </li><li> Mova o mouse para o quadro estereotáxico, e fixar a cabeça entre as 2 barras de ouvido. Aplique vaselina sobre os olhos para prevenir o ressecamento. Limpar a pele raspada com álcool e cortá-la ao longo da linha média com um bisturi para expor o crânio. Clipe da pele para manter a área cirúrgica aberta. </li><li> Utilizando um cortador de carboneto de (tamanho da broca: 0,8 mm de diâmetro), broca 2 furos no crânio, uma sobre a área cortical frontal (1 mm anterior ao bregma, 1,5 mm lateral à linha média) e o outro através da zona parietal ( 1 milímetro anterior à lambda, 1,5 mm lateral a linha média) do hemisfério direito, de acordo com coordenadas estereotáxica de Paxinos e Franklin. 23 </li><li> Usando uma chave de fenda de um joalheiro, aço inoxidável lugar EEG gravação parafusos nos furos e fazer 2 - 2,5 voltas para cada screw para o posicionamento peridural sobre o córtex. Nota: Não insira parafusos demasiado profundas para evitar danos ao tecido cerebral. Verifique se os parafusos estão firmemente fixos no crânio. Isto é importante para ter sinais de EEG estáveis ​​durante um longo período de várias gravações (tipicamente, mais de 1 mês). Parafusos Wiggly produzir artefatos de EEG e pode sair antes do final do calendário experimental. </li><li> Fixe o conjunto do eléctrodo (cf. Seção 1.1, pinos voltados para cima) com cola instantânea ao crânio e cobrir com cimento dental. Faça bilateralmente pequenos orifícios com uma pinça nos (pescoço) trapézio e inserir os fios de aço inoxidável, que servem como eletrodos EMG nos orifícios. Suturar a pele com um fio de seda (0,1 mm de diâmetro) a fim de evitar exposição do músculo. </li><li> Retirar o mouse do quadro estereotáxico. Administrar ampicilina (100 mg / kg) e meloxicam (1 mg / kg) por via intraperitoneal para o rato a fim de evitar a infecção bacteriana e para reduzir a dor pós-cirúrgica, respectivamente. Keep o mouse sobre uma almofada de calor e monitorá-lo até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Casa do rato individualmente durante a recuperação para evitar a remoção dos eléctrodos por outros animais, e administrar meloxicam (1 mg / kg) por via intraperitoneal no primeiro dia após a cirurgia. </li></ol> 3. Registro e aquisição de EEG / EMG Dados <ol><li> Após um período de recuperação de 1 semana, cada ratinho casa individualmente em uma gaiola experimental colocado numa câmara de registo à prova de som. Manter uma temperatura ambiente de 23 ± 1 ° C e controlar automaticamente ciclos de 12 h de luz-/ 12 horas escuro (luzes acesas às 08:00, a intensidade de iluminação ~ 100 lux). </li><li> Conecte o conjunto de eléctrodos EEG / EMG na cabeça do rato para um cabo de gravação. Assegure-se que o cabo de gravação está ligada a um anel de deslizamento (que é concebido de modo a que os movimentos do rato não são limitados por torção do cabo) e um amplificador de sinal de EEG / EMG. Filtro de EEG / sinais EMG (EEG, 0,5-64 Hz; EMG, 16-64 Hz), digitalizar a uma taxa de amostragem de 128 Hz por um conversor analógico-digital (A / D) e, finalmente, gravar em um computador com o software de gravação de EEG / EMG (&#39;Materiais&#39; mesa, 4 th entrada a partir de baixo). </li><li> Habituar o mouse para 2 - 3 dias na câmara de gravação. Se a gravação EEG / EMG inclui as administrações de drogas intraperitoneal, manusear com cuidado o mouse em cada dia de habituação no momento da administração da droga. </li><li> Posteriormente, iniciar o software de EEG / EMG de gravação (&#39;Materiais&#39; mesa, 4 th entrada de baixo). <ol><li> Selecione a guia &quot;Arquivo de dados de informação&quot; e clique na caixa ao lado do nome do arquivo. Digite um nome de arquivo e clique em &quot;Salvar&quot;. </li><li> Selecione a guia &quot;condições de gravação&quot; e selecione todos os canais de EEG / EMG que serão gravados. </li><li> Selecione a frequência de amostragem (128 Hz), na secção &#39;condição de gravação&#39;. </li><li> Verifique se os canais selecionados são exibidos corretamente no thguia e &#39;As informações do canal &quot;. </li><li> Selecione a guia &#39;Ajuste do timer&#39; e clique em &#39;Monitor&#39; para exibir EEG e EMG. </li><li> Verifique se os sinais de EEG / EMG são exibidos corretamente. </li><li> Selecione a guia &#39;Ajuste do timer &quot;e defina a hora do relógio para o início eo fim da gravação na área de&#39; Main Temporizador &#39;. </li><li> Clique em &#39;Monitor&#39; no separador &#39;Ajuste do timer&#39; para iniciar a gravação. </li></ol></li><li> Gravar sinais de EEG / EMG sob basal (ie., O comportamento de sono / vigília de um rato comportando livremente) e diferentes condições de tratamento (por exemplo., A administração de cafeína ou tratamento simulado) durante vários dias. Eutanásia o rato com uma injecção intraperitoneal de pentobarbital (200 mg / kg) após o último dia do experimento. </li></ol> 4. A pontuação de Estado Comportamental Baseado em EEG / EMG Dados <ol><li> Inicie o software para análise de EEG / EMG (&#39;Materiais&#39; mesa, 4 th entrada da parte inferior). Abra os dados brutos EEG / EMG (arquivo .kcd) produzidos sob a etapa 3. Clique na guia &#39;Sleep&#39; e selecione o tempo Epoch. Select 10 seg. </li><li> Clique na guia &#39;Sleep&#39; e selecione &#39;Multi-screening &quot;para marcar automaticamente todas as épocas 10 seg em 3 fases (ie., NREM e sono REM, e vigília), com base em as amplitudes de EEG e EMG e análise espectral de potência do EEG. 3 </li><li> Clique em &#39;condição FFT para EEG &quot;. </li><li> Defina os parâmetros para a análise espectral de potência [256 pontos de referência (correspondente a 2 segundos do EEG), função de janela Hanning, ea média de 5 espectros por época]. 3 Clique em &#39;OK&#39;. </li><li> Clique em &quot;Iniciar Rastreio» para iniciar a triagem automática. Abra os dados marcados (arquivo .raf). </li><li> Confira os resultados da triagem automática e, se necessário, corrigi-los manualmente com base nos critérios padrão (veja os resultados representativos, Figura 1B e Tabela 1 </strong&gt;). 2, 3 Resumidamente, clique e segure o botão esquerdo do mouse sobre uma época incorretamente marcou e arraste o cursor sobre a seqüência de épocas incorretamente marcou. Solte o botão esquerdo do mouse e selecione o estado comportamental correta na janela pop-up. Nota: Ocasionalmente, épocas na transição entre dois estados vigilantes são difíceis de marcar inequivocamente a um estado. Em tais casos, a época deve ser marcado para o estado aparente e os mesmos critérios devem ser aplicados para épocas semelhantes ao longo da experiência para assegurar a reprodutibilidade dos dados. </li></ol>

