The authors thank M. Gordon of the Queen's University Biomedical Imaging Centre for assistance. This work was supported by operating grants from the Cancer Research Society of Canada (19439) and the Canadian Institutes for Health Research (MOP-142303) (LMM), and by Ontario Graduate Scholarships and studentships from the Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research (SMM, EYL), and by a Craig Jury Summer Studentship (SMM).

<ol>
	<li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+vs.+three-dimensional+in+vitro+tumor+migration+and+invasion+assays.">Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays.</a> Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).</li><li>Albini, A., Noonan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'chemoinvasion'+assay,+25+years+and+still+going+strong:+the+use+of+reconstituted+basement+membranes+to+study+cell+invasion+and+angiogenesis.">The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolds+for+tissue+engineering+and+3D+cell+culture.">Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J Vis Exp. (51), (2011).</li><li>Handschel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+of+micromass+culture+technology+in+tissue+engineering.">Prospects of micromass culture technology in tissue engineering.</a> Head Face Med. 3, 4 (2007).</li><li>Stuckhoff, A. P., DelValle, L., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology. 1078, 119-132 (2013).</li><li>Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylcellulose+protects+the+ability+of+anchorage-dependent+cells+to+adhere+following+isolation+and+holding+in+suspension.">Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension.</a> Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29 (2012).</li><li>Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+of+breast+cancer+cells:+How+to+go+three-dimensional.">Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional.</a> Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Apresenta-se um método rápido e flexível para a produção de esferóides de células 3D para modelar a arquitectura dos tecidos in vivo, utilizando reagentes baratos e amplamente disponíveis. Nosso protocolo explora as propriedades não-citotóxico e de promoção de adesão de MC 8, 9 para mediar a agregação celular e minimizar a formação de monocamada de células. Ao contrário de matrizes à base de proteínas isoladas a partir de fontes animais, MC é inerte, não contém factores de crescimento, e é facilmente removido por lavagem, permitindo o isolamento de esferóides para utilização numa variedade de aplicações, sem a presença de matriz residual. Nosso protocolo utiliza uma rápida agregação de números de células consistentes para gerar esferóides tamanho homogéneo, permitindo comparações directas dos esferóides cultivadas sob diversas condições experimentais. Este método pode ser adaptado para culturas mistas de modelar o crescimento do tumor in vivo, em combinação por um número fixo de vários tipos de células associados ao tumor (por exemplo, f ibroblastos, leucócitos, células estromais) para representar mais exactamente a ambiente tumoral. Modificações das nossas células protocolo utilizando semeadas em concentrações elevadas de MC pode ser feita para monitorar o crescimento independente de ancoragem de células capazes de proliferar em suspensão, e pode ser empregue como um ensaio anoikis (Secção 6) para identificar ou quantificar a transformação celular. Esferóides gerados pelo nosso protocolo são ideais para aplicações tais como o rastreio de fármacos, permitindo a comparação do crescimento celular, metabolismo, a sobrevivência, a invasividade e entre as condições de tratamento. Isolado esferóides também pode ser incorporado em uma matriz extracelular, tais como o colagénio, para avaliar e quantificar a invasividade de células em um 3D-microambiente (Secção 2.2, Figura 4) que mais precisamente em modelos de crescimento de tumor in vivo. Além disso, o protocolo pode ser utilizado para isolar grandes quantidades de esferóides a partir da matriz de MC para a proteína ou preparação de ARN, permitindo users para avaliar de sinal celular ou expressão gênica mudanças em resposta ao tratamento ou de crescimento condições. Nosso protocolo de formação de esferóides requer optimização de soro e concentrações MC, e o número de células semeadas para cada linha celular. características específicas de linha de células, tais como a viabilidade celular, célula-célula e célula-adesividade de plástico, pode afectar significativamente a facilidade com que os esferóides são formados. Em geral, as linhas celulares com falta de viabilidade em cultura de monocamada necessárias concentrações mais elevadas de soro para promover a formação de esferóides, enquanto que as concentrações mais elevadas foram MC preferido para linhas celulares altamente adesivas. Portanto, recomendamos que as titulações de soro e MC ser realizados para determinar as condições ideais para a sobrevivência das células (concentração sérica), minimizando monocamada e formação esferóide por satélite (concentração MC). Estas condições devem resultar na geração de um único esferóide discreta por poço sem satélites. tamanho ideal para esferóideanálise é dependente da aplicação e é afectada pelo número de células semeadas e concentração de soro (Passo 1.4.7). Semeando menos células produz agregados menores que são mais facilmente homogeneamente coradas, mas podem não reproduzir em célula-célula vivo e interações celulares-microambiente. O aumento do número de células semeadas gera esferóides maiores, que podem conter um núcleo hipóxico fisiologicamente representante 10 que podem afectar o comportamento das células e alterar interpretações de ensaios de crescimento ou de sobrevivência. No entanto, quando muito grande, os esferóides podem ser frágeis e são facilmente quebrada ou danificada durante o isolamento. Esferóides maiores também são muito mais difíceis de visualizar sem plataformas de imagem especializadas para corte óptico (por exemplo folha de microscópio de fluorescência de luz) ou por incorporação ou cryosectioning e coloração das secções transversais através do esferóide 11. Recomendamos um tamanho de destino esferóide de 200-500 mm para flexibilidade efacilidade de manuseio para a maioria das aplicações. Em geral, é crítica para optimizar as condições para a formação de esferóides de forma específica tanto da linha de células e específicos de aplicação. protocolos de produção esferóides requerem uma atenção especial para evitar a contaminação de esferóides por poeira e outras partículas. As células aderem a poeira e outros contaminantes insolúveis, resultando em uma forma irregular, vagamente agregados de células aderentes inadequados para utilização em análises (Figura 3A). As fontes de contaminação pode ser minimizado fazendo passar todas as soluções através de um filtro de 0,45 um, enxaguar a monocamada de células com meio de filtrado antes de dissociação (passo 1.4.1), e enxaguar reservatórios pipeta multicanal com água ultrapura filtrada imediatamente antes da utilização (Passo 1.4.6.1). Além disso, pipetas serológicas filtrou-algodão, que podem lançar fibras em soluções, devem ser evitados. Apesar de não ser crítica, a poeira pode ser ainda mais reduzida, passando dissociated células através de um coador de células de 100 um antes da sementeira (Passo 1.4.6). Perda por evaporação do meio é uma consideração técnica adicional, especialmente para tempos de incubação superiores a uma semana, tais como os exigidos por determinadas linhas celulares para a formação de esferóides (Tabela 1) ou durante ensaios anoikis (Secção 6). A evaporação pode ser minimizado por células de sementeira em poços na região do centro de placas de poços múltiplos, enchendo perímetro poços com água ultrapura, e frouxamente selagem dos bordos da chapa ou colocando a placa em uma câmara humidificada. esferóides de células 3D são um modelo válido para o estudo de ambos o comportamento celular normal e de tumor e fisiologia. Nosso protocolo é um método rápido e económico para a produção de esferóides de células 3D tamanho consistente que podem ser usados ​​em uma variedade de ensaios e aplicações. Estes esferóides representam ferramentas valiosas para a caracterização de interações crescimento do tumor e do microambiente, bem como modelos para pravaliação eClinical de novas terapias.

