Name: the cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min
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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant no. 31400936, 31460260) e a ciência Natural Fundação de Jiangxi província da China (20171BAB215020). Agradecemos também o programa conjunto entre a Universidade de Nanchang e Queen Mary University of London para apoiar este trabalho.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso de Universidade de Nanchang e cuidado Animal.
1. montar o equipamento e conectar o micrótomo
<ol><li>Desenha o parâmetro pelos requisitos (Supplementary Figura 1).</li>
	<li>Submeta o parâmetro para uma fábrica local para fabricar as placas de acrílico.</li>
	<li>Montar todas as peças na sequência: usar clorofórmio para combinar 7 placas de acrílico comerciais em um tanque com um banho de água e canal de seção (Figura 1). Cuidado: Clorofórmio produz substâncias tóxicas quando encontra luz e oxigênio. Monte o aparelho em uma coifa.</li>
	<li>Instale o elemento de aquecimento elétrico tubular através do orifício na placa de acrílico #1 (Figura 2A, ponta de seta).</li>
	<li>Para instalar o controlador de temperatura, criar um pequeno furo na placa de acrílico #2 usando uma furadeira elétrica e instale o detector de temperatura (Figura 2A, seta). Instale um termostato digital do tanque (Figura 2A). Nota: O detector de temperatura deve ser dentro de 1 cm abaixo da superfície da água.</li>
	<li>Para fornecer acesso de potência, ajuste a tensão abaixo de 24 V antes de ligar o equipamento.</li>
	<li>Remova a bandeja de resíduos de corte do micrótomo.</li>
	<li>Vincule o canal de seções com o suporte da lâmina do micrótomo com selante de silicone neutro (Figura 2B). Nota: Não difamar qualquer selante de silicone neutro acima da parte superior da lâmina para que a lâmina velha é facilmente substituída.</li>
	<li>Secar durante a noite para permitir que o clorofórmio e o tempo de selante de silicone neutro para solidificar.</li>
	<li>Instale a lâmina para o suporte da lâmina. Despeje a água do banho-maria (Figura 2). A superfície da água só deve tocar a parte superior da lâmina (Figura 2D, cabeça de seta).</li>
</ol>2. parafina seccionamento
Nota: Os restos muitas vezes se acumulam nas bordas superiores ou inferiores do bloco de cera e a superfície da água. Estes restos devem ser limpos regularmente.
<ol><li>
Execute a parafina convencional seccionamento10.
	<ol>
<li>Aperta o espécime de parafina em um micrótomo rotativo e coloque a lâmina em um suporte de lâmina.</li>
		<li>Gire o volante e a seção da amostra.</li>
		<li>Transferi a faixa de opções de parafina seccionada para o banho de água morna de 38,5 ° C.</li>
		<li>Peguem que as seções sobre o microscópio deslize da superfície da água após o desdobramento.</li>
		<li>Seca as lâminas em estufa a 42 ° C durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Corte de parafina melhorada (Figura 3)
	<ol>
<li>Liga o equipamento.</li>
		<li>Abra o aquecedor com interruptor de deteção da temperatura e defina a temperatura alvo entre 38,0 ° C e 40,0 ° C, durante 1 h com antecedência aquecer a água.</li>
		<li>Modificar o bloco de parafina, adquirido pela incorporação de parafina; Então coloque o bloco de parafina na braçadeira de fita do micrótomo e travá-lo. Nota: As bordas superiores e inferiores do bloco de parafina devem ser alteradas horizontalmente para evitar que a fita de seção de formando um arco e tornando-se incapaz de fluxo através do canal de seções estreitas.</li>
		<li>Abordar rapidamente a amostra por mais espessas seções de corte.</li>