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The authors Yujiro Tauguchi and Sayaka Kohtoh are employees of Kissei Comtech Co., Ltd that develops SleepSign software for acquisition and automatic scoring of EEG/EMG data used in this article.

Este protocolo descreve um set-up para gravações de EEG / EMG que permite a avaliação de sono e vigília sob low-noise, condições de custo-eficazes e de alto rendimento. Devido ao pequeno tamanho do conjunto de cabeça de eléctrodo de EEG / EMG, este sistema pode ser combinado com outros implantes para experiências intra-cerebrais, incluindo Optogenetics (implante de fibra óptica) ou, em conjunto com a implantação da cânula simultânea, Microinfusion de drogas no rato cérebro. 31 Além disso, a concepção do conjunto cabeça do eléctrodo em relação aos cabeçalhos de pinos múltiplos oferece flexibilidade quanto ao número de canais de gravação, se é necessária a medição de sinais adicionais eléctrica (por exemplo., EEG contralateral, eletrooculograma ou potenciais de campo local) . No entanto, habitação individual é necessário para o design baseado em cabo descrito neste protocolo, o que limita, portanto, a avaliação dos estados comportamentais, ie., Sono e wakefulness, em combinação com a interação social ou testes de comportamento complexo. Nestes casos, um sistema de monitoramento sem fio sono é provável mais adequado, embora os dispositivos telemétricos não são sem suas próprias características limitantes, especialmente custo e vida útil da bateria. A qualidade dos sinais de EEG / EMG é importante para o marcador de estados comportamentais, de acordo com os critérios apresentados na Figura 1 e Tabela 1. Eléctrodos Wiggly (ie., Parafusos) são muitas vezes a razão de ruído eléctrico, resultando em artefactos no EEG e FFT análise. Além disso, é importante para a qualidade do sinal de EEG para cobrir completamente os parafusos de eléctrodos com cimento dental para evitar bolhas de ar entre os parafusos e cimento, resultando em aumento de ruído eléctrico. A qualidade dos sinais de EEG pode ser verificado em um mouse, obviamente dormindo por visualmente confirmando que eles têm uma alta amplitude e baixa freqüência. Custo etempo de implante de eletrodos são fatores críticos para muitos laboratórios de pesquisa do sono e são consideradas como uma grande desvantagem para o rastreio em larga escala do comportamento de sono-vigília em camundongos. O sistema de gravação de EEG / EMG descrito aqui pode ser estabelecida e operada em baixa a moderada custo, incluindo-recorrentes para materiais de eletrodo e suprimentos médicos (aproximadamente 2 USD por rato) e investimentos para EEG / EMG equipamento de gravação (anel deslizante, amplificador , e um conversor A / D; cerca de 2.000 dólares por mouse). Com relação ao tempo, um investigador experiente pode concluir o implante de eletrodos para um rato em menos de 20 min; e, assim, é possível operar em mais de 20 ratinhos por dia. Outro fator fundamental para a eficiência global da avaliação do sono sobre a base de mensuração EEG / EMG é o uso de software para aquisição e pontuação automática de dados de EEG / EMG. Para esses fins, uma variedade de software comercial e in-house desenvolvido está disponível com umaalta variabilidade nos preços precisão ou pontuação.