Avaliação biologicamente relevante do comportamento das células tumorais é um desafio utilizando metodologias tradicionais de cultura de células de duas dimensões (2D), em parte porque estes não reflectem adequadamente o microambiente celular encontrado in vivo. Abordagens alternativas que incorporam os componentes da matriz extracelular em cultura (por exemplo, ensaios de câmara de Boyden) são representativos fisiologicamente mais do ambiente de tecido in vivo. No entanto, eles podem ser limitados a avaliação do comportamento de células individuais, e não recapitular o complexo in vivo em combinações de interacções célula-matriz e célula-célula que contribuem para o crescimento de tecido de tumor ou 1, 2, 3. O uso de esferóides multicelulares é uma abordagem recente que reproduz de forma mais precisa a arquitectura compacta de crescimento celular in vivo em 1,4. Os esferóides podem ser utilizados para investigar interacções célula-matriz de células normais, mas também podem actuar como análogos de tumor para modelar as características de progressão tumoral, tais como o crescimento metastático ou resistência a drogas 4. Os esferóides podem ser formados pela proliferação de células individuais embebidas numa matriz de 5, ou mais rapidamente, através da promoção da agregação de várias células de modo a formar um conjunto único de células (por exemplo, gota em suspensão, os métodos de centrifugação) 6, 7. técnicas de agregação de células existentes pode exigir materiais caros ou equipamento especializado. Além disso, estes esferóides possuem uma vasta gama de tamanhos e morfologias e pode ser difícil de produzir em grandes quantidades, tornando a comparação entre condições de crescimento ou tratamentos difíceis. Finalmente, esferóides gerados por estes métodos podem ser difíceis de isolar a partir do extracel proteicolular matriz em que se encontram inseridas para utilização em outras aplicações. Aqui, nós descrevemos um método de agregação celular robusta e facilmente controlável para a rápida formação de esferóides de células dimensionados de forma consistente utilizando placas disponíveis comercialmente de fundo em U de células-repelente e uma matriz de promoção de adesão inerte, celulose de metilo. Uma vez formados, estes esferóides multicelulares são prontamente isolados para utilização numa vasta gama de aplicações. O protocolo também é facilmente adaptada para gerar esferóides através da proliferação de células, o que pode ser utilizado para avaliar outros processos celulares. Aqui, mostramos ensaios de invasão celular, quantificados pela técnica de imunofluorescência, e um ensaio anoikis, como exemplos de aplicações destes dois protocolos de formação esferóide diferentes.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate buffered saline</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>Used for PBS&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; wash buffer; Do not autoclave PBS&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; wash buffer upon addition of calcium chloride</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Used for PBS&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; wash buffer; Do not autoclave PBS&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; wash buffer upon addition of magnesium chloride</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;For Spheroid Formation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well U-bottom Cell-Repellent Plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td>For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines</td></tr><tr><td>F12K Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2112722</td><td>For culturing TT cell line</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td>Filter prior to use to remove particulate contaminants</td></tr><tr><td>Methyl cellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td>Prepare in water to 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605028</td><td>Dissociation buffer</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;For Invasion Assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Type I Collagen</td><td>Corning Incorporated</td><td>354231</td><td>Stock 3.1 mg/mL; Maintain on ice when in use</td></tr><tr><td>DMEM Phenol Red Free Low Glucose&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054-20</td><td>Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium</td></tr><tr><td>Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Chemoattractant</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;For Immunofluorescence Microscopy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Coverglass</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72225-01</td><td>For mounting excised spheroids</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Used to stain actin at 1:200</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>ALB001</td><td>Used in BSA blocking buffer</td></tr><tr><td>Dabco 33-LV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>290734</td><td>Antifade</td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>GLY001</td><td>Used in MOWIOL mounting medium</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>Freeware, NIH</td><td>-</td><td>Used for image analysis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microslides</td><td>VWR International</td><td>48312-024</td><td>For mounting excised spheroids</td></tr><tr><td>MOWIOL 4-88</td><td>EMD-Millipore</td><td>475904</td><td>Used in MOWIOL mounting medium</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>EMD-Millipore</td><td>PX0055-3</td><td>Used in fixation buffer</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>TRX777</td><td>Used in permeabilization buffer</td></tr></tbody></table>