		<li>Ajuste a uma espessura de seção adequada (10 µm por cérebro de rato adulto, rato adulto rins e cérebro de rato embrião, 4 µm para olhos do zebrafish). Gire o volante e as seções entra automaticamente o canal de seções e banho.</li>
		<li>Seção da amostra em um curso de corte de lenta e uniforme (Figura 3A). Nota: Thethickness da primeira seção serão alterados depois que o volante foi interrompido por alguns minutos. As lâminas descartáveis devem ser substituídas quando as seções tem arranhões consecutivos.</li>
		<li>Orientar as seções na câmara de banho para flutuar em uma linha (Figura 3B, 3C). Nota: Se seção head adere à parede da câmara, utilize um guia de escova para mantê-lo flutuando.</li>
		<li>Aderir a seções em corrediças do microscópio. Após as seções totalmente desdobrar-se em banho-Maria, separadas várias seções com uma pinça. Então pegá-las com o banho de água para as lâminas de microscópio (Figura 3D). Nota: Seções devem ser recolhidas a parte posterior do banho de água, como aqueles no anterior do banho de água e o canal de seções não ainda será totalmente desdobradas.</li>
		<li>Seca as lâminas, colocando-os em um forno de 42 ° C durante a noite. Os slides podem ser armazenados à temperatura ambiente por tempo indeterminado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use a coloração de hematoxilina-eosina (HE) por uma questão de avaliação do melhor método8.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li><li>Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuron+differentiation+in+the+central+nervous+system+by+tritiated+thymidine+autoradiography.">Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography.</a> Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).</li><li>Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+zebrafish+histology.">High-throughput zebrafish histology.</a> Methods. 39 (3), 246-254 (2006).</li><li>Chen, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid-Cut:+An+Improved+Sectioning+Method+for+Recalcitrant+Plant+Tissue+Samples.">Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54754 (2016).</li><li>Kucherenko, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin-Embedded+and+Frozen+Sections+of+Drosophila+Adult+Muscles.">Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2438 (2010).</li><li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+Embedding+and+Thin+Sectioning+of+Microbial+Colony+Biofilms+for+Microscopic+Analysis.">Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).</li><li>Whiteland, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+T-cell+subsets+and+other+leukocytes+in+paraffin-embedded+rat+and+mouse+tissues+with+monoclonal+antibodies.">Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).</li><li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sectioning+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Lesion+Identification.">Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).</li><li>Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+and+Characterization+of+Atherosclerotic+Lesions+in+the+Murine+Aortic+Sinus.">Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50933 (2013).</li><li>Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD163:+A+specific+marker+of+macrophages+in+paraffin-embedded+tissue+samples.">CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).</li><li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+Protocols+for+Human+Pancreatic+Islets.">Staining Protocols for Human Pancreatic Islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e4068 (2012).</li></ol>

