Name: a temperature gradient assay to determine thermal preferences of drosophila larvae
Uploaded: 2018-06-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae at JoVE.com

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Os autores não têm nada para divulgar.

Para garantir o sucesso do presente protocolo, é importante tomar medidas para obter números adequados de larvas a realizar os experimentos. Estes incluem pre-alimentando as moscas em frascos de levedura contendo colar para 2-3 d melhorar a postura de ovos. Os frascos precisam ser colocados em uma bandeja contendo frascos de água e colocado em um saco plástico transparente, que mantém a umidade dos alimentos e promove a alimentação eficaz por larvas, permitindo a exposição aos ciclos normais de claro-escuro. No entanto, o colar de levedura não deve ser tão macio que as moscas ficam presos. O número de fêmeas por frasco depende do genótipo. No caso de w1118, é geralmente adequado permitir ~ 12 fêmeas e machos de ~ 6 para pôr ovos para 3h. Dois frascos normalmente fornecem suficiente larvas (larvas de 100-200) para colocar em um prato para o ensaio de single-direcional. Se o estoque mosca põe ovos menos do que o selvagem-tipo ou é reduzida a proporção de larvas que eclodem, adicione os machos e fêmeas adicionais (até 30-35/frasco).
Existem muitas causas de variabilidade não intencional ao realizar estes ensaios. Fase de desenvolvimento afeta a preferência de temperatura das larvas. Consequentemente, é imperativo usar cuidadosamente as larvas de um estádio definido. Para isso, coletar larvas ao longo de um estreito (por exemplo, 3h). Desde a criação de condições (temperatura, umidade, ciclo claro-escuro e tipo de alimento) e algumas mutações afetam a taxa de desenvolvimento, não dependem estritamente o tempo depois ovo deitado para analisar comparativamente com a idade as larvas. É também importante examinar características físicas, tais como o tamanho da boca ganchos e espiráculos7 para determinar se as larvas de diferentes genótipos são na mesma fase do desenvolvimento. Os tempos para 1st, 2nd e 3rd ínstar larvas para desenvolver (tabela 1) são baseadas sobre o uso de alimentos à base de farinha de milho e incubação a 25 ° C, sob luz de h 12:12 h ciclos escuros. Larvas crescem mais devagar em alimentos à base de melaço. Frescura de hidratação e alimentação adequada também afeta o crescimento das larvas. A quantidade de água no alimento deve deixa a comida muito seca a casca volta do frasco nem frouxos devido ao excesso de água. Idealmente, a camada de ~ 5 mm mais próximo da superfície do alimento é condicionada pelas larvas crescentes e move-se facilmente quando o frasco for inclinado ou aproveitado. Esta condição pode ser conseguida usando alimentos frescos com 50-100 larvas.
É essencial estabelecer um gradiente de temperatura estável antes de iniciar o ensaio. Portanto, transformar o banho de água 1-2 h antes de iniciar o ensaio, como os banhos de água produzem calor e podem alterar a temperatura ambiente, que por sua vez têm o potencial de afetar o gradiente. Após 1-2 h, a temperatura ambiente mais quartos se equilibra. No entanto, isso deve ser determinado em cada ambiente. Além disso, ao gerar um gradiente com uma escala de temperatura (> 3,0 ° C/cm), pode ser difícil obter um gradiente estável. Um pequeno movimento da placa de ensaio mais significativamente altera o gradiente de temperatura quando o intervalo é grande (por exemplo, > 3,0 ° C/cm). Nós achamos que um gradiente de 1-2 ° C/cm produz os gradientes mais estáveis.
Há várias considerações adicionais que precisam ser controlados para limitar a variabilidade em ensaios thermotaxis. Lavar as larvas é crítico, como a presença de partículas de alimentos ou sacarose sobre as larvas pode afetar o ensaio. As etapas de lavagem devem ser realizadas cuidadosamente, mas rapidamente, porque limitar seu suprimento de oxigênio excessivamente enquanto eles estão submersos na água pode afetar sua saúde. Portanto, nós recomendamos usar o coador de célula (opção 2) para limpar as larvas. Um filtro com um tamanho de poro de 300 µm funciona bem para as larvas no início-3rd ínstar palco (72 h AEL) ou mais velho. Além disso, é importante executar experimentos ao mesmo tempo do dia, tal como o de Zeitgeber tempo ZT4 (ZT) para ZT8 (ZT = 0 é quando as luzes são ativadas), para limitar a variabilidade devido aos impactos dos ritmos circadianos na selecção de temperatura. O nível de umidade na placa de agarose também pode causar a variabilidade nos resultados. Enquanto a superfície das placas precisa ser úmido, gotículas de água poderiam interceptar as larvas e, portanto, devem ser evitadas.