an efficient and flexible cell aggregation method for 3d spheroid production

Cultura de células em monocamada não modelar adequadamente o comportamento in vivo de tecidos, que envolve complexas interacções célula-célula e célula-matriz. Tridimensionais técnicas de cultura de células (3D) são uma inovação recente desenvolvido para resolver as deficiências da cultura de células aderentes. Embora várias técnicas para a produção de análogos de tecidos in vitro, têm sido desenvolvidos, estes métodos são muitas vezes complexos, caros para estabelecer, requer equipamento especializado, e são geralmente limitados pela compatibilidade com apenas certos tipos de células. Aqui, nós descrevemos um protocolo rápido e flexível para a agregação de células em esferóides multicelulares 3D de tamanho consistente, que é compatível com o crescimento de uma variedade de linhas celulares tumorais e normais. Nós utilizamos concentrações variáveis ​​de soro e metil celulose (MC) para promover a geração de esferóide independente de ancoragem e prevenir a formação de monocamadas de células de um modo altamente reprodutível. As condições óptimas para indivlinhas celulares idual pode ser conseguido ajustando MC ou concentrações de soro no meio de formação de esferóides. Os esferóides 3D gerados pode ser recolhido para uso em uma grande variedade de aplicações, incluindo a sinalização celular ou estudos de expressão de genes, o rastreio de fármacos candidato, ou no estudo de processos celulares, tais como invasão celular tumoral e a migração. O protocolo também é facilmente adaptada para gerar esferóides clonais de células isoladas, e podem ser adaptados para avaliar o crescimento independente de ancoragem e anoikis-resistência. Em geral, o nosso protocolo fornece um método facilmente modificável para a geração e utilização de esferóides de células 3D, a fim de recapitular o microambiente 3D de tecidos e modelar o crescimento in vivo de células normais e tumorais.