Os autores têm uma patente neste dispositivo e declaram sem interesses concorrentes.

Para melhorar a morfologia de seção de parafina e resolver o problema do desperdício de tempo durante o corte de parafina convencional, criamos uma parafina melhorada método que combina o corte e o desdobramento de seccionamento. Este método de melhoria se baseia em equipamento simples que compreende um canal de seção, um banho de água e um aquecedor com um interruptor de deteção de temperatura. A faixa de opções da seção entra o banho de água através do canal de seção e desenrola-se automaticamente durante o corte. Portanto, esse método melhora a parafina seccionamento de qualidade e eficiência, o que foi verificada por parafina seccionamento do hipocampo de rato adulto, rins de rato adulto, E15.5 cérebro de rato e olhos adultos do zebrafish.
Para evitar a seção de ondulação durante a parafina convencional de corte, foram feitos muitos ajustes, como umedecer a superfície do tecido, o bloco de cera de resfriamento, aumentando a umidade e combinando cryosectioning6,7, - 8; no entanto, estes ajustes fazem parafina seccionamento mais tedioso. Um sistema de transferência de seção comercial que se baseia em água fluida tem tido mais sucesso. Neste sistema, a seção entra em contato com a superfície da água imediatamente após o corte, e o fluxo de água movido a motor elétrico transfere as seções de suporte da lâmina para a inferior de banho de água morna9. Devido ao seu mecanismo, eletricidade estática não inibe o seccionamento, resultando em qualidade melhorada seção. Além disso, como este sistema evita manualmente transferir seções do suporte da lâmina para o banho de água, facilmente danificar seções frágil, também ajuda na aquisição de seções mais finas de alta qualidade.
Com nosso método melhorado, o equipamento simples baseia-se a experiência do sistema de transferência de seção comercial com algumas vantagens. Em primeiro lugar, o equipamento é mais barato, que poderia popularizar este método em laboratórios nas regiões em desenvolvimento e pode complementar o sistema de transferência de seção comercial. Em segundo lugar, a água no equipamento é estática e nunca perturba as seções, tornando-se possível adquirir seções mais finas. Nós consecutivamente seccionado zebrafish olhos de 2 µm de espessura utilizando o método melhorado, e as seções adquiridas foram de qualidade superior. Em terceiro lugar, um tanque de banho de água maior é usado no equipamento, que permita pelo menos 40 seções para desdobrar e flutuar simultaneamente, permitindo que dois operadores a cooperar. Uma pessoa pode cortar a amostra de tecido continuamente e o outro diretamente pode pescar até as seções. Isso reduz o tempo de espera para seções a se desdobrar. Corte sucessivo com um curso de corte uniforme também melhora a qualidade de seção.
A estrutura e aparência dos nossos equipamentos simples requer melhoria. Por exemplo, os componentes, tais como o poder, um aquecedor e um controlador de temperatura, podem ser integrados para tornar este equipamento mais integral e portátil. Além disso, micrótomos rotativos comerciais têm tamanhos diferentes. Para conectar a outros micrótomos, o ângulo e altura deste equipamento devem ser ajustados. Corte de parafina combinada com outras técnicas moleculares é amplamente utilizado em neurobiologia, morfologia do tecido e outras pesquisas campos11,12,13. Potencialmente, este método pode melhorar o exame clínico eficiência14,15 e outros espécimes biológicos, para além dos tipos de três tecido usados aqui.

Estudo morfológico é importante na pesquisa biológica. Apesar de nova tecnologia permitiu que os pesquisadores a observar seus alvos diretamente do tecido inteiro ou organismos1,2,3, cortar a amostra em seções finas, seguiram de coloração, continua a ser o principal morfologia de tecido único método porque mas também proteína alvo diretamente no tecido. Microscopia de luz usa três tipos de seção: parafina, congelada e semithin. Embora cryosectioning é comum para proteger antigenicidade de tecido, e a preparação das amostras é simples, a morfologia do tecido retido é pobre e inadequado para fino corte4,5. Corte de parafina é o método mais frequentemente usado para exibindo morfologia bem preservada. Como os espécimes são desidratados completamente e incorporados em cera, os blocos de parafina podem ser armazenados indefinidamente. Além disso, parafina seccionamento produz seções finas que melhorar o acesso da sonda biológica em novas experiências e reduzem a sobreposição de camadas de célula na direção Z.
No entanto, seccionamento de parafina convencional é tedioso e exige habilidade do operador. Cortes de parafina passam por fixação, desidratação, incorporação, cortando e flutuante. Importante, transferir fitas seção do suporte da faca para o banho de água é necessária mas difícil para os operadores Júnior. Especialmente no ar seco, as fitas da seção torce-se devido à eletricidade estática em são difíceis de se desdobrar na superfície de água morna. Para melhorar a seção qualidade, umedecendo a superfície do tecido exposto entre passes de lâmina micrótomo, refrigerando os blocos de cera por imergindo-os em água gelada, ou levantando a umidade com um umidificador perto do micrótomo é recomendada6,7 . Novos métodos para melhorar a parafina seccionamento incluem híbrido parafina incorporação cryosectioning8e setor comercial transferência sistema assistência9. Embora esses métodos parcialmente melhorar parafina seccionamento velocidade e qualidade, eles fazem o corte muito mais pesado, e sistemas de transferência de seção comercial são caros.
Neste protocolo, demonstramos como criar equipamentos simples, barato e flexível passo a passo, que podem ser conectado à porta de um micrótomo rotativo. Este equipamento é composto de um canal de seção, um banho de água e um aquecedor com um interruptor de deteção de temperatura. Após o corte, dezenas de seções fluem para o canal de seção e insira o banho de água diretamente, assim se desenrola automaticamente. Isto melhora a eficiência de corte de parafina e faz com que esta tecnologia mais conveniente. Usando este método, mais adultas seções hippocampal do rato, seções de rim de rato adulto, embrionárias 15,5 dias de idade (E15.5) do mouse cérebro seções e olho adulto zebrafish seções foram colhidas em menos tempo e manteve-se intacta mais morfologicamente. Esse método também pode ser usado para outras amostras de tecidos que requerem parafina acelerada de corte, evitando a perda de distinção da seção.

