Name: a temperature gradient assay to determine thermal preferences of drosophila larvae
Uploaded: 2018-06-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae at JoVE.com

C.M. נתמך על ידי מימון NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278), של NIAID (1DP1AI124453).

<ol>
	<li>Fowler, M. A., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+TRP+channels+and+animal+behavior.">Drosophila TRP channels and animal behavior.</a> Life Sci. 92, 394-403 (2013).</li><li>Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+cellular+basis+of+thermosensation+in+mammals.">The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals.</a> Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).</li><li>Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+thermosensation+in+mammals.">Peripheral thermosensation in mammals.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).</li><li>Rosenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ortholog+of+vertebrate+TRPA1+regulates+thermotaxis.">The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis.</a> Genes Dev. 19, 419-424 (2005).</li><li>Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+thermotactic+behavior+via+coupling+of+a+TRP+channel+to+a+phospholipase+C+signaling+cascade.">Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade.</a> Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).</li><li>Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+thermotactic+discrimination+between+the+optimal+and+slightly+cooler+temperatures+via+a+TRPV+channel+in+chordotonal+neurons.">Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons.</a> J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).</li><li>Shen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+rhodopsin+in+temperature+discrimination+in+Drosophila.">Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila.</a> Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).</li><li>Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+switch+in+thermal+preference+in+Drosophila+larvae+depends+on+multiple+rhodopsins.">A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins.</a> Cell Rep. 17, 336-344 (2016).</li><li>Ni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ionotropic+Receptors+IR21a+and+IR25a+mediate+cool+sensing+in+Drosophila.">The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila.</a> Elife. 5, 13254 (2016).</li><li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigational+decision+making+in+Drosophila+thermotaxis.">Navigational decision making in Drosophila thermotaxis.</a> J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).</li><li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: a laboratory handbook. , (2005).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כדי להבטיח את ההצלחה של פרוטוקול זה, חשוב לנקוט צעדים כדי להשיג נאותה מספרים של הזחלים לביצוע הניסויים. אלה כוללים מראש האכלה של זבובים בקבוקונים המכילים הדבק שמרים במשך 2-3 d כדי לשפר את הנחת הביצה. הבקבוקונים צריך להיות מניחים במגש המכיל מים בקבוקונים בתוך שקית פלסטיק שקוף, אשר שומרת על הלחות של המזון ומקדם האכלה יעיל על ידי הזחלים בזמן המתיר חשיפה מחזורים בהירה-כהה נורמליים. עם זאת, הדבק שמרים לא צריך להיות כל כך רך הזבובים הופכים לכוד. מספר נקבות לכל מבחנה תלויה גנוטיפ. במקרה של w1118, זה בדרך כלל מספיקה לאפשר ~ 12 נקבות וזכרים ~ 6 להטיל ביצים במשך 3 שעות. שתי מבחנות מספקים בדרך כלל מספיק הזחלים (100-200 הזחלים) להניח על צלחת וזמינותו חד כיווני. אם המניה לטוס מטילה ביצים פחות מאשר פראי-סוג או חלקם של הזחלים שבוקעים מצטמצם, להוסיף נקבות נוספים (עד 30-35/מבחנה) וזכרים.
ישנם גורמים רבים ההשתנות לא מכוונות בעת ביצוע מבחני אלה. השלב ההתפתחותי משפיעה הטמפרטורה ההעדפה של הזחלים. לכן, זה הכרחי לשימוש בזהירות את הזחלים של שלב מוגדרים. כדי לעשות זאת, לאסוף את הזחלים על מסגרת הזמן צר (כגון 3h). מאז ומועדף תנאים (טמפרטורה, לחות, מחזור בהירה-כהה, סוג של מזון), כמה מוטציות משפיעה על קצב ההתפתחות, לא להסתמך אך ורק על הזמן אחרי ביצה הנחת לנתח וזהובה בגילאי הזחלים. חשוב גם לבחון מאפיינים פיזיים, כגון הגודל של הפה ווים ו spiracles7 כדי לקבוע הזחלים של אחרים שונים, מאותו שלב התפתחותי. זמני עבור 1סנט, 2nd וזחלים 3rd לחלל לפתח (טבלה 1) מבוססות על שימוש מזון המבוסס על כשהתירס הדגירה 25 ° c תחת אור 12 h: 12 מחזורים כהה h. הזחלים גדלים לאט יותר על מזון המבוסס על מולסה. הידרציה נאותה וטריות המזון משפיע גם את הצמיחה של הזחלים. כמות המים במזון צריך להשאיר את האוכל לא יבש מדי לקלף ממנו המבחנה ולא רפוי מדי עקב מים מופרזת. באופן אידיאלי, השכבה ~ 5 מ"מ הקרוב ביותר פני מזון מותנה על ידי גידול הזחלים ועובר בקלות כאשר המבחנה מוטה או הקיש. במצב זה יכולה להיות מושגת באמצעות מזון טרי עם הזחלים 50-100.