Os avanços técnicos, muitas vezes precipitado saltos quânticos na compreensão dos processos neurobiológicos. Por exemplo, a descoberta de Hans Berger em 1929 que potenciais elétricos gravados a partir do couro cabeludo humano tomou a forma de ondas senoidais, cuja frequência foi diretamente relacionada com o nível de vigília do sujeito, levou a avanços rápidos na compreensão de sono-vigília regulação, tanto em animais e humanos. 1 Para este dia o electroencephlogram (EEG), em conjunto com o eletromiograma (EMG), ie., a atividade elétrica produzida pelos músculos esqueléticos, representa os dados &quot;espinha dorsal&quot; de quase todas as experimental e clínica avaliação que visa correlacionar o comportamento e fisiologia com a actividade de neurónios corticais em comportando animais, incluindo os seres humanos. Na maior parte dos laboratórios de pesquisa de base de sono de EEG estas gravações são efectuadas por utilização de um sistema à base de cabo (Figura 1), em que d adquiridaATA é sujeito fora de linha com o padrão e o espectro de análise [por exemplo., a aplicação de uma transformada de Fourier rápida (FFT)] para determinar o estado de vigilância do objecto a ser gravado. 2, 3 sono consiste de movimento rápido dos olhos (REM) e não-REM (NREM). O sono REM é caracterizado por uma rápida baixa tensão EEG, o movimento dos olhos aleatório, e atonia muscular, um estado em que os músculos estão efetivamente paralisado. Sono REM é também conhecido como o sono paradoxal, porque a actividade cerebral assemelha-se do estado de vigília, enquanto que o corpo é em grande parte desconectada do cérebro e parece estar em sono profundo. Em contrapartida, os neurônios motores são estimulados durante o sono NREM, mas não há nenhum movimento do olho. NREM humano pode ser dividido em 4 etapas, sendo que a fase 4 é chamado de sono profundo ou sono de ondas lentas e é identificado por ondas cerebrais grandes e lentos com atividade delta entre 0,5-4 Hz no EEG. Por outro lado, uma subdivisão entre as fases de sono NREM, em pequenos animais, como os ratos de umaND ratinhos, não foi estabelecida, principalmente porque eles não têm períodos longos de sono consolidado como pode ser visto nos seres humanos. Ao longo dos anos, e com base na interpretação do EEG, vários modelos de regulação do sono-vigília, ambos circuitos ou à base humoral, foram propostos. O neural e bases celulares da necessidade de sono ou, em alternativa, &quot;movimentação do sono,&quot; continua por resolver, mas tem sido conceituada como uma pressão homeostática que constrói durante o período de vigília e é dissipada pelo sono. Uma teoria é que os fatores endógenos somnogenic acumular durante a vigília e que a sua acumulação gradual é a base de sono pressão homeostática. Enquanto a primeira hipótese formal de que o sono é regulado por fatores humorais foi creditado ao trabalho de Rosenbaum publicado em 1892 4, foi Ishimori 5, 6 e Pieron 7 que de forma independente, e mais de 100 anos atrás, demonstrou a existência de produtos químicos para promover o sono. Ambos os pesquisadores propuseram, e de fato provado, que as substâncias hipnogênicos ou &#39;hypnotoxins&#39; estavam presentes no cerebral fluido espinhal (CSF) de cães privados de sono. 8 Ao longo do século passado várias substâncias hipnogênicos putativos adicionais implicados no processo homeostático do sono foram identificados (para revisão, ver ref. 9), incluindo prostaglandina (PG) D 2, 10 citocinas, 11 adenosina, anandamida 12, 13 e o péptido de urotensina II. 14 O trabalho experimental por Economo 15, 16, Moruzzi e Magoun 17, e outros nos resultados produzidos início e meados de século 20 que inspirou teorias baseados em circuitos de sono e vigília e, até certo ponto, ofuscou a teoria humoral então prevalecente de dorme. Até à data, vários &quot;modelos de circuito&quot; têm sido propostas, cada informados por dados de diferentes graus de qualidade e quantidade (para revisão, ver ref. 18). Um modelo, Por exemplo, propõe que o sono de ondas lentas é gerado através da inibição mediada por adenosina da libertação de acetilcolina a partir de neurónios colinérgicos no prosencéfalo basal, uma área constituídos com, principalmente, do núcleo do membro horizontal da banda diagonal de Broca e o inominata substância. 19 Outro modelo popular de regulação do sono / vigília descreve um mecanismo interruptor flip-flop com base em interações mutuamente inibitórios entre os neurônios indutores do sono na área pré-óptica ventrolateral e neurônios indutores de vigília no tronco hipotálamo e cérebro. 18, 20, 21 Além disso, para a comutação de entrada e saída de sono REM, uma interacção mutuamente inibidora semelhante foi proposta para as zonas no tronco cerebral, que é a cinza ventral periaquedutal, tegmento da ponte lateral e núcleo sublaterodorsal. 22 Em conjunto, estes modelos têm provado serem valiosos heurísticas e oferecidas estruturas interpretativas importantes para estudos de pesquisa do sono; no entanto, um yet mais completa compreensão dos mecanismos moleculares e circuitos que regulam o ciclo vigília-sono vai exigir um conhecimento mais completo de seus componentes. O sistema de registo polygraphic detalhado abaixo devem ajudar neste objetivo.