Limitando a variabilidade em ensaios os tornará possível obter resultados robustos sem executar um grande número de experimentos independentes. Normalmente, 3-8 experimentos independentes são suficientes para obter um resultado confiável. Correcto apuramento dos resultados também é crítico para o sucesso dos ensaios thermotaxis. Não contam as larvas distribuídas nas regiões dentro de 0,5 cm das paredes de alumínio, desde que as temperaturas não são lineares, nestas regiões. Algumas larvas serão posicionadas na fronteira entre duas zonas, na época, que conclui-se o ensaio. Se mais de 50% do comprimento do corpo reside em uma zona, em seguida, inclua a larva na Tabulação para essa zona. Se uma larva é precisamente 50% em cada uma das duas zonas, então ser considerado o animal 0,5 larvas em cada zona.
Enquanto o ensaio gradiente permite que as larvas de discriminar uma gama de diferenças de temperatura, existem limitações para as temperaturas inferiores e superiores que podem ser testadas de forma eficaz. Não é viável para testar temperaturas < 10 ° C, desde a mobilidade das larvas diminui grandemente a baixas temperaturas. Apesar de gradientes com a alta temperatura atingir 42 ° C podem ser estabelecidas, quase não há larvas controle passar em qualquer zona > 28 ° C. Portanto, ensaios de gradientes contínuos não podem ser usados para discriminar as preferências de temperatura entre diferentes zonas > 28 ° C. No entanto, gradientes ensaios a essas temperaturas elevadas podem, potencialmente, ser usados para caracterizar os mutantes se eles mudaram altamente preferências de temperatura morna.
Se um mutante tem um defeito do aparelho locomotor, pode ser necessário conduzir experimentos adicionais para certificar-se que a preferência de temperatura aparente não é imprecisa devido a uma deficiência de movimento. Para resolver esse problema potencial, pode ser necessário estabelecer tempos de ensaio mais longos para permitir que o tempo adicional de animais mover-se para as zonas desejadas. O ensaio de gradiente bidirecional também pode ser empregado para testar se os animais selecione a mesma zona preferencial, independentemente de saber onde eles são colocados inicialmente na placa.
Em conclusão, os gradientes ensaios aqui descritos têm vantagens sobre outros ensaios thermotaxis. Enquanto escolha bidirecional ensaios são úteis, como eles podem produzir resultados robustos, especialmente quando as diferenças de temperatura entre as duas zonas são grandes, eles não são eficazes em revelar a temperatura ideal, preferida por larvas em uma única experiência. Para fazer isso requer realizando muitas combinações de escolha bidirecionais para determinar a mais preferida temperatura5,6,7. Em contraste, o gradiente fornece o animal a oportunidade de selecionar a zona de temperatura preferida em um ambiente com uma paisagem única temperatura contínua. Assim, não é necessário elaborar uma grande combinação de escolhas de duas vias para determinar o ambiente térmico preferido. Estudar thermotaxis usando um prato de Petri redondo tem sido empregado para avaliar os efeitos da temperatura sobre a dinâmica de movimento de uma larva de10. No entanto, é menos útil em discriminar entre preferências entre diferentes temperaturas, desde que cada zona é um tamanho diferente. Finalmente, devido à simplicidade de ensaio e sua utilidade em discriminar as preferências de pequena da temperatura em um único ensaio, pode ser empregado para dezenas de tela de genes candidatos potencialmente envolvidos na preferência de temperatura larval que pode caso contrário, ser negligenciado usando outros ensaios