<table><tbody><tr><td>Incubator</td><td>Boekel Scientific</td><td>133000-2</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Xylene&amp;nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Heated Paraffin Embedding Module</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Commercial acrylic board</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichloromethane</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>Tubular electric heating element(12 V 200 W)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller(12 V 120 W)</td><td>Mingsuo</td><td>XH-W3002</td><td></td></tr><tr><td>Rotary microtome&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutral silicone sealant</td><td></td><td></td><td>Link the water channel with the microtome knife holder</td></tr><tr><td>Voltage transformer</td><td>Dearll</td><td>S-250-12</td><td></td></tr><tr><td>Disposable blade</td><td>Accu-Edge</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Baso Diagnostics Inc.</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&amp;nbsp;</td><td>Baso Diagnostics Inc.</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>Microslide</td><td>Sail Brand</td><td>7105</td><td></td></tr><tr><td>Neutral balsam</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip&amp;nbsp;</td><td>Citoglas</td><td>10212424C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Xilong Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Water bath for paraffin sections</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia C&amp;nbsp;- Cold Plate</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraffin repellent spray&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990420</td><td></td></tr></tbody></table>

the cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning

Corte do tecido parafina é amplamente utilizado em histologia e patologia. No entanto, é tedioso. Para melhorar este método, várias empresas comerciais criaram sistemas de transferência de seção complexo usando água fluida. Para simplificar essa tecnologia, criamos um método simples usando equipamento caseiro que combina o corte e flutuando dentro de uma câmara termostática simples; Portanto, as seções entram automaticamente o banho de água na superfície da água. O hipocampo do cérebro do rato adulto, rato adulto rins, cérebro de rato embrionárias e olhos adultos do zebrafish foram cortadas usando parafina convencional de corte e o método apresentado para comparação. Análise estatística mostra que nosso método melhorado poupado tempo e produziu seções de qualidade superiores. Além disso, parafina seccionamento de um espécime em um curto período de tempo é fácil para os operadores Júnior.