זה חיוני כדי ליצור מעבר הדרגתי טמפרטורה יציבה לפני ביצוע וזמינותו. לכן, הפעל את המים הרותחים 1-2 h מוקדמת לראשיתו וזמינותו, המרחצאות מים לייצר חום, עלול לשנות את טמפרטורת החדר, אשר בתורו יש את היכולת להשפיע על מעבר הצבע. לאחר 1-2 h, טמפרטורת הסביבה של החדרים הממוזגים ביותר equilibrates. עם זאת, זה חייב להיקבע בסביבה בכל. בנוסף, בעת יצירת מעבר צבע עם טווח טמפרטורה גדול (> 3.0 מעלות צלזיוס/ס מ), זה יכול להיות קשה להשיג מעבר צבע יציב. תנועה קטנה של צלחת assay משתנה יותר באופן משמעותי מעבר הצבע החום כאשר הטווח הוא גדול (לדוגמא > 3.0 מעלות צלזיוס/ס מ). מצאנו כי מעבר צבע 1-2 ° C/cm מייצרת מעברי הצבע הכי יציב.
ישנם מספר שיקולים נוספים שצריכים להיות נשלט כדי להגביל את דרגות השונות מבחני thermotaxis. לשטוף את הזחלים הוא קריטי, כמו הנוכחות של חלקיקי מזון או סוכרוז על הזחלים יכולים להשפיע וזמינותו. יש לבצע את השלבים כביסה ביסודיות אבל מהר, כי הגבלת אספקת החמצן שלהם בצורה מוגזמת בזמן שהם הם שקועים מים עשוי להשפיע על בריאותם. לכן, אנו ממליצים להשתמש מסננת את התא (אפשרות 2) כדי לנקות את הזחלים. מסננת עם גודל הנקבוביות של 300 מיקרומטר עובד היטב עבור הזחלים ב המוקדמות-3rd instar הבמה (72 h AEL) ומעלה. בנוסף, חשוב לבצע ניסויים באותו זמן של יום, כגון מזמן Zeitgeber (ZT) ZT4 כדי ZT8 (ZT = 0 הוא כאשר אורות דולקים), כדי להגביל את השתנות בשל ההשפעות של השעון הביולוגי מקצבים על הבחירה טמפרטורה. רמת לחות בצלחת agarose יכול גם לגרום השתנות בתוצאות. בעוד פני השטח של הלוחות צריך להיות לח, טיפות מים יכול ללכוד את הזחלים, לכן צריך להימנע.
הגבלת דרגות השונות מבחני יעשה את זה ניתן לקבל תוצאות חזקות מבלי לבצע מספר רב של ניסויים עצמאית. בדרך כלל, 3-8 ניסויים עצמאית מספיקים להשיג תוצאה אמינה. לטבלאות נכונה של התוצאות הוא גם קריטי להצלחת מבחני thermotaxis. לא נחשבות הזחלים מופץ בהאזורים בתוך 0.5 ס מ בקירות אלומיניום, מאז הטמפרטורות אינן לינאריות באזורים אלה. הזחלים מסוימים ימוקמו בגבול שבין שני אזורי, בזמנו שוזמינותו הסתיימה. אם יותר מ- 50% של אורך הגוף נמצא באזור אחד, ואז לכלול הזחל לטבלאות עבור אזור זה. אם זחל בדיוק 50% בכל אחד לשני אזורים, ואז נחשבים לחיה 0.5 זחלים. בתוך כל אזור.
בעוד וזמינותו ההדרגתי מאפשר את הזחלים להפלות מגוון של הבדלי טמפרטורה, קיימות מגבלות לטמפרטורות העליון והתחתון זה יכול להיבדק באופן יעיל. . זה לא ריאלי כדי לבדוק את הטמפרטורות < 10 ° C מאז הניידות של הזחלים מקטין באופן משמעותי בטמפרטורות נמוכות. אמנם ניתן ליצור מעברי צבע עם הטמפרטורה העליון להגיע ל־42 ° C, כמעט אין שליטה הזחלים להישאר בכל אזור > 28 ° C. לכן, מבחני מעבר רציף אינה יכולה לשמש להפלות העדפות טמפרטורה בין האזורים השונים > 28 ° C. עם זאת, מבחני הדרגה בטמפרטורות גבוהות אלה יכול לשמש שעלולים לאפיין מוטנטים אם הם זזו מאוד טמפרטורה חמימה העדפות.
אם מוטציה יש פגם גינקולוגיות, ייתכן צורך לערוך ניסויים נוספים כדי לוודא כי ההעדפה טמפרטורה לכאורה אינה מדויקת בשל לקות תנועה. כדי לתקן בעיה פוטנציאלית זו, ייתכן צורך להקים עוד פעמים assay כדי לאפשר את הזמן הנוסף של בעלי חיים לעבור אל אזורי הרצוי שלהם. גם יכול להיות מועסק וזמינותו הדרגתיות דו-כיוונית כדי לבדוק אם החיות בחר אזור מועדף אותו, בלי קשר לגבי היכן הם ממוקמים בתחילה על הצלחת.
לסיכום, מבחני הדרגה המתוארים כאן יש יתרונות אחרים מבחני thermotaxis. בעוד הבחירה דו-כיווני מבחני שימושיות, כפי שהם יכולות להניב תוצאות חזקות, במיוחד כאשר ההבדלים בטמפרטורה בין שני אזורי גדולים, הם אינם יעילים חושפים את הטמפרטורה האידיאלית המועדף על הזחלים בניסוי יחיד. לשם כך דורש ביצוע שילובים רבים של ברירה דו-כיוונית כדי לקבוע את המועדפת ביותר הטמפרטורה5,6,7. לעומת זאת, וזמינותו הדרגתיות מספק החיה הזדמנות לבחור אזור הטמפרטורה שלהם בסביבה עם נוף טמפרטורה רציפה אחת. לכן צורך לתכנן שילוב גדול של אפשרויות דו-כיוונית כדי לקבוע תרמי הסביבה המועדפת. כדי להעריך את השפעת הטמפרטורה על הדינמיקה נע של זחל10כבר מועסקים לומד thermotaxis באמצעות צלחת פטרי עגול. עם זאת, פחות שימושי האפליה בין העדפות בין טמפרטורות שונות, שכן כל אזור הוא בגודל שונה. לבסוף, בגלל הפשטות וזמינותו, השירות שלה בהעדפות קטנים בטמפרטורה מפלה ב וזמינותו יחיד, זה יכול להיות מועסק מסך עשרות גנים מועמד פוטנציאלי המעורבים העדפה טמפרטורה זחל שעשוי אחרת תהיה תסולא בפז באמצעות מבחני אחרים