Thermotaxis é empregado por animais móveis para selecionar um ambiente com as mais favoráveis condições1,2,3. Se o clima é excessivamente quente ou frio, esse comportamento é vital para a sobrevivência. Além disso, muitos animais são sensíveis às diferenças muito pequenas em temperatura na faixa de confortável e procuram ambiente com uma temperatura ideal. Isto é de particular importância para organismos poiquilotérmicos como moscas de fruta, que equilibrar a temperatura corporal com o meio ambiente. Ensaios para monitorar thermotaxis larval têm sido fundamentais para identificar e clarificar as funções dos sensores moleculares como Drosophila transitória do Receptor potencial (TRP) canais4,5,6, rhodopsins7,8e geleificação do receptor receptores (IRs)9, que dotar estes animais com sensibilidades de temperatura ao longo de intervalos de temperatura diferentes.
Um teste de escolha bidirecional fornece uma abordagem para estudar as preferências térmicas em larvas6,7. O ensaio envolve a criação de duas zonas de temperatura distintas e permite que os animais selecionar um lado sobre o outro. Os resultados dos testes de escolha de duas vias podem ser robustos, especialmente se as diferenças de temperatura entre as duas opções são grandes. Além disso, uma vez que cada ensaio envolve Tabulação apenas dois grupos, os dados podem ser expressas como um índice de preferência simples. A facilidade e simplicidade de escolha bidirecional ensaios também são aptos para telas de genéticas. No entanto, uma grande limitação é que muitos experimentos são necessários para estabelecer a temperatura preferida dos animais selvagem-tipo ou mutantes.
Um ensaio de gradiente oferece a oportunidade de estabelecer a temperatura preferida em um único ensaio8. Além disso, ao contrário do teste de escolha de duas vias, permite a avaliação da distribuição de um grupo de animais, quando confrontado com uma série contínua de temperaturas. Um ensaio de gradiente usa uma placa de Petri e único animais e é well-suited para caracterizar o comportamento detalhado de cada animal10. No entanto, desde pratos de Petri são redondos, os tamanhos das zonas de temperatura variam e são progressivamente menores dependendo da distância do centro. Portanto, esta configuração não é ideal para monitorar as seleções de temperatura das populações de animais.
Um aparelho gradiente térmico contínuo que é adequado para avaliar as preferências de temperatura dos grupos de larvas emprega uma arena rectangular e está descrito aqui. É simples de construir e montar o aparelho. Além disso, o gradiente é linear e é flexível, como ele pode ser usado para avaliar a thermotaxis ao longo de intervalos de temperatura de 10 ° C a 42 ° C. O ensaio é rápido e simples de executar e produz dados reprodutíveis. Além de relatar a temperatura favorecida de larvas, revela as preferências da população de animais sobre uma escala linear inteira em uma única experiência. Devido a estas vantagens, é uma excelente escolha para a identificação de genes necessários para thermotaxis.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Gradient assay apparatus&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath</td><td>Thomas Scientific</td><td>9106</td><td>This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.</td></tr><tr><td>Aluminum assay plate (for single directional gradient)</td><td></td><td></td><td>Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.</td></tr><tr><td>Aluminum plate (for bidirectional gradient)</td><td></td><td></td><td>25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.</td></tr><tr><td>Aluminum block</td><td></td><td></td><td>Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.</td></tr><tr><td>Connector for aluminum blocks and tubing</td><td>McMaster-Carr</td><td>91355K82</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Sanitary Silicone Tubing</td><td>Tygon</td><td>57296</td><td>1/4&quot; ID x 3/8&quot; OD x 1/16&quot; wall</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Items and reagents for assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pestle</td><td>USA Scientific</td><td>17361</td><td>Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Fluke</td><td>51II</td><td></td></tr><tr><td>Thermocouple</td><td>Fluke</td><td>K type</td><td></td></tr><tr><td>Universal microplate lid</td><td>Corning</td><td>6980A77</td><td></td></tr><tr><td>35 mm dish</td><td>Corning</td><td>9380D40</td><td></td></tr><tr><td>Labeling tape (for bidirectional gradient)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-951</td><td>Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>Prepare 1% solution</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389-5KG</td><td>Prepare 18% solution right before starting assay</td></tr><tr><td>Paint brush</td><td>Fisher Scientific</td><td>11860</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tubes</td><td>Denville</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Scoopula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>500 mL round wide-mouth bottle</td><td>Pyrex</td><td>1395-500</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (300 mm pore)</td><td>PluriSelect</td><td>43-50300</td><td>Optional item for larvae washing</td></tr><tr><td>Cardboard box (vial tray)</td><td>Genesee Scientific</td><td>FS32-124</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;&lt;strong&gt; food&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distilled water</td><td></td><td></td><td>22,400 mL</td></tr><tr><td>Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg</td><td>LabScientific Inc.</td><td>NC0535320</td><td>1,609 g</td></tr><tr><td>Brewers yeast 100 lbs</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN90331280</td><td>379 g</td></tr><tr><td>NutriSoy&amp;reg; Soy Flour (10 kg/unit)</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-115</td><td>221 g</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Agar, Type II (5 kg)</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td>190 g</td></tr><tr><td>Karo light corn syrup</td><td>Karo</td><td></td><td>1,700 mL</td></tr><tr><td>Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H5501-5KG</td><td>72 g/240 mL</td></tr><tr><td>Propionic acid puriss. p.a.,&gt;99.5% (GC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81910-1 L</td><td>108 mL</td></tr><tr><td>Phosphoric acid&amp;nbsp;ACS reagent, &amp;ge;85 wt. % in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438081-500 mL</td><td>8.5 mL</td></tr></tbody></table>