<table><tbody><tr><td>4-pin header</td><td>Hirose</td><td>A3B-4PA-2DSA(71)</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Meiji Seika</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analog-to-digital converter</td><td>Contec</td><td>AD16-16U(PCIEV)</td><td></td></tr><tr><td>Caffeine</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr><tr><td>Carbide cutter</td><td>Minitor</td><td>B1055</td><td></td></tr><tr><td>Crimp housing</td><td>Hirose</td><td>DF11-4DS-2C</td><td></td></tr><tr><td>Crimp socket</td><td>Hirose</td><td>DF11-30SC</td><td></td></tr><tr><td>Dental cement (Toughron Rebase)</td><td>Miki Chemical Product</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epoxy adhesive</td><td>Konishi</td><td>#16351</td><td></td></tr><tr><td>FFC/FPC connector</td><td>Honda Tsushin Kogyo</td><td>FFC-10BMEP1(B)</td><td></td></tr><tr><td>Flat cable</td><td>Hitachi Cable</td><td>20528-ST LF</td><td></td></tr><tr><td>Instant glue (Aron Alpha A)</td><td>Toagosei</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Signal amplifier</td><td>Biotex</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sleep recording chamber</td><td>APL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SleepSign software</td><td>Kissei Comtec</td><td>N/A</td><td>for EEG/EMG recording/analysis</td></tr><tr><td>Slip ring</td><td>Biotex</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel screw</td><td>Yamazaki</td><td>N/A</td><td>&amp;phi;1.0 &amp;times; 2.0</td></tr><tr><td>Stainless steel wire</td><td>Cooner Wire</td><td>AS633</td><td></td></tr></tbody></table>

polygraphic recording procedure for measuring sleep in mice

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the homeodynamics and circuitry of sleep-wake regulation. In many laboratories, a cable-based sleep recording system is used to monitor the EEG and EMG in freely behaving mice in combination with computer software for automatic scoring of the vigilance states on the basis of power spectrum analysis of EEG data. A description of this system is detailed herein. Steel screws are implanted over the frontal cortical area and the parietal area of 1 hemisphere for monitoring EEG signals. In addition, EMG activity is monitored by the bilateral placement of wires in both neck muscles. Non-rapid eye movement (Non-REM; NREM) sleep is characterized by large, slow brain waves with delta activity below 4 Hz in the EEG, whereas a shift from low-frequency delta activity to a rapid low-voltage EEG in the theta range between 6 and 10 Hz can be observed at the transition from NREM to REM sleep. By contrast, wakefulness is identified by low- to moderate-voltage brain waves in the EEG trace and significant EMG activity.