Thermotaxis הוא מועסק על ידי חיות ניידים לבחירת סביבה עם מצוינות והומלץ תנאים1,2,3. אם האקלים בצורה מוגזמת חם או קר, התנהגות זו חיונית להישרדותו. בנוסף, בעלי חיים רבים רגישים מאוד קטן הבדלי טמפרטורה בטווח נוח ונחפש את הסביבה עם טמפרטורה אידיאלית. זה חשיבות מיוחדת עבור אורגניזמים poikilothermic כמו זבובי פירות, אשר equilibrate טמפרטורת גופם עם הסביבה. מבחני לעקוב אחר thermotaxis הזחל סייעו בזיהוי, ולהבהיר את התפקידים של חיישנים מולקולריים כגון דרוזופילה ארעי קולטן פוטנציאליים (TRP) ערוצים4,5,6, rhodopsins7,8, ionotropic קולטן קולטנים (IRs)9, ואשר היצוקים החיות האלה עם רגישויות הטמפרטורה מעל טמפרטורה שונות טווחים.
בדיקת הבחירה דו כיוונית מספקת גישה אחת ללמוד העדפות תרמי ב הזחלים6,7. וזמינותו כרוך בהקמת שני אזורי טמפרטורה שונות ומאפשרת החיות לבחור צד אחד על השני. התוצאות של מבחנים דו כיוונית הבחירה יכול להיות חזקים, במיוחד אם ההבדלים בטמפרטורה בין שתי האפשרויות הן גדולות. בנוסף, מאז כל assay כרוך ליווח רק לשתי קבוצות, הנתונים ניתן לבטא מאינדקס העדפה פשוטה. הקלות והפשטות של מבחני בחירה דו-כיווני נתונות גם למסכים גנטי. אולם, מגבלה עיקרית היא כי ניסויים רבים נדרשים לקבוע את הטמפרטורה המועדף של חיות פראי-סוג או מוטציה.
Assay הדרגתיות מציעה הזדמנות להקים את הטמפרטורה המועדף assay יחידה8. יתר על כן, בניגוד הבדיקה הבחירה דו-כיווני, הוא מאפשר את ההערכה של ההתפלגות של קבוצה של בעלי חיים, כאשר התעמת עם טווח רציף של טמפרטורות. Assay מעבר צבע אחד משתמש צלחת פטרי וחיות יחיד והוא מתאים היטב אפיון ההתנהגות מפורט של חיות בודדות10. אולם, מאז פטרי עגול, הגודל של אזורי טמפרטורה משתנים, קטנים בהדרגה בהתאם למרחק מן המרכז. לכן, תוכנית התקנה זו אינה אידיאלית לניטור הבחירות טמפרטורה של אוכלוסיות בעלי חיים.
מנגנון הדרגתיות תרמי רציפה, כי הוא מתאים היטב כדי להעריך את העדפות טמפרטורה של קבוצות של הזחלים מעסיקה של ארנה מלבני, מתואר כאן. המנגנון הוא פשוט לבנות ולהרכיב. בנוסף, מעבר הצבע הוא ליניארי, הוא גמיש, כמו זה יכול לשמש כדי להעריך את thermotaxis מעל טמפרטורה גדול נע בין 10 ° C ל 42 º C. וזמינותו היא מהירה וישירה לביצוע ותשואות לשחזור נתונים. בנוסף דיווח הטמפרטורה המועדף של הזחלים, היא מגלה את ההעדפות של אוכלוסיית חיות מעל וההתדיינות ליניארי בניסוי יחיד. בשל יתרונות אלו, זה הוא בחירה מצוינת עבור זיהוי גנים הדרושים עבור thermotaxis.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Gradient assay apparatus&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath</td><td>Thomas Scientific</td><td>9106</td><td>This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.</td></tr><tr><td>Aluminum assay plate (for single directional gradient)</td><td></td><td></td><td>Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.</td></tr><tr><td>Aluminum plate (for bidirectional gradient)</td><td></td><td></td><td>25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.</td></tr><tr><td>Aluminum block</td><td></td><td></td><td>Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.</td></tr><tr><td>Connector for aluminum blocks and tubing</td><td>McMaster-Carr</td><td>91355K82</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Sanitary Silicone Tubing</td><td>Tygon</td><td>57296</td><td>1/4&quot; ID x 3/8&quot; OD x 1/16&quot; wall</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Items and reagents for assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pestle</td><td>USA Scientific</td><td>17361</td><td>Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Fluke</td><td>51II</td><td></td></tr><tr><td>Thermocouple</td><td>Fluke</td><td>K type</td><td></td></tr><tr><td>Universal microplate lid</td><td>Corning</td><td>6980A77</td><td></td></tr><tr><td>35 mm dish</td><td>Corning</td><td>9380D40</td><td></td></tr><tr><td>Labeling tape (for bidirectional gradient)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-951</td><td>Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>Prepare 1% solution</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389-5KG</td><td>Prepare 18% solution right before starting assay</td></tr><tr><td>Paint brush</td><td>Fisher Scientific</td><td>11860</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tubes</td><td>Denville</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Scoopula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>500 mL round wide-mouth bottle</td><td>Pyrex</td><td>1395-500</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (300 mm pore)</td><td>PluriSelect</td><td>43-50300</td><td>Optional item for larvae washing</td></tr><tr><td>Cardboard box (vial tray)</td><td>Genesee Scientific</td><td>FS32-124</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;&lt;strong&gt; food&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distilled water</td><td></td><td></td><td>22,400 mL</td></tr><tr><td>Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg</td><td>LabScientific Inc.</td><td>NC0535320</td><td>1,609 g</td></tr><tr><td>Brewers yeast 100 lbs</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN90331280</td><td>379 g</td></tr><tr><td>NutriSoy&amp;reg; Soy Flour (10 kg/unit)</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-115</td><td>221 g</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Agar, Type II (5 kg)</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td>190 g</td></tr><tr><td>Karo light corn syrup</td><td>Karo</td><td></td><td>1,700 mL</td></tr><tr><td>Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H5501-5KG</td><td>72 g/240 mL</td></tr><tr><td>Propionic acid puriss. p.a.,&gt;99.5% (GC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81910-1 L</td><td>108 mL</td></tr><tr><td>Phosphoric acid&amp;nbsp;ACS reagent, &amp;ge;85 wt. % in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438081-500 mL</td><td>8.5 mL</td></tr></tbody></table>