a temperature gradient assay to determine thermal preferences of drosophila larvae

Muitos animais, incluindo a mosca da fruta, Drosophila melanogaster, são capazes de discriminar diferenças minutos em temperatura ambiente, o que permite que eles buscar sua paisagem termal preferida. Para definir as preferências de temperatura de larvas ao longo de um intervalo definido de linear, desenvolvemos um ensaio usando um gradiente de temperatura. Para estabelecer um gradiente de single-direcional, dois blocos de alumínio são conectados aos banhos de água independentes, cada um deles controla a temperatura dos blocos individuais. Os dois blocos defina os limites inferior e superiores do gradiente. O gradiente de temperatura é estabelecido pela colocação de uma placa de alumínio revestido com agarose sobre os dois blocos de água controlados para que a placa se estende a distância entre eles. As extremidades da placa de alumínio que é definido na parte superior dos blocos de água define as temperaturas mínimas e máximos, e as regiões entrelinhas os dois blocos formam um gradiente linear de temperatura. O ensaio de gradiente pode ser aplicado para as larvas de diferentes idades e pode ser usado para identificar os mutantes que apresentam fenótipos, tais como aqueles com mutações que afetam os genes que codificam os canais TRP e opsins, que são necessários para a discriminação de temperatura.

Para estabelecer um único-direcional de 18 ° C e 28 ° C gradiente, definimos as temperaturas dos dois banhos de água de 16,8 ° C e 31 ° C. As temperaturas em 13 pontos Obtém-se medindo a temperatura em 26 posições dentro as partes superior e inferiores de todas as 6 zonas, as linhas de fronteira entre as zonas e os confins extremos da superfície do gel de agarose (Figura 2, 2E). A distribuição de temperatura ao longo do gradiente foi quase linear (Y = 0.9672 * X + 16.19, R2 = 0.9961) (Figura 2E).
Nós analisada as preferências de temperatura de larvas de controle (w1118) em várias idades. 1st (24 ± 1,5 h AEL), 2nd (48 ± 1,5 h AEL) e larvas de início-3rd (72 ± 1,5 h) mostrou picos na zona de 24 ° C (Figura 3A, B). As preferências de temperatura mudadas durante 3rd ínstar larval desenvolvimento. A maior percentagem de meados-3rd ínstar (96 ± 1,5 h AEL) acumulado na zona de 18 ° C (Figura 3A, B), e este preconceito aumentou com a idade. Entre larvas de ínstar final-3rd (pre-escalada; 120 ± 1,5 h AEL), ~ 50% agrupados na zona de 18 ° C, e a seleção desta temperatura foi ~ 4-fold superior a zona adjacente a 20 ° C (zona de 18 ° C, 50,2%; zona de 20 ° C, 15,1%; Figura 3A B). A tendência a acumular-se na zona de 18 ° C no w1118 não foi devido a um efeito de borda desde o atrasado-3rd ínstar larvas ainda acumuladas na zona de 18 ° C, usando um gradiente de temperatura bidirecional (Figura 3E, F ).
Testamos também larvas de ínstar final-3rd (120 ± 1,5 h AEL) com mutações em genes necessários para discriminar as diferenças de temperatura na faixa de confortável. Estes incluem trpA1, que é necessário para a selecção de temperatura normal no 18 ° C - 24 ° C gama5,7,8. Larvas com uma mutação nula no trpA1 (trpA11) distribuem-se igualmente sobre a inteira 18 ° C — gradiente de 28 ° C (Figura 3). Larvas, faltando apenas as A e B isoformas (trpA1-ABG4), ou as isoformas C e D (trpA1-CDG4) também mostram deficiências graves (Figura 3). Moscas codificam duas isoformas de fosfolipase Cβ (PLC21C e NORPA), e mutações que afetam norpA (norpAP24) mas não plc21c (plc21cP319) também interrompem a acumulação na faixa de 18 ° C ( Figura 3D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57963/57963fig1.jpg"> Figura 1. Aparelhos para realização do ensaio de single-direcional gradiente de temperatura. (A) de alumínio teste placa utilizada para análise do