A Figura 1B ilustra exemplos de EEG o rato nos diferentes estados de vigilância. Como mostrado na Tabela 1, são classificados como épocas sono NREM se o EEG mostra ondas cerebrais grandes, com um ritmo lento delta inferior a 4 Hz e o EMG tem apenas uma fraco ou nenhum sinal. Épocas são classificados como sono REM se o EEG mostra ondas cerebrais rápidas de baixa tensão na faixa teta entre 6 e 10 Hz ea EMG apresenta baixa amplitude. Outras épocas devem ser classificados como estado de vigília (ie., Baixa a moderada EEG tensão e ocorrência de atividade EMG). Por exemplo, a gravação de EEG / EMG set-up descrito neste protocolo pode ser usado para determinar a quantidade de sono e perfil de sono / vigília de camundongos C57BL / 6 sob condições basais ou após o tratamento com cafeína (Figuras 2 e 3). Sob bcondições aseline, ratos, que são animais noturnos, exibiu um ritmo circadiano sono-vigília clara, como se vê nestas figuras, com quantidades maiores de sono durante o período de luz do que durante o escuro (Figura 2A). Durante o período de luz de 12 horas, os ratos mostraram 6,7 horas e 0,9 horas de sono NREM e REM, respectivamente; Considerando que, durante o período escuro de 12 horas, vigília foi predominante (Figura 2B). Por outro lado, a qualidade do sono pode ser avaliada com base na análise de estado de vigilância e de espectro de potência EEG (Figura 2C-F). Normalmente, as gravações de artes gráficos de EEG e EMG pode ser usado para determinar a distribuição da duração do episódio, duração e número de transição fase para cada estado de vigilância (Figura 2C-E) significa. Além disso, o espectro de potência para EEG NREM e sono REM nos ratos durante o período de claro e escuro (Figura 2F) mostra forte densidade de potência EEG na faixa de freqüência de 0,5 - 4 Hz e 6-10Hz, respectivamente. Deve notar-se que o EEG durante o sono REM inclui pequenas quantidades de ondas delta (0,5-4 Hz), uma vez que os estados de permeio de sono NREM e REM são, por vezes, um contaminante. Para avaliar os efeitos de drogas sobre o comportamento de sono-vigília de ratos, 24-30 EEG e EMG são tipicamente registrados durante 2 dias consecutivos. Para determinar, por exemplo, o efeito de excitação de cafeína em ratinhos C57BL / 6, os 24 murganhos foram tratados com veículo (10 ml / kg de solução salina; intraperitonealmente) no dia 1, às 10:00, na fase inicial do período de luz. Os animais foram então tratados com cafeína (15 mg / kg) 24 horas mais tarde, e os estados de vigilância foram classificados desligada para vigília, sono REM, e o sono NREM. A Figura 3A mostra exemplos típicos de EEG, EMG, e hypnograms após a administração de cafeína (painéis polissonográficos inferiores) ou veículo (painéis polissonográficos superiores) em um C57BL / 6 mouse. Cafeína increduziu a quantidade de vigília em ratinhos C57BL / 6 2,8 vezes durante 3 horas após a injecção (Figura 3B). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53678/53678fig1.jpg" /> Figura 1. Dormir Bioassay Sistema para ratos. (A) Para monitorar sinais de EEG, parafusos de aço inoxidável são implantados por via epidural ao longo das áreas corticais frontal e parietal de um hemisfério. Além disso, a actividade de EMG é monitorizada por fios de aço inoxidável colocados bilateralmente nos músculos do trapézio. (B) Como exemplos típicos de densidade de potência EEG, EMG, EEG e durante 10 seg durante o sono NREM ou REM ou vigília num ratinho. No sono NREM, EEG mostra ondas de alta amplitude; e a banda de delta (0,5 - 4 Hz) é dominante (esquerda). No sono REM, EEG mostra ondas de baixa amplitude, com a banda theta (6-10 Hz) sendo dominante (meio). Na vigília, a EEG mostra ondas de baixa amplitude, sem periodicidade ser dominante (direita). Sinais EMG são mais baixos em ambos sono NREM e REM do que na vigília. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53678/53678fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53678/53678fig2.jpg" /> Figura 2. Perfis de sono-vigília sob Situação Actual em camundongos C57BL / 6 avaliada por EEG / EMG Recordings. (A) mudanças de curso-Time no valor horária de cada estágio comportamental. Branco e barras pretas acima do x -axes indicam os períodos claros e escuros, respectivamente. (B) quantidade total de cada fase durante 12 horas mostra uma maior quantidade de sono NREM e REM durante o período de luz em comparação com que no período escuro. (C) Distribuição de eduração pisode de cada etapa. (D) A duração média de cada etapa é mais longo para a vigília durante o período escuro. (E) número Stage-transição de cada etapa mostra transições mais frequentes durante o período de luz. (F) EEG espectro de potência durante o sono NREM e sono REM mostra essencialmente nenhuma diferença poder-densidade entre luz e períodos escuros. Os dados são apresentados como a média ± SEM (n = 5). * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01, avaliada pelo teste t pareado bicaudal de Student. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53678/53678fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" height="890" src="/files/ftp_upload/53678/53678fig3.jpg" width="700" /> Figura 3. A excitação efeito da cafeína avaliada por EEG / EMG Recordings. (A) Exemplos típicos de EEG, EMG, e hypnograms após a administração de veículo (painel superior) ou a cafeína, numa dose de 15 mg / kg (painel inferior). (B) Tempo de cursos vigília em ratinhos tratados com cafeína. (C) ao longo de um período de vigília 3-h após a injecção de cafeína. Os dados são apresentados como a média ± SEM (n = 5). ** P &lt;0,01 em comparação com injeção veículo, avaliada pelo teste t pareado bicaudal de Student. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53678/53678fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="519"><colgroup><col /><col span="2" /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:156px;"></td><td style="width:139px;"> O sono NREM </td><td style="width:139px;"> O sono REM </strong&gt; </td><td style="width:87px;"> Wakefulness </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Amplitude EEG </td><td> Alto </td><td> Baixo </td><td> Baixo </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Dominante frequência EEG </td><td> Delta banda (0,5-4 Hz) </td><td> Theta banda (6-10 Hz) </td><td> Nenhum </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Amplitude EMG </td><td> Baixo </td><td> Baixo </td><td> Alto </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Critérios gerais de Pontuação Behavioral Unidos por sinais de EEG / EMG.

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Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice

The recording of electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in freely behaving mice is a critical step to correlate behavior and physiology with sleep and wakefulness. The experimental protocol described herein provides a cable-based system for acquiring EEG and EMG recordings in mice.