a temperature gradient assay to determine thermal preferences of drosophila larvae

בעלי חיים רבים, כולל זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מסוגלים מפלה דקה ההבדלים בטמפרטורה הסביבה, המאפשרת להם לחפש את נוף תרמי המועדפת שלהם. כדי להגדיר את העדפות טמפרטורה של הזחלים מעל טווח מוגדר ליניארי, פיתחנו וזמינותו של שימוש הדרגתי בטמפרטורה. כדי ליצור מעבר הדרגתי חד כיווני, שני רחובות אלומיניום מחובר אמבטיות מים עצמאית, שכל אחד מהם שולט הטמפרטורה של בלוקים בודדים. שני רחובות להגדיר את הגבולות העליון והתחתון של מעבר הצבע. מעבר הצבע החום היא הוקמה על ידי הצבת צלחת אלומיניום מצופה agarose מעל שני רחובות שבשליטת מים כך הצלחת משתרע על המרחק ביניהם. הקצוות של צלחת אלומיניום המוגדר על אבני מים מגדיר את טמפרטורת מינימום ומקסימום, ויוצרים האזורים שביניהם שני רחובות הדרגתי טמפרטורה לינארי. הדרגתיות וזמינותו שניתן להחיל על רימות בגילאים שונים, ניתן להשתמש כדי לזהות מוטנטים כי התערוכה הפנוטיפים, כגון אלה בעלי מוטציות המשפיעות על גנים קידוד TRP ערוצים ו opsins, אשר נדרשים עבור טמפרטורה אפליה.