comportamento thermotaxis larval. As 13 linhas pretas no topo e no fundo demarcam 12 zonas (10 mm cada). O fundo do prato é anodizado com tinta preta, para que seja mais fácil de visualizar as larvas. (B) dimensões da placa de alumínio (indicado em milímetros). O tamanho exterior da placa de alumínio é 140 x 100 x 9 mm. O tamanho interno da placa de alumínio é 130 x 90 x 8 mm. As marcações são separadas por 10 mm. A primeira e a última demarcação é 5 mm das bordas da área interna da placa. (C) Top e vistas do lado de um dos blocos de alumínio usada para controlar a temperatura do gradiente. O bloco tem dois conectores usados para unir-se aos tubos de silicone, que se conectar a um banho de água. (D) dimensões de um bloco de alumínio. O tamanho exterior do bloco de alumínio é 255 x 50 x 14 mm. O diâmetro do caminho interior de água é de 7 mm. Dois conectores de 30 mm à esquerda conectar com tubo de silicone que se estende até o banho de água. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57963/57963fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57963/57963fig2.jpg"> Figura 2. Configurações de gradiente do ensaio de single e bidirecional. (A) gradiente configuração de Single-direcional com duas placas de ensaio de alumínio em dois blocos de alumínio. As temperaturas dos blocos de alumínio são controladas pela água de dois banhos de água de circulação. (B) o acordo dos três blocos de alumínio, banhos de água e uma placa de alumínio (250 x 220 mm) para um gradiente bidirecional. Os blocos de esquerda e direito estão conectados para o banho de água a mesma e o bloco médio está ligado ao outro banho de água. A placa de ensaio de alumínio é empacotada com fita para formar uma parede de 10 mm para conter o agarose a 1%. (C) posições para verificar temperaturas (indicadas por pontos) e liberar as larvas na placa. Antes de iniciar um experimento, verifique a temperatura em dois pontos dentro de cada zona para confirmar que o gradiente de temperatura linear desejado é estabelecido. Larvas são liberadas na área indicada, perto da linha mediana. As larvas são contadas dentro de cada uma das zonas de 2 cm. (D) posições para verificar as temperaturas (indicadas por pontos) e as zonas de lançamento para as larvas em um gradiente de bidirecional. Um número igual de larvas é liberado ao longo da linha mediana de cada metade do gradiente bidirecional. Os números de larvas são contados em cada um dos 10 (2 cm) zonas. Um conjunto típico de temperaturas (18 ° C e 26 ° C) na superfície de agarose é indicado. (E) as temperaturas medidas ao longo das linhas de borda e midlines de cada zona em um gradiente de single-direcional de amostra. Dados representam temperaturas média ± SD. n = 8 ensaios (150 ± 50 larvas/ensaio). Partes desta figura são reproduzidas de et al . Sokabe 8 com pequenas modificações. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57963/57963fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57963/57963fig3.jpg"> Figura 3. Resultados representativos usando ensaios gradientes single-direcional e bidirecional. (A, B) Quer dizer percentagens de larvas em 6 zonas do gradiente de single-direcional. Os dados incluem 3rd ínstar larvas nas horas indicadas após a postura (AEL) de ovos. n = 6-7. As barras de erro em um representam ±SEM. (C) térmica distribuições do pre-escalada final-3rd ínstar larvas de controle (w1118) e trpA1 mutantes do gradiente de single-direcional. n = 3-4. As barras de erro representam ±SEM. (D) térmica distribuições das larvas ínstar final-3rd de controle (w1118) e PLCβ mutantes do gradiente de single-direcional. n = 4-6. As barras de erro representam ±SEM. (E) distribuição representativa de pre-escalada, tarde-3rd ínstar larvas (w1118) do gradiente bidirecional. As zonas de ensaio de esquerda