O método melhorado aumentou o número de cortes de parafina intacta. Nós testamos este novo método no tecido hippocampal do rato adulto, rato adulto rins, cérebro de rato embrionárias e olhos do zebrafish. Água foi adicionada ao tanque, e a temperatura da água foi mantida entre 38,0 ° C e 40,0 ° C. Depois de uma série preparar as amostras de tecido, foram seccionados e comparados com corte convencional. O novo método de evitar a perda de seção e aumentou a proporção de seções intactas no hipocampo de rato adulto, rins de rato adulto, E15.5 cérebro de rato e olhos de adultos do zebrafish (Figura 4A4C, 4E, 4G). Em conclusão, nosso método melhorado o corte, evitando a perda de seção e colheita mais seções intactas por espécime.
O melhor método diminuiu o tempo gasto por espécime. Comparando o tempo despendido entre o método convencional e nosso método melhorado, realizamos toda a série de seccionamento (da primeira seção para a última seção de um órgão) sobre o hipocampo de rato adulto, rato adulto rins, cérebro de rato E15.5 e adulto olhos do zebrafish. Os resultados sugerem que o melhor método acelerado a parafina seccionamento velocidade em todas as amostras testadas (Figura 4B4D, 4F, 4 H). Em geral, nosso método permitido para corte rápida de alta qualidade parafina.
Seções de série da retina óptica zebrafish foi observado pela coloração H e E. Para a série de corte do segmento de disco óptico da retina zebrafish, as seções colhidas do método melhorado de eram melhores tem melhor integridade do que aqueles de parafina convencional seccionamento método (Figura 5A, 5B). Não houve nenhuma diferença significativa entre esses dois métodos em relação à qualidade das seções mais colhidas (Figura 5, 5D). Ocasionalmente, a qualidade das seções colhidos pelo método convencional foram relativamente baixo (Figura 5E, 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig1.jpg"> Figura 1: O processo para a montagem das 7 placas de acrílico comerciais dentro de um tanque. (A) vista de conjunto das 7 placas de acrílico. (B-G) Passo a passo montagem do tanque da placa # 1 a placa #7. (H) tanque principal após a montagem. (I) o tamanho geral do tanque; a membrana protetora na superfície do tanque foi removida para a instalação ainda mais. L = 400 mm, L' = 220 mm, H = 122 mm, W = 200 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58288/58288fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig2.jpg"> Figura 2: O equipamento devidamente montado pronto para uso. Equipamento (A) o intacto após ser conectado ao micrótomo rotativo. Indicação de seta, o detector de temperatura é instalada através do pequeno orifício de furadeira elétrica. Ponta de flecha, o aquecedor (elemento de aquecimento elétrico tubular) é instalada através do orifício na placa #1. (B) a área tracejada amplificada em um, o recurso da conexão entre o suporte da lâmina do micrótomo e o canal de seções. Ponta de flecha, o suporte da lâmina e canal de seções são conectados por selante de silicone neutro. (C) mesmo que B, com a água derramada e lâmina instalada. (D) vista lateral da área tracejada em C. ponta de flecha, a superfície da água está perto da borda da lâmina. VT: transformador de tensão; WB: banho de água; DT: termostato digital; B: lâmina; BH: porta-lâmina; SC: canal de seções. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58288/58288fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig3.jpg"> Figura 3: A parafina melhorada seccionamento processo. As figuras, localizadas no canto inferior esquerdo são as áreas tracejadas amplificadas em A-D respectivamente. Indicações de seta, a primeira seção. (A, A') A seção entra no canal de seções imediatamente e diretamente depois do corte. (B, B') A faixa de seções atravessa a fronteira entre o banho de água e canal de seções. (C, C') As seções flutuam para a parte posterior do banho de água e são totalmente desdobradas. (D, D') As seções são captadas pelo microscópio quando eles atingem a parte posterior do banho de água e são totalmente desdobrados. SC: canal de seções; WB, banho de água. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58288/58288fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig4.jpg"> Figura 4: O método de corte melhorado melhorou a taxa de eficiência e rendimento significativamente para seções de toda a série. A taxa de rendimento igualou a proporção das seções intactas em todas as seções de corte. Dados são mostrados como a média ± SEM e adquiridos pelo mesmo operador. (A, C, E, G) O melhor método impediu a perda de seção do hipocampo rato adulto (91.04 ± 1.429% N = 3, vs 97.63 ± 0.4864% N = 3, p = 0.0120), adult mouse rins (92.30 ± 0.5689% N = 3, vs 95.99 ± 0.7055% N = 3, p = 0.0153), cérebro de rato E15.5 (90.67 ± 1.549%, N = 3 vs 97.01 ± 0.2816%, N = 3, p = 0.0158) e olhos adultos do zebrafish (91.27 ± 0.9734% N = 4 vs 96.32 ± 0.7217% N = 4, p = 0,0059). (B, D, F, H) O melhor método salvou tempo comparado com o método convencional para o hipocampo de rato adulto (126.0 3,606 min vs 79.67 ± 1,856 min, N = 3, p = 0.0003), adult mouse rins (66.67 1,764 min vs 41,33 ± 2,186 min, N = 3, p = 0,0008), E15.5 rato br Ain (99.67 3,480 min vs 52,33 ± 4,333 min, N = 3, p = 0.0010) e olhos adultos do zebrafish (48.00 2,160 min vs 30.75 ± min 1,797, N = 4, p = 0.0009). * P < 0.05, * * P < 0,01, * * * P < 0.005. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58288/58288fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig5.jpg"> Figura 5: H e E coloração das seções do segmento de disco óptico de olhos adquiriram a partir de métodos convencionais e melhoraram a parafina secionar o zebrafish pelo mesmo operador toda a série são comparados. (A) parafina convencional seccionamento (21 seções). (B) melhoria de parafina corte (24 seções). (C) área tracejada da A6. (D) área tracejada de B7. (E) área tracejada da A17. (F) área tracejada da B19. Asteriscos, as seções com qualidade relativamente pobre. Cabeças de seta, disco óptico; Setas, lágrima grave dos tecidos da retina. Barra de escala = 200 µm (A e B); Barra de escala = 50 µm (C, D, E, F). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58288/58288fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Complementar Figura 1: os parâmetros de dimensão das 7 placas de acrílico comerciais. O número representa o comprimento da margem de placa correspondente. Unidades: mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58288/supplementary_figure.AI">clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