Procedimento de gravação Polygraphic para medição Sleep in Mice

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the ...

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Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

Functions of the Central and Peripheral Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

23.4K visualizações.  University of Tsukuba. The recording of electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in freely behaving mice is a critical step to correlate behavior and physiology with sleep and wakefulness. The experimental protocol described herein provides a cable-based system for acquiring EEG and EMG recordings in mice.

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Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little research to reveal the possible mechanisms behind these effects. To investigate the effect of acupuncture on epilepsy and sleep, several issues need to be addressed. The first is to identify the acupoints, which correspond between humans, rats, and mice. Furthermore, the depth of insertion of the acupuncture needle, the degree of needle twist in manual needle acupuncture, and the stimulation parameters for electroacupuncture (EA) need to be determined. To evaluate the effects of acupuncture on epilepsy and sleep, a feasible model of epilepsy in rodents is required. We administer pilocarpine into the left central nucleus of the amygdala (CeA) to simulate focal temporal lobe epilepsy (TLE) in rats. Intraperitoneal (IP) injection of pilocarpine induces generalized epilepsy and status epilepticus (SE) in rats. Five IP injections of pentylenetetrazol (PTZ) with a one-day interval between each injection successfully induces spontaneous generalized epilepsy in mice. Recordings of electrocorticograms (ECoGs), electromyograms (EMGs), brain temperature, and locomotor activity are used for sleep analysis in rats, while ECoGs, EMGs, and locomotor activity are employed for sleep analysis in mice. ECoG electrodes are implanted into the frontal, parietal, and contralateral occipital cortices, and a thermistor is implanted above the cerebral cortex by stereotactic surgery. EMG electrodes are implanted into the neck muscles, and an infrared detector determines locomotor activity. The criteria for categorizing vigilance stages, including wakefulness, rapid eye movement (REM) sleep, and non-REM (NREM) sleep are based on information from ECoGs, EMGs, brain temperature, and locomotor activity. Detailed classification criteria are stated in the text.

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms ECoGs and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

This paper demonstrates the performance of acupuncture, epilepsy models, and the analysis of sleep in rodents. The acupuncture procedure and the identification of acupoints are described. Pilocarpine or pentylenetetrazol (PTZ) is used to induce epilepsy. Electrocorticogram (ECoG), electromyogram (EMG), brain temperature, and locomotor activity recordings are employed for sleep analysis.

Manipulação de epileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) e do sono em ratos e camundongos por Acupuntura

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Comportamento

Noninvasive, High-throughput Determination of Sleep Duration in Rodents

Traditionally, sleep is monitored by an electroencephalogram (EEG). EEG studies in rodents require surgical implantation of the electrodes followed by a long recovery period. To perform an EEG recording, the animal is connected to a receiver, creating an unnatural tether to the head-mount. EEG monitoring is time consuming, carries risk to the animal, and is not a completely natural setting for the measurement of sleep. Alternative methods to detect sleep, particularly in a high-throughput fashion, would greatly advance the field of sleep research. Here, we describe a validated method for detecting sleep via activity-based home-cage monitoring. Previous studies have shown that sleep assessed via this method has a high degree of agreement with sleep defined by traditional EEG-based measures. Whereas this method is validated for total sleep time, it is important to note that sleep bout duration should be assessed by an EEG which has better temporal resolution. The EEG can also differentiate rapid eye movement (REM) and non-REM sleep, giving more detail about the exact nature of sleep. Nevertheless, activity-based sleep determination can be used to analyze multiple days of undisturbed sleep and to assess sleep as a response to an acute event (like stress). Here, we show the power of this system to detect the response of mice to daily intraperitoneal injections.

We describe a high-throughput method of measuring sleep by means of activity-based home-cage monitoring. This method offers advantages over traditional EEG-based methods. It is well validated for the determination of total sleep duration and can be a powerful tool to monitor sleep in rodent models of human disease.

Determinação não-invasiva, elevado-throughput da duração do sono em roedores

Traditionally, sleep is monitored by an electroencephalogram (EEG). EEG studies in rodents require surgical implantation of the electrodes followed by a ...

A High-performance Liquid Chromatography Measurement of Kynurenine and Kynurenic Acid: Relating Biochemistry to Cognition and Sleep in Rats

The kynurenine pathway (KP) of tryptophan degradation has been implicated in psychiatric disorders. Specifically, the astrocyte-derived metabolite kynurenic acid (KYNA), an antagonist at both N-methyl-d-aspartate (NMDA) and &#945;7 nicotinic acetylcholine (&#945;7nACh) receptors, has been implicated in cognitive processes in health and disease. As KYNA levels are elevated in the brains of patients with schizophrenia, a malfunction at the glutamatergic and cholinergic receptors is believed to be causally related to cognitive dysfunction, a core domain of the psychopathology of the illness. KYNA may play a pathophysiologically significant role in individuals with schizophrenia. It is possible to elevate endogenous KYNA in the rodent brain by treating animals with the direct bioprecursor kynurenine, and preclinical studies in rats have demonstrated that acute elevations in KYNA may impact their learning and memory processes. The current protocol describes this experimental approach in detail and combines a) a biochemical analysis of blood kynurenine levels and brain KYNA formation (using high-performance liquid chromatography), b) behavioral testing to probe the hippocampal-dependent contextual memory (passive avoidance paradigm), and c) an assessment of sleep-wake behavior [telemetric recordings combining electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) signals] in rats. Taken together, a relationship between elevated KYNA, sleep, and cognition is studied, and this protocol describes in detail an experimental approach to understanding function outcomes of kynurenine elevation and KYNA formation in vivo in rats. Results obtained through variations of this protocol will test the hypothesis that the KP and KYNA serve pivotal roles in modulating sleep and cognition in health and disease states.