e direita são indicadas por linhas pontilhadas e separadas por zona não-contagem no centro (região sombreada). (F) percentagem de pre-escalada tarde-3rd ínstar larvas (w1118) em cada zona ao longo do gradiente térmico. As larvas foram colocadas no canto esquerdo e o direito zonas de lançamento. As zonas de ensaio são separadas por uma zona de não-contagem de 3 cm no centro e as distribuições são calculadas de forma independente. As barras de erro representam SEMs. n = 3 ensaios (200-400 larvas/ensaio). Partes desta figura são reproduzidas de et al . Sokabe 8 com pequenas modificações. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57963/57963fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Horas AEL</td>
			<td colspan="2">Estágio larval</td>
		</tr>
<tr>
<td>24</td>
			<td colspan="2">1st ínstar</td>
		</tr>
<tr>
<td>48</td>
			<td colspan="2">2nd ínstar</td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td colspan="2">Início-3rd ínstar</td>
		</tr>
<tr>
<td>96</td>
			<td colspan="2">Ínstar meados-3rd</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td colspan="2">Ínstar final-3rd , apenas antes de subir o palco</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. A relação entre as horas depois (AEL) de postura de ovos e estágios larvais.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gradiente de temperatura na placa de agarose (inclinação)</td>
			<td>Temperaturas dos banhos de água</td>
			<td>Temperaturas de blocos de alumínio</td>
		</tr>
<tr>
<td>10.0-25,0 ° C (1.5° C/cm)</td>
			<td>~6.5-7°C/~28.5°C</td>
			<td>~8.5°C/~26.8°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>18,0-28,0 ° C (1° C/cm)</td>
			<td>~16.8°C/~31.0°C</td>
			<td>~17.8°C/~29.7°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>14.0-34,0 ° C (2° C/cm)</td>
			<td>~10.0°C/~40.0°C</td>
			<td>~11.8°C/~36.8°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>12.5-42,0 ° C (2,95 ° C/cm)</td>
			<td>~7.0°C/~55.0°C</td>
			<td>~9.4°C/~49.4°C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2. Gradientes de temperatura típicas e as temperaturas correspondentes dos banhos de água e blocos de alumínio para gradientes direcionais simples.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gradiente de temperatura na placa de agarose</td>
			<td>Temperaturas dos banhos de água</td>
			<td>Temperaturas de blocos de alumínio</td>
		</tr>
<tr>
<td>22/10/22 ° C (1.5 ° C/cm)</td>
			<td>~5.0°C /~25.0°C</td>
			<td>~7.5°C/~24.0°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>26-18-26 ° C (1° C/cm)</td>
			<td>~15.8°C /~30.6°C</td>
			<td>~16.9°C/~28.4°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>30-14-30 ° C (2° C/cm)</td>
			<td>~8.5°C /~36.4°C</td>
			<td>~10.9°C/~32.8°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>36-12,5-36 ° C (2,95 ° C/cm)</td>
			<td>~5.0°C /~47.2°C</td>
			<td>~7.9°C/~40.9°C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3. Gradientes de temperatura típicas e as temperaturas correspondentes dos banhos de água e blocos de alumínio para gradientes bidirecional.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Idade larval (AEL)</td>
			<td>Tempo de ensaio (única direcional)</td>
			<td>Tempo de ensaio (bidirecional)</td>
		</tr>
<tr>
<td>24 h</td>
			<td>30 min</td>
			<td>35 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>48 h</td>
			<td>22 min</td>
			<td>27 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 h</td>
			<td>16 min</td>
			<td>21 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>96 h</td>
			<td>13 min</td>
			<td>18 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>120 h</td>
			<td>10 min</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 4. Diferentes idades larvas (AEL) e os tempos de ensaio correspondentes.