Nós descrevemos um método flexível e eficiente para gerar esferóides discretos utilizando placas de células-repelentes e meios de formação de esferóides suplementadas com MC. Sob as condições apropriadas de MC e de soro, as células individuais assentar e aderir em conjunto no centro do poço para formar esferóides com adesão mínima para o fundo do poço. Usando este protocolo, esferóides foram gerados a partir de uma variedade de linhas celulares (Figura 2B). Titulação de MC e as concentrações séricas é requerida para cada linha de células para identificar as condições óptimas em que apenas um único esferóide é formado que seja robusto o suficiente para permitir a manipulação, sem fragmentação. Optimamente, os esferóides tinham entre 200 a 500 um de diâmetro, e consistia de células firmemente aderentes com restos de células mínima. Esferóides sobreviveram manuseamento suave, sem danos, o que lhes permite ser recolhido e utilizado em uma ampla variedade de ensaios. (Figura 3A), o que resultou em agregados de células mortas. Na presença de poeira ou outros contaminantes de fibra, múltiplos ou grupos de células de formato irregular que foram apenas fracamente agregados formados, e os esferóides resultantes facilmente se separaram quando manuseado. Formação esferóide também foi afetada pelas concentrações sub-óptimas de MC ou soro no meio de formação esferóide (Figura 3B). Nos nossos testes, muitas linhas de células foram capazes de aderir às placas células-repelentes, na ausência, ou em concentrações baixas, da MC, e resultou na formação de um esferóide rodeado por uma monocamada de células (Figura 3B-II). crescimento celular BxPC-3 em condições sub-óptimas MC é mostrado como um exemplo. Em geral, concentrações mais elevadas de células MC impedida de aderir à bem, mas uma concentração demasiado elevada de MC reduzida adesão célula-célula, e as células impedidos dedeposite no fundo do poço, resultando na formação de agregados soltos e numerosos esferóides de satélite (Figura 3B-I). A concentração de soro também afectada a sobrevivência da célula, e célula-célula e adesão célula-plástico e necessário para ser optimizada para diferentes linhas de células. Para as linhas de células, tais como HCT-116 e PANC-1, uma concentração demasiado elevada de soro resultou em proliferação celular excessiva e produção de esferóides de grandes dimensões que foram facilmente danificadas por manuseio, ou promovidos adesão celular ao poço de plástico e a formação de uma monocamada ( A Figura 3B-III). Curiosamente, os efeitos de soro insuficiente diferiram entre linhas celulares. a sobrevivência das células HCT-116 foi reduzida e os esferóides formadas eram pequenos, contendo uma grande proporção de células mortas em baixa soro. Em contraste, as células PANC-1 eram viáveis na ausência de soro, mas tornou-se mais aderentes, e formaram agregados múltiplos, bem como uma monocamada de células (Figura 3B-IV, V). <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Em ensaios de invasão, esferóides pré-formados foram novamente suspensas em colágeno neutralizado para gerar uma matriz rígida extracelular (Seção 2.2, Figura 4). A subsequente adição de um quimioatractivas induzida células individuais para se mover para fora a partir do esferóide e invadir a matriz circundante (Figura 4B). O número de células invasoras e invadido distância pode ser quantificada por meio de microscopia de campo claro, ou por microscopia de fluorescência na presença de uma mancha de células vivas, tais como DAPI ou calceína AM (secções 3, 4). Nos nossos testes, alterações morfológicas, tais como a formação de saliências, eram visíveis dentro de 6 h de tratamento com quimioatractor, e numerosas células poderia ser observado completamente solte do esferóide e invadir no colagénio dentro de 18 a 48 h. Para as nossas experiências, verificou-se que 12 a 18 h de invasão foi ideal, como tempos de incubação mais longos resultou em células movendo muito longe doesferóides para imagiologia óptima. Esferóides incorporado com colagénio fixos poderiam ser trabalhada por campo claro, para quantificar a distância e o número de células invasoras, ou microscopia de imunofluorescência (secções 3-5), para a visualização de estruturas invasoras formadas pelas células (Figuras 5b, 5c). Uma modificação do protocolo de formação de esferóides descrito, em que as células individuais são suspensas numa concentração mais elevada de MC (30 mg / mL) pode ser utilizado para monitorizar a resistência anoikis. A estas concentrações MC, forma ainda pode ser transferido com uma pipeta, enquanto fresco, mas engrossado num gel sólido a 37 ° C. Anoikis células resistentes ressuspensas neste meio permaneceram em suspensão e proliferaram ao longo de um período de 2-4 semanas, formando esferóides suspensão de tamanhos variados (Figura 6B). As células dependentes de ancoragem, não formar esferóides sob estas condições. Fomos capazes de quantificar anoikis resistência através da contagem do dormenteer de esferóides formada em cada poço. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig1.jpg" /> Figura 1: Visão geral do 3D Spheroid Formação Protocolo. As células cultivadas em cultura em monocamada são dissociados, contadas, sedimentadas e ressuspensas em meio de formação de esferóides suplementado com metilcelulose (MC) e soro (i-iv). A suspensão é semeada numa placa de células-repelente de fundo em U a densidade desejada para permitir a formação de esferóides do tamanho desejado (v), e a placa é incubada para produzir um único esferóide de células discreta em cada poço (VI). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig2.jpg" /> Figura 2: Optimized Spheroid Formação Condições.(A) a formação esferóide em condições ideais para células SH-SY5Y. 1.000 células semeadas em placas de alvéolos repelente de fundo em U, em meio suplementado com soro a 5% e 1 mg / mL de MC agregados em esferóides compactos dentro de 24 h. (B) Imagens representativas de esferóides formadas por várias linhas de células sob condições ideais mostrados na Tabela 1. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig3.jpg" /> Figura 3: Formação esferoidal Sob condições menos favoráveis. Os esferóides (A) formado na presença de contaminantes. contaminação microbiana resultou na morte celular e esferóides frouxamente agregadas. Na presença de contaminantes insolúveis, tais como poeiras ou fibras, as células aderiram a estes materiais e não AGGREGcomeu. (B) a formação esferóide em meio de formação esferóide abaixo do ideal. BxPC-3 de células semeadas na presença de MC excesso (10 mg / mL) formado numerosas esferóides satélite (I), enquanto insuficiente MC (0 mg / ml) resultou em agregados de células que aderiram ao cavidades de fundo e formaram uma monocamada (ii ). Foram observados resultados semelhantes para outras linhas de células testadas (não mostrado). O excesso de soro (20%) resultou num aumento da proliferação celular e formação de monocamada de HCT-116 (iii). Insuficiente soro (0%) tinha efeitos específicos de linha de células que vão desde a morte celular em HCT-116 (iv) para a formação de esferóides por satélite em PANC-1 (v). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig4.jpg" /> Figura 4: Invasion ensaio utilizando Spheroids. (A) Overview de ensaio de invasão esferóide. O vaso de formação de imagens é pré-revestido com uma camada de colagénio neutralizado e incubada para polimerizar o colagénio (I-II). esferóides pré-formados são recolhidos em tubos de 1,5 ml e ressuspenso em colagénio neutralizado (III-VI). A mistura esferóide-colágeno é sobreposto na base da camada de colágeno e incubadas para polimerizar o colagénio (vii-viii). O meio de crescimento contendo compostos desejados é então revestida sobre a camada de esferóides por colagénio polimerizado e incubada para permitir a invasão de células (IX-X). (B) na presença de um quimioatractor, as células são mostrados invadindo na matriz de colagénio em torno de um incorporado PANC-1 esferóide nos pontos de tempo indicados. Cada painel mostra uma imagem de contraste de fase obtidas utilizando uma objetiva de 10X. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig5.jpg" /> Figura 5: Coloração por imunofluorescência de esferóides colagénio-incorporados. (A) Visão de protocolo para imunofluorescência de esferóides. esferóides embutidos são lavadas, fixadas (NBF), e bloqueados (BSA) directamente no vaso de imagiologia. Os esferóides podem ser marcadas directamente, ou cortado e corado num volume mais pequeno, tal como um tubo de 1,5 mL. Esferóides deverá ser lavado com tampão de excesso após cada mancha para minimizar a fluorescência de fundo. esferóides manchadas podem ser visualizados diretamente no vaso ou montado sob uma lamela para geração de imagens e armazenamento. Imagens (B) de imunofluorescência de um esferóide de células TPC-1 incorporados em colagénio e deixou-se invadir durante 24 h. (C) Imagens mostrando células phalloidin manchado típico de regiões indicadas no B. Cada painel mostra um 20 um Z-projeção (0,2 mm passos) adquiridos utilizando um objetivo 60X: Células dentro do esferóide bOdy cerca de 20 um a partir da superfície (1), salientes em células de colagénio (2), e células invasoras através de colagénio (3). Barras de escala = 25 uM. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig6.jpg" /> Figura 6: Formação esferoidal anoikis Ensaio. (A) Visão de protocolo para o ensaio anoikis. As células são preparadas como descrito na Figura 1, mas são ressuspensas em meio de formação de esferóides contendo um mínimo de 30 mg / ml de CM, que forma uma camada de espessura para manter as células individuais em suspensão e prevenir a agregação das células (I-II). A suspensão de células é semeada em placas de alvéolos repelente de fundo em U e foram incubadas (iii-iv). As células em suspensão pode ser monitorizada quanto à formação de esferóides por proliferação, indicando resistência anoikis. ( <strong&gt; B) Imagens representativas da formação de colónias durante ensaio anoikis. células TPC-1 foram mantidas em suspensão com 30 mg / mL de MC e fotografada nos pontos de tempo indicados. As células que são capazes de resistir a anoikis proliferam para formar esferóides. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Linha celular </td><td> MC (mg / ml) </td><td> Serum (%) </td><td> incubação aproximado Tempo </td></tr><tr><td> SH-SY5Y </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 24 horas </td></tr><tr><td> BxPC-3 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 a 5 dias </td></tr><tr><td> PANC-1 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 a 7 dias </td></tr><tr><td> HCT-116 </td><td> 3</td><td> 10 </td><td> 2 a 4 dias </td></tr><tr><td> TT </td><td> 1 </td><td> 10 </td><td> 7 a 10 dias </td></tr><tr><td> TPC-1 </td><td> 3 </td><td> 5 </td><td> 1 a 2 dias </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Optimal Formação Spheroid composição do meio e incubação Times por Linhas de célula validada.