O corte e o método flutuante para tecido parafina para seccionamento

Aqui, apresentamos um protocolo para melhorar o corte de parafina. Este método combina flutuante usando uma simples câmara termostática para evitar o processo de transferência exigido pelo método convencional e de corte. Como resultado, a eficiência e o número de cortes de parafina intactas foram grandemente melhoradas.

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.2K visualizações.  Nanchang University. Aqui, apresentamos um protocolo para melhorar o corte de parafina. Este método combina flutuante usando uma simples câmara termostática para evitar o processo de transferência exigido pelo método convencional e de corte. Como resultado, a eficiência e o número de cortes de parafina intactas foram grandemente melhoradas.

Vídeo: The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Seccionamento fina de Preparações Slice para Imunohistoquímica

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Biologia

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and genetic alterations. Mammary gland whole mounts are an inexpensive method to capture the progression of morphological changes that may arise after exposure. However, in later life, when abnormalities are more prone to develop, sole reliance on this one method may not always provide enough information to make a proper diagnosis of the abnormality. Historically, in chemical test guideline studies, a single mammary gland is removed at necropsy and prepared as a hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained section. The incorporation of contralateral mammary whole-mount collection and analysis decreases the likelihood of a false-negative assessment. Evaluation of the whole mount is limited by the presence of one or two entire mammary glands on a slide, and in some cases, the abnormalities observed in the whole mount are not uniformly represented in the H&#38;E section.&#160; The goal of this study was to develop a protocol for converting coverslipped mammary whole mounts to H&#38;E-stained sections so that lesions that would otherwise have been missed or that are difficult to diagnose can be identified. Here, we detail a method to produce a high-quality, paraffin-embedded H&#38;E section from a mammary gland that was initially prepared as a whole mount. In comparison to a tissue that was intentionally prepared for H&#38;E sectioning, the whole mount requires additional preparation for tissue removal and processing. However, this method is considered inexpensive, as it requires common lab reagents and little additional time. As a result, this method can provide invaluable information on how chemical and environmental exposures alter normal mammary development, as well as display changes that occur because of genetic modifications.

We developed a method to successfully remove, process, section, and stain, for histopathological evaluation, mammary tissue that had originally been fixed on slides as whole mounts. This method may promote the collection and evaluation of mammary gland whole mounts in reproductive and developmental test guideline studies.

Seção de mamíferos mamários completos para identificação de lesões

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Pesquisa do câncer

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and sectioning of intact microbial colony biofilms using perfused paraffin wax. To adapt this method for use on colony biofilms, we developed techniques for maintaining each sample on its growth substrate and laminating it with an agar overlayer, and added lysine to the fixative solution. These optimizations improve sample retention and preservation of micromorphological features. Samples prepared in this manner are amenable to thin sectioning and imaging by light, fluorescence, and transmission electron microscopy. We have applied this technique to colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, and Vibrio cholerae. The high level of detail visible in samples generated by this method, combined with reporter strain engineering or the use of specific dyes, can provide exciting insights into the physiology and development of microbial communities.