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A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a temperatura ambiental preferida de larvas de Drosophila usando um gradiente térmico contínuo.

Um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

7.5K visualizações.  University of California, Santa Barbara. Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a temperatura ambiental preferida de larvas de Drosophila usando um gradiente térmico contínuo.

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Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Métodos locais e globais de Avaliação nocicepção térmica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Neurociência

An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time

Temperature is a ubiquitous environmental factor that affects how species distribute and behave. Different species of Drosophila fruit flies have specific responses to changing temperatures according to their physiological tolerance and adaptability. Drosophila flies also possess a temperature sensing system that has become fundamental to understanding the neural basis of temperature processing in ectotherms. We present here a temperature-controlled arena that permits fast and precise temperature changes with temporal and spatial control to explore the response of individual flies to changing temperatures. Individual flies are placed in the arena and exposed to pre-programmed temperature challenges, such as uniform gradual increases in temperature to determine reaction norms or spatially distributed temperatures at the same time to determine preferences. Individuals are automatically tracked, allowing the quantification of speed or location preference. This method can be used to rapidly quantify the response over a large range of temperatures to determine temperature performance curves in Drosophila or other insects of similar size. In addition, it can be used for genetic studies to quantify temperature preferences and reactions of mutants or wild-type flies. This method can help uncover the basis of thermal speciation and adaptation, as well as the neural mechanisms behind temperature processing.

An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time

Here we present a protocol to automatically determine the locomotor performance of Drosophila at changing temperatures using a programmable temperature-controlled arena that produces fast and accurate temperature changes in time and space.

Um método automatizado para determinar o desempenho de Drosophila em resposta às mudanças de temperatura no espaço e no tempo

Temperature is a ubiquitous environmental factor that affects how species distribute and behave. Different species of Drosophila fruit flies have specific ...

Comportamento

<meta charset="utf8"></head><body>Medição de tolerância ao calor de alto rendimento em Drosophila usando sistemas DAM2

Heat Tolerance Assays Using the Drosophila Activity Monitor System: A Guide to an Executable Application for Data Analysis

The study of heat tolerance in&#8239;Drosophila melanogaster has been of particular interest to researchers for decades, with a common approach to assessing heat tolerance being to monitor the time to knockdown (TKD) after exposure to an elevated temperature. Classically, flies are housed in individual vials and placed inside a heated water bath. TKD is then monitored manually by researchers. While very well-established, there remain problems of subjectivity and consistent application of a tangible definition of cessation of all movement, including muscular spasms, when implementing these manual assays. We have developed a high-throughput method for automating heat tolerance assays using the TriKinetics Drosophila Activity Monitors (DAM2). To accompany the DAM2 system, we have written a program and created an easy-use executable to automatically read the last time of movement from the activity data generated. This script then writes to a .csv file the time to heat paralysis (TKD) for each fly. Our data show that this automated DAM2 method is consistent and reliable. Meanwhile, activity profiles created from the activity count data are of interest. These activity profiles can be compiled and have the potential to expand heat tolerance assays to include the relatively unstudied behavioral components of heat tolerance. This protocol will describe in detail how to use the DAM2 system and the HoTDAM! software to estimate heat tolerance in D. melanogaster.

<meta charset="utf8"></head><body>Ensaios de tolerância ao calor usando o sistema de monitoramento de atividade de Drosophila : um guia para um aplicativo executável para análise de dados</p

This report describes a method for measuring adult Drosophila melanogaster time to knockdown using a Drosophila Activity Monitor (DAM2) in response to an air conduction heat stressor within an incubator chamber. The DAM2 measures activity by recording individual fly movements as they cross an infrared beam. Data analysis is facilitated by a novel executable file created by the authors.