Alterations in the kynurenine pathway (KP) neuroactive metabolites are implicated in psychiatric illnesses. Investigating the functional outcomes of an altered kynurenine pathway metabolism in vivo in rodents may help elucidate novel therapeutic approaches. The current protocol combines biochemical and behavioral approaches to investigate the impact of an acute kynurenine challenge in rats.

Uma medida de cromatografia líquida de alta performance da Quinurenina e ácido cinurênico: matéria bioquímica de cognição e sono em ratos

The kynurenine pathway (KP) of tryptophan degradation has been implicated in psychiatric disorders. Specifically, the astrocyte-derived metabolite ...

Quantifying Infra-slow Dynamics of Spectral Power and Heart Rate in Sleeping Mice

Three vigilance states dominate mammalian life: wakefulness, non-rapid eye movement (non-REM) sleep, and REM sleep. As more neural correlates of behavior are identified in freely moving animals, this three-fold subdivision becomes too simplistic. During wakefulness, ensembles of global and local cortical activities, together with peripheral parameters such as pupillary diameter and sympathovagal balance, define various degrees of arousal. It remains unclear the extent to which sleep also forms a continuum of brain states-within which the degree of resilience to sensory stimuli and arousability, and perhaps other sleep functions, vary gradually-and how peripheral physiological states co-vary. Research advancing the methods to monitor multiple parameters during sleep, as well as attributing to constellations of these functional attributes, is central to refining our understanding of sleep as a multifunctional process during which many beneficial effects must be executed. Identifying novel parameters characterizing sleep states will open opportunities for novel diagnostic avenues in sleep disorders.
We present a procedure to describe dynamic variations of mouse non-REM sleep states via the combined monitoring and analysis of electroencephalogram (EEG)/electrocorticogram (ECoG), electromyogram (EMG), and electrocardiogram (ECG) signals using standard polysomnographic recording techniques. Using this approach, we found that mouse non-REM sleep is organized into cycles of coordinated neural and cardiac oscillations that generate successive 25-s intervals of high and low fragility to external stimuli. Therefore, central and autonomic nervous systems are coordinated to form behaviorally distinct sleep states during consolidated non-REM sleep. We present surgical manipulations for polysomnographic (i.e., EEG/EMG combined with ECG) monitoring to track these cycles in the freely sleeping mouse, the analysis to quantify their dynamics, and the acoustic stimulation protocols to assess their role in the likelihood of waking up. Our approach has already been extended to human sleep and promises to unravel common organizing principles of non-REM sleep states in mammals.

Here, we present experimental and analytical procedures to describe the temporal dynamics of the neural and cardiac variables of non-REM sleep in mice, which modulate sleep responsiveness to acoustic stimuli.

Quantificando a dinâmica infra-lenta do poder espectral e da freqüência cardíaca em ratos dormindo

Three vigilance states dominate mammalian life: wakefulness, non-rapid eye movement (non-REM) sleep, and REM sleep. As more neural correlates of behavior ...

Neurociência

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 (ChR2), is expressed by a virus vector in a particular type of neuronal cells in various Cre-driver mice. Activation of these opsins is triggered by application of light pulses which are delivered by laser or LED through optic cables, and the effect of activation is observed with very high time resolution. Experimenters are able to acutely stimulate neurons while monitoring behavior or another physiological outcome in mice. Optogenetics can enable useful strategies to evaluate function of neuronal circuits in the regulation of sleep/wakefulness states in mice. Here we describe a technique for examining the effect of optogenetic manipulation of neurons with a specific chemical identity during electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) monitoring to evaluate the sleep stage of mice. As an example, we describe manipulation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis (BNST). Acute optogenetic excitation of these neurons triggers a rapid transition to wakefulness when applied during NREM sleep. Optogenetic manipulation along with EEG/EMG recording can be applied to decipher the neuronal circuits that regulate sleep/wakefulness states.

Here, we describe methods of optogenetic manipulation of particular types of neurons during monitoring of sleep/wakefulness states in mice, presenting our recent work on the bed nucleus of the stria terminalis as an example.