We describe fixation, paraffin embedding, and thin sectioning techniques for microbial colony biofilms. In prepared samples, biofilm substructure and reporter expression patterns can be visualized by microscopy.

Incorporação de parafina e corte fino de biofilmes microbianos colônia para análise microscópica

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Imunologia e Infecção

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparação do Tecido Cerebral primata não humano para Pré-incorporação de imuno-histoquímica e Microscopia Electrónica

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Neurociência

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the multicellular interactions of native tissue. Tissue&#160;slices immediately cut from freshly resected tumors preserve spatial aspects of intratumor heterogeneity (ITH), thus making them useful surrogates of in vivo biology. Careful optimization of tissue slice preparation and cultivation conditions is fundamental for the predictive diagnostic potential of tumor slice explants. In this regard, murine models are valuable, as these provide a consistent flow of tumor material to perform replicate and reproducible experiments. This protocol describes the culturing of murine lung tumor-derived tissue slices using a rotating incubation unit, a system that enables intermittent exposure of tissues to oxygen and nutrients. Our previous work showed that the use of rotating incubation units improves the viability of tissue compared to other culture methods, particularly floating slices and stagnant filter supports. Here, we further show that slice thickness influences the viability of cultured slices, suggesting that optimization of slice thickness should be done for different tissue types. Pronounced ITH in relevant oncogenic functions, such as signaling activities, stromal cell infiltration or expression of differentiation markers, necessitates evaluation of adjacent tissue slices for the expression of markers altered by drug treatment or cultivation itself. In summary, this protocol describes the generation of murine lung tumor slices and their culture on a rotating incubation unit and demonstrates how slices should be systematically analyzed for the expression of heterogeneous tissue markers, as a prerequisite prior to drug response studies.

We provide a method for the generation, cultivation and systematic analysis of organotypic slices derived from murine lung tumors. We also describe how to optimize for slice thickness, and how to select drug concentrations to treat tumor slices.

Estabelecimento e análise do Tumor fatia Explants como um pré-requisito para o teste de diagnóstico

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hybrid-Cut: Um Método Seccionamento melhorado para amostras de tecidos de plantas recalcitrante

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

Ilhota pancreatic incorporação para cortes de parafina

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Optimized Thin Endometrium Mouse Model with Low Mortality and Minimal Adhesions

Establishing a Mouse Model of Thin Endometrium

Thin endometrium (TE) has been widely recognized as a critical cause of infertility. However, the pathogenesis of TE remains unclear, and satisfactory treatment options are still urgently needed. Several animal models of TE have been developed, but the mouse model involving abdominal surgery and injection of 95% ethanol presents a formidable challenge due to the high mortality rate and risk of intrauterine adhesions if not performed correctly. Here, we describe a detailed protocol that produces reliable and reproducible TE with a very low mortality rate and minimal intrauterine adhesions by injecting 95% ethanol into the mouse uterus with varying infusion times. The results showed that all of the mice successfully developed TE with infusion times ranging from 1-3 min, characterized by a typical reduction in endometrial thickness and the number of glands, as well as excessive endometrial fibrosis. These findings suggest that this mouse model is suitable for studying thin endometrium and can serve as a platform for developing future TE treatments.

This article describes a detailed protocol for producing a reliable and reproducible thin endometrium with a very low mortality rate and minimal intrauterine adhesions by injecting 95% ethanol into the mouse uterus within 1-3 min.

Thin endometrium (TE) has been widely recognized as a critical cause of infertility. However, the pathogenesis of TE remains unclear, and satisfactory ...

Formalin-Fixed Paraffin Embedded (FFPE) Tissue Preservation: A Method for Studying Tissue Morphology

Source: Nagaraj A.S., et al., <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58569/establishment-analysis-tumor-slice-explants-as-prerequisite-for">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The following video describes how to preserve morphology of a tissue with formalin fixation and paraffin embedding.