Ensaios de tolerância ao calor usando o sistema de monitoramento de atividade de Drosophila : um guia para um aplicativo executável para análise de dados

The study of heat tolerance in&#8239;Drosophila melanogaster has been of particular interest to researchers for decades, with a common approach to ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Romance Ensaio para Fria nocicepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Projeto e Análise do Comportamento de Preferência de Temperatura e seu Ritmo Circadiano em Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Biologia

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Medição da Actividade larval no<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Atividade

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are essential for predicting responses to climate change. This work describes two high-throughput protocols for measuring insect thermal limits: one for assessing critical thermal minima (CTmin), and the other for assessing heat knock down time (KDT) in response to a static heat stressor. In the CTmin assay, individuals are placed in an acrylic-jacketed column, subjected to a decreasing temperature ramp, and counted as they fall from their perches using an infrared sensor. In the heat KDT assay, individuals are contained in a 96 well plate, placed in an incubator set to a stressful, hot temperature, and video recorded to determine the time at which they can no longer remain upright and move. These protocols offer advantages over commonly used techniques. Both assays are low cost and can be completed relatively quickly (~2 h). The CTmin assay reduces experimenter error and can measure a large number of individuals at once. The heat KDT protocol generates a video record of each assay and thus removes experimenter bias and the need to continuously monitor individuals in real time.

Thermal limits can predict the environments organisms tolerate, which is valuable information in the face of rapid climate change. Described here are high-throughput protocols to assess critical thermal minima and heat knockdown time in insects. Both protocols maximize the throughput and minimize the cost of the assays.

Ensaios de alta taxa de limite térmico em insetos

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are ...

Determining Temperature Preference of Mosquitoes and Other Ectotherms

Most insects and other ectotherms have a relatively narrow optimal temperature window, and deviation from their optima can have significant effects on their fitness, as well as other characteristics. Consequently, many such ectotherms seek out their optimal temperature range. Although temperature preferences of mosquitoes and other insects have been well studied, the traditional experimental setup is performed using a temperature gradient on an aluminum surface in a highly enclosed space. In some cases, this equipment restricts many natural behaviors, such as flying, which may be important in preference selection.
The objective of this study is to observe insect preference for air temperature by using a two-chamber apparatus with sufficient room for flight. The two chambers consist of independent temperature-controlled incubators, each with a large aperture. The incubators are connected by these apertures using a short acrylic bridge. Inside the incubators are two netted cages, linked via the apertures and bridge, allowing the insects to freely fly between the different conditions. The acrylic bridge also acts as a temperature gradient between the two incubators.
Due to the spacious area in the cage and easy construction, this method can be used to study any small ectotherm and/or any manipulation which may alter temperature preference including sensory organ manipulation, diet, gut flora, and endosymbiont presence at biosafety levels 1 or 2 (BSL 1 or 2). Additionally, the apparatus can be used for the study of pathogen infection using further containment (e.g., inside of a biosafety cabinet) at BSL 3.

Insects have an optimal environmental temperature range which they seek to remain within, and many external and internal factors can alter this preference. Here, we describe a cost-effective and simple method to study temperature choice, which allows insects to freely exhibit their natural behaviors.

Determinando a preferência de temperatura de mosquitos e outros ectotérmicos

Most insects and other ectotherms have a relatively narrow optimal temperature window, and deviation from their optima can have significant effects on ...

Um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila

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Métodos locais e globais de Avaliação nocicepção térmica em

Um método automatizado para determinar o desempenho de Drosophila em resposta às mudanças de temperatura no espaço e no tempo

Ensaios de tolerância ao calor usando o sistema de monitoramento de atividade de Drosophila : um guia para um aplicativo executável para análise de dados

Ensaios de tolerância ao calor usando o sistema de monitoramento de atividade de Drosophila : um guia para um aplicativo executável para análise de dados

Ensaios de tolerância ao calor usando o sistema de monitoramento de atividade de Drosophila : um guia para um aplicativo executável para análise de dados

Romance Ensaio para Fria nocicepção em

Projeto e Análise do Comportamento de Preferência de Temperatura e seu Ritmo Circadiano em Drosophila

Medição da Actividade larval no

Ensaios de alta taxa de limite térmico em insetos

Determinando a preferência de temperatura de mosquitos e outros ectotérmicos