להקים 18 ° C - 28 מעלות צלזיוס חד כיווני ההדרגתי, נוכל להגדיר הטמפרטורות של שתי אמבטיות מים 16.8 ° C ו- 31 מעלות צלזיוס. אנו משיגים את הטמפרטורות ב 13 נקודות על ידי מדידת הטמפרטורה ב 26 תנוחות בתוך החלק העליון והחלק התחתון של כל האזורים 6, קווי הגבול בין אזורי, ולא בקצוות הקיצוניים של המשטח ג'ל agarose (איור 2C, 2E). התפלגות טמפרטורה לאורך מעבר הצבע היה כמעט ליניארי (Y = 0.9672 * X + 16.19, R2 = 0.9961) (2E איור).
אנחנו לבדיקה בהעדפות טמפרטורה של הזחלים שליטה (w1118) בגילאים שונים. 1סנט (24 ± 1.5 h AEL), 2nd (48 ± 1.5 h AEL) וזחלים מוקדם-3rd (72 ± 1.5 h) הראה הפסגות באזור 24 ° C (איור 3 א, ב'). ההעדפות טמפרטורה השתנה במהלך 3rd instar התפתחות הזחל. האחוז הגבוה ביותר של אמצע-3rd לחלל (96 ± 1.5 h AEL) שהצטברו באזור 18 ° C (איור 3 א, ב'), הנטיה הזו עולה עם הגיל. בין הזחלים לחלל מאוחר-3rd (טיפוס מראש; 120 ± 1.5 h AEL), ~ 50% מקובצים באזור 18 ° C, הבחירה של טמפרטורה זו היה ~ 4-fold גבוה יותר מאשר אזור הסמוך-20 ° C (אזור 18 ° C, 50.2%; אזור 20 ° C, 15.1%; איור 3 א ב'). נטייה לצבור באזור 18 ° C ב- w1118 שלא מיועד אפקט הקצה מאז המנוח-3rd instar הזחלים עדיין שהצטברו באזור 18 ° C, באמצעות הדרגתי טמפרטורת דו-כיווני (איור 3E, נ ).
בדקנו גם את הזחלים לחלל מאוחר-3rd (120 ± 1.5 h AEL) עם מוטציות בגנים הדרושות מפלה הבדלי טמפרטורה בטווח נוח. אלה כוללים trpA1, אשר נדרש לבחירה לחום 18 ° C - 24 מעלות צלזיוס טווח5,7,8. הזחלים עם מוטציה null ב- trpA1 (trpA11) להפיץ באופן שווה על פני כל 18 ° C-28 מעלות צלזיוס הדרגתי (איור 3C). הזחלים חסר רק את A ו- B איזופורמים (trpA1-ABG4), או את איזופורמים C ו- D (trpA1-CDG4) גם הצג מגבלות קשות (איור 3C). זבובים לקודד שני איזופורמים של phospholipase Cβ (PLC21C ו- NORPA), וכן מוטציות המשפיעות גם על norpA (norpAP24) אבל לא plc21c (plc21cP319) לשבש הצטברות בטווח 18 ° C ( איור תלת-ממד).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57963/57963fig1.jpg"> איור 1. מכשירי ביצוע וזמינותו שינוי טמפרטורה חד כיווני. (א) אלומיניום מבחן לצלחת משמש assaying thermotaxis הזחל התנהגות. הקווים השחורים 13 בחלק העליון והתחתון לתיחום אזורי 12 (10 מ מ כל אחד). החלק התחתון של הלוח הוא anodized בצבע שחור כך שיהיה קל יותר לדמיין את הזחלים. מידות (B) של צלחת אלומיניום (מסומן במ מ). הגודל החיצוני של צלחת אלומיניום הוא 140 x 100 x 9 מ מ. הגודל הפנימי של צלחת אלומיניום הוא 130 x 90 x 8 מ מ. מטוס מופרדים באמצעות 10 מ מ. להבחנה הראשון והאחרון הוא 5 מ מ קצות האזור הפנימי של הצלחת. (ג) ראש ומשמשת נופים צדדיים של אחת מאבני אלומיניום לשלוט בטמפרטורה של מעבר הצבע. הרחוב יש שני מחברים נהגו לצרף שפופרות סיליקון, אשר להתחבר באמבט מים. (ד) מידות בלוק אלומיניום. הגודל החיצוני של בלוק אלומיניום הוא 255 x 50 x 14 מ מ. הקוטר של נתיב המים הפנימי הוא 7 מ מ. שני מחברים 30 מ מ בצד השמאל להתחבר עם צינורות סיליקון זה מרחיב את האמבט במים. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57963/57963fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57963/57963fig2.jpg"> באיור 2. כיוונוני assay מעבר צבע יחיד וכן הדו-כיווניים. (א) ההתקנה מעבר חד כיווני עם שתי צלחות assay אלומיניום על שתי קוביות אלומיניום. הטמפרטורות של הבלוקים אלומיניום נשלטים על ידי במחזור מים שתי אמבטיות מים. (B) הסידור של שלושה בלוקים אלומיניום, אמבטיות מים, צלחת אלומיניום (250 x 220 מ מ) עבור הדרגה דו-כיווניים. בלוקים ימינה ושמאלה מחוברים לאמבט מים באותו ומחובר הרחוב האמצעי לאמבטיה מים אחרים. הצלחת assay אלומיניום עטופים עם הקלטת כדי ליצור קיר 10 מ מ כדי להכיל את agarose 1%. (ג) עמדות לבדוק טמפרטורות (שצוין על-ידי נקודות), כדי לשחרר את הזחלים על הצלחת. לפני ביצוע ניסוי, בדוק, הטמפרטורה של שתי נקודות בתוך כל אזור לאשר מעבר הצבע טמפרטורה לינארי הרצויה היא הוקמה. הזחלים משתחררים בתוך השטח המסומן ליד האמצע. הזחלים נספרים בתוך כל אחד מהאזורים 2-ס מ. (ד) עמדות כדי לבדוק טמפרטורות (שצוין על-ידי נקודות) ואת אזורי שחרור עבור הזחלים על מעבר הדרגתי דו-כיווניים. מספר שווה של הזחלים משתחררים לאורך הקו האמצעי של חצי אחד של מעבר הצבע דו-כיווניים. המספרים של הזחלים נספרים בכל אחד 10 (2 ס מ) אזורי. סט אחד טיפוסי של טמפרטורות (18 ° C - 26 ° C) על פני השטח agarose מצוינת. (ה) הטמפרטורות נמדד לאורך קווי הגבול, midlines של כל אזור מעבר הדרגתי חד-כיוונית מדגם. נתונים מייצגים טמפרטורות ± SD. n = 8 מבחני (150 ± 50 הזחלים/assay). חלקים של דמות זו משוחזרות מ. Sokabe et al. 8 עם שינויים קלים. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57963/57963fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57963/57963fig3.jpg"> איור 3. נציג תוצאות באמצעות מבחני מעבר חד-כיוונית וכן הדו-כיווניים. (A, B) זאת אומרת באחוזים של הזחלים באזורי 6 במעבר הצבע חד כיווני. הנתונים כוללים 3rd לחלל הזחלים על השעות המוצע לאחר ביצה הנחת (AEL). n = 6-7. קווי השגיאה בהתפלגויות מייצגים ±SEM. (ג) תרמית המנוח-3 מראש טיפוסרואד instar הזחלים של שליטה (w1118) ו trpA1 מוטציות במעבר הצבע חד כיווני. n = 3-4. קווי השגיאה מייצגים ±SEM-(D) הפצות תרמי של הזחלים לחלל מאוחר-3rd של שליטה (w1118) ו PLCβ מוטציות במעבר הצבע חד כיווני. n = 4-6. קווי השגיאה מייצגים ±SEM-(E) הפצה נציג של טיפוס מראש, מאוחר-3rd לחלל הזחלים (w1118) במעבר הצבע דו-כיווניים. אזורי assay ימינה ושמאלה שצוין על-ידי קווים מנוקדים, מופרדים על-ידי האזור לא-לספור במרכז (אזור מוצל). (F) אחוז מראש טיפוס מאוחר-3rd instar הזחלים (w1118) בתוך כל אזור לאורך מעבר הצבע תרמי. הזחלים הונחו בפינה השמאלית ולשחרר הזכות אזורי. אזורי assay מופרדות על ידי אזור לא-לספור 3-ס"מ במרכז וכל ההפצות מחושבות באופן עצמאי. קווי השגיאה מייצגים SEMs. n = 3 מבחני (200-400 הזחלים/assay). חלקים של דמות זו משוחזרות מ. Sokabe et al. 8 עם שינויים קלים. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57963/57963fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שעות AEL</td>
			<td colspan="2">הפרפרים והעשים</td>
		</tr>
<tr>
<td>24</td>
			<td colspan="2">1סנט לחלל</td>
		</tr>
<tr>
<td>48</td>
			<td colspan="2">2nd לחלל</td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td colspan="2">בראשית-3rd לחלל</td>
		</tr>
<tr>
<td>96</td>
			<td colspan="2">אמצע-3rd לחלל</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td colspan="2">לחלל מאוחר-3rd , ממש לפני טיפוס על הבמה</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. הקשר בין השעות לאחר ביצה הנחת (AEL) דרגות זחל.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שינוי טמפרטורה בצלחת agarose (שיפוע)</td>
			<td>טמפרטורות של אמבטיות מים</td>
			<td>טמפרטורות של קוביות אלומיניום</td>
		</tr>
<tr>
<td>10.0-25.0° C (1.5° C/ס מ)</td>
			<td>~6.5-7°C/~28.5°C</td>
			<td>~8.5°C/~26.8°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>18.0-28.0° C (1° C/ס מ)</td>
			<td>~16.8°C/~31.0°C</td>
			<td>~17.8°C/~29.7°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>14.0-34.0° C (2° C/ס מ)</td>
			<td>~10.0°C/~40.0°C</td>
			<td>~11.8°C/~36.8°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>12.5-42.0° C (2.95° C/ס מ)</td>
			<td>~7.0°C/~55.0°C</td>
			<td>~9.4°C/~49.4°C</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 2. בגראדיאנט טיפוסי, הטמפרטורות המתאימות של אמבטיות מים וקוביות אלומיניום למעברי כיוונית יחיד.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שינוי טמפרטורה בצלחת agarose</td>
			<td>טמפרטורות של אמבטיות מים</td>
			<td>טמפרטורות של קוביות אלומיניום</td>
		</tr>
<tr>
<td>22-10-22 ° C (1.5° C/ס מ)</td>
			<td>~5.0°C /~25.0°C</td>
			<td>~7.5°C/~24.0°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>26-18-26 ° C (1° C/ס מ)</td>
			<td>~15.8°C /~30.6°C</td>
			<td>~16.9°C/~28.4°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>30-14-30 ° C (2° C/ס מ)</td>
			<td>~8.5°C /~36.4°C</td>
			<td>~10.9°C/~32.8°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>36-12.5-36 ° C (2.95° C/ס מ)</td>
			<td>~5.0°C /~47.2°C</td>
			<td>~7.9°C/~40.9°C</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 3. מעברי צבע חום טיפוסי, הטמפרטורות המתאימות של אמבטיות מים וקוביות אלומיניום למעברי דו-כיווניים.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>גיל הזחל (AEL)</td>
			<td>זמן assay (כיווני בודד)</td>
			<td>זמן assay (דו-כיווני)</td>
		</tr>
<tr>
<td>h 24 שעות ביממה</td>
			<td>30 דקות</td>
			<td>35 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>48 שעות</td>
			<td>22 דקות</td>
			<td>27 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 h</td>
			<td>16 דקות</td>
			<td>21 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>96 h</td>
			<td>13 דקות</td>
			<td>18 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>120 h</td>
			<td>10 דקות</td>
			<td>15 דקות</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 4. בגילאים שונים זחל (AEL) והשעות assay המתאימים.