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An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

Um Método celular agregação eficiente e flexível para 3D Spheroid Produção

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

an-efficient-flexible-cell-aggregation-method-for-3d-spheroid

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K visualizações.  Queen's University Cancer Research Institute. Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions. 

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A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Bioengenharia

Generation of Tissue Spheroids via a 3D Printed Stamp-Like Device

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have more realistic biological responses that resemble the in vivo environment. Due to their advantages, tissue spheroids represent an emerging trend toward superior, more reliable, and more predictive study models with a broad range of biotechnological applicability. However, reproducible platforms that can achieve large-scale production of tissue spheroids have become an unmet need in fully exploring and boosting their potential. Herein, the large-scale production of homogeneous tissue spheroids is reported using a low-cost and time-effective methodology. A 3D printed stamp-like device is developed to generate up to 4,716 spheroids per 6-well plate. The device is fabricated by the stereolithography method using a photocurable resin. The final device is composed of cylindrical micropins, with a height of 1.3 mm and a width of 650 &#181;m. This approach allows the fast generation of homogeneous spheroids and co-cultured spheroids with uniform shape and size and &gt;95% cell viability. Moreover, the stamp-like device is tunable for different sizes of well plates and Petri dishes. It is easily sterilized and can be reused for long periods. The efficient large-scale production of homogeneous tissue spheroids is essential to leverage their translation for multiple areas of industry, such as tissue engineering, drug development, disease modeling, and on-demand personalized medicine.

<meta charset="utf8"></head><body>Geração de esferoides de tecido por meio de um dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D

The present protocol describes a technique to produce tissue spheroids on a large scale cost-effectively using a 3D printed stamp-like device.

Geração de esferoides de tecido por meio de um dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have ...

Bioquímica

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell cultures. The clinostat mimics an environment where cells can assemble as highly reproducible spheroids with low shear forces and active nutrient diffusion. We demonstrate that both cancer and non-cancer hepatocytes (HepG2/C3A and THLE-3 cell lines) require 3 weeks of growth prior to achieving functionalities comparable to liver cells. This protocol highlights the convenience of utilizing incubators for 3D cells with cameras monitoring the cell growth, as snapshots can be taken to count and measure spheroids upon treatment. We describe the comparison of THLE-3 and HepG2/C3A cell lines, showing how non-cancerous cell lines can be grown as well as immortalized cancer cells. We demonstrate and illustrate how proteomics experiments can be conducted from a few spheroids, which can be collected without perturbing cell signaling, i.e., no trypsinization required. We show that proteomics analysis can be used to monitor the typical liver phenotype of respiratory chain metabolism and the production of proteins involved in metal detoxification and describe a semi-automated system to count and measure the spheroid's area. Altogether, the protocol presents a toolbox that comprises a phenotypic characterization via image capture and a proteomics pipeline to experiment on 3D cell culture models.