Manipulação optogenetic de circuitos neural durante a monitoração sono/Estados do wakefulness nos ratos

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Computer-based Multitaper Spectrogram Program for Electroencephalographic Data

Current web resources provide limited, user friendly tools to compute spectrograms for visualizing and quantifying electroencephalographic (EEG) data. This paper describes a Windows-based, open source code for creating EEG multitaper spectrograms. The compiled program is accessible to Windows users without software licensing. For Macintosh users, the program is limited to those with a MATLAB software license. The program is illustrated via EEG spectrograms that vary as a function of states of sleep and wakefulness, and opiate-induced alterations in those states. The EEGs of C57BL/6J mice were wirelessly recorded for 4 h after intraperitoneal injection of saline (vehicle control) and antinociceptive doses of morphine, buprenorphine, and fentanyl. Spectrograms showed that buprenorphine and morphine caused similar changes in EEG power at 1&#8722;3 Hz and 8&#8722;9 Hz. Spectrograms after administration of fentanyl revealed maximal average power bands at 3 Hz and 7 Hz. The spectrograms unmasked differential opiate effects on EEG frequency and power. These computer-based methods are generalizable across drug classes and can be readily modified to quantify and display a wide range of rhythmic biological signals.

This protocol provides an open source, compiled MATLAB program that generates multitaper spectrograms for electroencephalographic data.

Programa multitaper spectrograma baseado em computador para dados eletroencefalográficos

Current web resources provide limited, user friendly tools to compute spectrograms for visualizing and quantifying electroencephalographic (EEG) data. ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ineffective in many patients. To improve patient care, novel and innovative therapeutic concepts causally targeting arrhythmia mechanisms are needed. To study the complex pathophysiology of arrhythmias, suitable animal models are necessary, and mice have been proven to be ideal model species to evaluate the genetic impact on arrhythmias, to investigate fundamental molecular and cellular mechanisms, and to identify potential therapeutic targets.
Implantable telemetry devices are among the most powerful tools available to study electrophysiology in mice, allowing continuous ECG recording over a period of several months in freely moving, awake mice. However, due to the huge number of data points (&gt;1 million QRS complexes per day), analysis of telemetry data remains challenging. This article describes a step-by-step approach to analyze ECGs and to detect arrhythmias in long-term telemetry recordings using the software, Ponemah, with its analysis modules, ECG Pro and Data Insights, developed by Data Sciences International (DSI). To analyze basic ECG parameters, such as heart rate, P wave duration, PR interval, QRS interval, or QT duration, an automated attribute analysis was performed using Ponemah to identify P, Q, and T waves within individually adjusted windows around detected R waves. 
Results were then manually reviewed, allowing adjustment of individual annotations. The output from the attribute-based analysis and the pattern recognition analysis was then used by the Data Insights module to detect arrhythmias. This module allows an automatic screening for individually defined arrhythmias within the recording, followed by a manual review of suspected arrhythmia episodes. The article briefly discusses challenges in recording and detecting ECG signals, suggests strategies to improve data quality, and provides representative recordings of arrhythmias detected in mice using the approach described above.

Here we present a step-by-step protocol for a semiautomated approach to analyze murine long-term electrocardiography (ECG) data for basic ECG parameters and common arrhythmias. Data are obtained by implantable telemetry transmitters in living and awake mice and analyzed using Ponemah and its analysis modules.

Analisando gravações de eletrocardiografia de longo prazo para detectar arritmias em camundongos

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...

Medicina

Gravação LFP no cérebro de camundongos para pesquisa cognitiva e análise de drogas

Dual Extracellular Recordings in the Mouse Hippocampus and Prefrontal Cortex

The technique of recording local field potentials (LFPs) is an electrophysiological method used to measure the electrical activity of localized neuronal populations. It serves as a crucial tool in cognitive research, particularly in brain regions like the hippocampus and prefrontal cortex. Dual LFP recordings between these areas are of particular interest as they allow the exploration of interregional signal communication. However, methods for performing these recordings are rarely described, and most commercial recording devices are either expensive or lack adaptability to accommodate specific experimental designs. This study presents a comprehensive protocol for performing dual-electrode LFP recordings in the mouse hippocampus and the prefrontal cortex to investigate the effects of antipsychotic drugs and potassium channel modulators on LFP properties in these areas. The technique enables the measurement of LFP properties, including power spectra within each brain region and coherence between the two. Additionally, a low-cost, custom-designed recording device has been developed for these experiments. In summary, this protocol provides a means to record signals with high signal-to-noise ratios in different brain regions, facilitating the investigation of interregional information communication within the brain.

Autor em destaque: Estudando os impactos das drogas nos sinais cerebrais usando o protocolo de gravação LFP duplo em camundongos

This protocol outlines the use of a custom-designed recording device and electrodes to record local field potentials and investigate information flow in the mouse hippocampus and prefrontal cortex.

Gravações extracelulares duplas no hipocampo de camundongos e córtex pré-frontal

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Procedimento de gravação Polygraphic para medição Sleep in Mice

Resumo

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Gravações extracelulares duplas no hipocampo de camundongos e córtex pré-frontal

Gravações extracelulares duplas no hipocampo de camundongos e córtex pré-frontal

Gravações extracelulares duplas no hipocampo de camundongos e córtex pré-frontal