Watch this Scientific Journal Video about A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae at JoVE.com

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת הטמפרטורה הסביבתית המועדפת של הזחלים דרוזופילה באמצעות הדרגה תרמי רציפה.

וזמינותו שינוי טמפרטורה כדי לקבוע העדפות תרמי של הזחלים דרוזופילה

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

a-temperature-gradient-assay-to-determine-thermal-preferences

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

7.5K Views.  University of California, Santa Barbara. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת הטמפרטורה הסביבתית המועדפת של הזחלים דרוזופילה באמצעות הדרגה תרמי רציפה.

Video: A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת Nociception תרמי ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; רימה

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time

Temperature is a ubiquitous environmental factor that affects how species distribute and behave. Different species of Drosophila fruit flies have specific responses to changing temperatures according to their physiological tolerance and adaptability. Drosophila flies also possess a temperature sensing system that has become fundamental to understanding the neural basis of temperature processing in ectotherms. We present here a temperature-controlled arena that permits fast and precise temperature changes with temporal and spatial control to explore the response of individual flies to changing temperatures. Individual flies are placed in the arena and exposed to pre-programmed temperature challenges, such as uniform gradual increases in temperature to determine reaction norms or spatially distributed temperatures at the same time to determine preferences. Individuals are automatically tracked, allowing the quantification of speed or location preference. This method can be used to rapidly quantify the response over a large range of temperatures to determine temperature performance curves in Drosophila or other insects of similar size. In addition, it can be used for genetic studies to quantify temperature preferences and reactions of mutants or wild-type flies. This method can help uncover the basis of thermal speciation and adaptation, as well as the neural mechanisms behind temperature processing.

An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time

Here we present a protocol to automatically determine the locomotor performance of Drosophila at changing temperatures using a programmable temperature-controlled arena that produces fast and accurate temperature changes in time and space.

שיטה אוטומטית כדי לקבוע את הביצועים של דרוזופילה בתגובה לשינויים בטמפרטורה בחלל ובזמן

Temperature is a ubiquitous environmental factor that affects how species distribute and behave. Different species of Drosophila fruit flies have specific ...

Behavior

<meta charset="utf8"></head><body>מדידת סבילות לחום בתפוקה גבוהה בדרוזופילה באמצעות מערכות DAM2

Heat Tolerance Assays Using the Drosophila Activity Monitor System: A Guide to an Executable Application for Data Analysis

The study of heat tolerance in&#8239;Drosophila melanogaster has been of particular interest to researchers for decades, with a common approach to assessing heat tolerance being to monitor the time to knockdown (TKD) after exposure to an elevated temperature. Classically, flies are housed in individual vials and placed inside a heated water bath. TKD is then monitored manually by researchers. While very well-established, there remain problems of subjectivity and consistent application of a tangible definition of cessation of all movement, including muscular spasms, when implementing these manual assays. We have developed a high-throughput method for automating heat tolerance assays using the TriKinetics Drosophila Activity Monitors (DAM2). To accompany the DAM2 system, we have written a program and created an easy-use executable to automatically read the last time of movement from the activity data generated. This script then writes to a .csv file the time to heat paralysis (TKD) for each fly. Our data show that this automated DAM2 method is consistent and reliable. Meanwhile, activity profiles created from the activity count data are of interest. These activity profiles can be compiled and have the potential to expand heat tolerance assays to include the relatively unstudied behavioral components of heat tolerance. This protocol will describe in detail how to use the DAM2 system and the HoTDAM! software to estimate heat tolerance in D. melanogaster.