We present a protocol for growing high-reproducible spheroids and their phenotypic characterization using image capture and proteomics.

Análise Fenotípica Semi-Automatizada de Culturas Funcionais de Células Esferoides 3D

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the living body than two-dimensional cell culture. In this study, we fabricated an electrical motor-driven lab-on-a-CD (compact disc) platform, called a centrifugal microfluidic-based spheroid (CMS) culture system, to create three-dimensional (3D) cell spheroids implementing high centrifugal force. This device can vary rotation speeds to generate gravity conditions from 1 x g to 521 x g. The CMS system is 6 cm in diameter, has one hundred 400 &#956;m microwells, and is made by molding with polydimethylsiloxane in a polycarbonate mold premade by a computer numerical control machine. A barrier wall at the channel entrance of the CMS system uses centrifugal force to spread cells evenly inside the chip. At the end of the channel, there is a slide region that allows the cells to enter the microwells. As a demonstration, spheroids were generated by monoculture and coculture of human adipose-derived stem cells and human lung fibroblasts under high gravity conditions using the system. The CMS system used a simple operation scheme to produce coculture spheroids of various structures of concentric, Janus, and sandwich. The CMS system will be useful in cell biology and tissue engineering studies that require spheroids and organoid culture of single or multiple cell types.

We present a motor-powered centrifugal microfluidic device that can cultivate cell spheroids. Using this device, spheroids of single or multiple cell types could be easily cocultured under high gravity conditions.

Plataforma lab-on-a-CD para geração de esferóides tridimensionais multicelulares

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Produção automatizada em larga escala de esferoides de células-tronco derivados de adiposo para bioimpressão 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Geração escalável de esferoides de células uniformes usando um dispositivo de montagem acústica 3D

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method for manufacturing high-quality and high-throughput cell spheroids using a 3D acoustic assembly device through maneuverable procedures. The acoustic assembly device consists of three lead zirconate titanate (PZT) transducers, each arranged in the X/Y/Z plane of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber. This configuration enables the generation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) when three signals are applied. As a result, cells in the gelatin methacryloyl (GelMA) solution can be driven to the LANs, forming uniform cell aggregates in three dimensions. The GelMA solution is then UV-photocured and crosslinked to serve as a scaffold that supports the growth of cell aggregates. Finally, masses of matured spheroids are obtained and retrieved by subsequently dissolving the GelMA scaffolds under mild conditions. The proposed new 3D acoustic cell assembly device will enable the scale-up fabrication of cell spheroids, and even organoids, offering great potential technology in the biological field.

Autor em destaque: Desenvolvimento de um método de montagem acústica sem andaimes para cultura de esferóides de células 3D de alta qualidade 

Cell spheroids have been considered one potential model in the field of biological applications. This article describes protocols for scalably generating cell spheroids using a 3D acoustic assembly device, which provides an efficient method for the robust and rapid fabrication of uniform cell spheroids.

Dispositivo de Montagem Acústica Tridimensional para Fabricação em Massa de Células Esferoides

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...

Formação de esferoides multicelulares para análise metabólica e de hipóxia baseada em FLIM

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

Autor em destaque: Padronizando métodos de formação de esferóides para análise metabólica e de oxigenação usando microscopia de imagem de fluorescência

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

Um Método celular agregação eficiente e flexível para 3D Spheroid Produção

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Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

Geração de esferoides de tecido por meio de um dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D

Geração de esferoides de tecido por meio de um dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D

Análise Fenotípica Semi-Automatizada de Culturas Funcionais de Células Esferoides 3D

Plataforma lab-on-a-CD para geração de esferóides tridimensionais multicelulares

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Dispositivo de Montagem Acústica Tridimensional para Fabricação em Massa de Células Esferoides

Dispositivo de Montagem Acústica Tridimensional para Fabricação em Massa de Células Esferoides

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