<meta charset="utf8"></head><body>בדיקות עמידות לחום באמצעות מערכת ניטור פעילות דרוזופילה : מדריך ליישום הפעלה לניתוח נתונים

This report describes a method for measuring adult Drosophila melanogaster time to knockdown using a Drosophila Activity Monitor (DAM2) in response to an air conduction heat stressor within an incubator chamber. The DAM2 measures activity by recording individual fly movements as they cross an infrared beam. Data analysis is facilitated by a novel executable file created by the authors.

בדיקות עמידות לחום באמצעות מערכת ניטור פעילות דרוזופילה : מדריך ליישום הפעלה לניתוח נתונים

The study of heat tolerance in&#8239;Drosophila melanogaster has been of particular interest to researchers for decades, with a common approach to ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

עיצוב וניתוח של התנהגות העדפת טמפרטורה והשעון הביולוגי שלה בדרוסופילה

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Biology

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are essential for predicting responses to climate change. This work describes two high-throughput protocols for measuring insect thermal limits: one for assessing critical thermal minima (CTmin), and the other for assessing heat knock down time (KDT) in response to a static heat stressor. In the CTmin assay, individuals are placed in an acrylic-jacketed column, subjected to a decreasing temperature ramp, and counted as they fall from their perches using an infrared sensor. In the heat KDT assay, individuals are contained in a 96 well plate, placed in an incubator set to a stressful, hot temperature, and video recorded to determine the time at which they can no longer remain upright and move. These protocols offer advantages over commonly used techniques. Both assays are low cost and can be completed relatively quickly (~2 h). The CTmin assay reduces experimenter error and can measure a large number of individuals at once. The heat KDT protocol generates a video record of each assay and thus removes experimenter bias and the need to continuously monitor individuals in real time.

Thermal limits can predict the environments organisms tolerate, which is valuable information in the face of rapid climate change. Described here are high-throughput protocols to assess critical thermal minima and heat knockdown time in insects. Both protocols maximize the throughput and minimize the cost of the assays.

תפוקה גבוהה של מגבלות תרמיות קריטיות בחרקים

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are ...

Determining Temperature Preference of Mosquitoes and Other Ectotherms

Most insects and other ectotherms have a relatively narrow optimal temperature window, and deviation from their optima can have significant effects on their fitness, as well as other characteristics. Consequently, many such ectotherms seek out their optimal temperature range. Although temperature preferences of mosquitoes and other insects have been well studied, the traditional experimental setup is performed using a temperature gradient on an aluminum surface in a highly enclosed space. In some cases, this equipment restricts many natural behaviors, such as flying, which may be important in preference selection.
The objective of this study is to observe insect preference for air temperature by using a two-chamber apparatus with sufficient room for flight. The two chambers consist of independent temperature-controlled incubators, each with a large aperture. The incubators are connected by these apertures using a short acrylic bridge. Inside the incubators are two netted cages, linked via the apertures and bridge, allowing the insects to freely fly between the different conditions. The acrylic bridge also acts as a temperature gradient between the two incubators.
Due to the spacious area in the cage and easy construction, this method can be used to study any small ectotherm and/or any manipulation which may alter temperature preference including sensory organ manipulation, diet, gut flora, and endosymbiont presence at biosafety levels 1 or 2 (BSL 1 or 2). Additionally, the apparatus can be used for the study of pathogen infection using further containment (e.g., inside of a biosafety cabinet) at BSL 3.

Insects have an optimal environmental temperature range which they seek to remain within, and many external and internal factors can alter this preference. Here, we describe a cost-effective and simple method to study temperature choice, which allows insects to freely exhibit their natural behaviors.

קביעת העדפת טמפרטורה של יתושים ואקטותרמיות אחרות

Most insects and other ectotherms have a relatively narrow optimal temperature window, and deviation from their optima can have significant effects on ...

וזמינותו שינוי טמפרטורה כדי לקבוע העדפות תרמי של הזחלים דרוזופילה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת Nociception תרמי ב

שיטה אוטומטית כדי לקבוע את הביצועים של דרוזופילה בתגובה לשינויים בטמפרטורה בחלל ובזמן

בדיקות עמידות לחום באמצעות מערכת ניטור פעילות דרוזופילה : מדריך ליישום הפעלה לניתוח נתונים

בדיקות עמידות לחום באמצעות מערכת ניטור פעילות דרוזופילה : מדריך ליישום הפעלה לניתוח נתונים

בדיקות עמידות לחום באמצעות מערכת ניטור פעילות דרוזופילה : מדריך ליישום הפעלה לניתוח נתונים

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב

עיצוב וניתוח של התנהגות העדפת טמפרטורה והשעון הביולוגי שלה בדרוסופילה

מדידה של הזחל פעילות ב

תפוקה גבוהה של מגבלות תרמיות קריטיות בחרקים

קביעת העדפת טמפרטורה של יתושים ואקטותרמיות אחרות