Name: dissection, microct scanning and morphometric analyses of the baculum
Uploaded: 2017-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
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Tim Daley e Andrew Smith forneceu muitas discussões computacionais úteis durante os primeiros dias; Tim Daley escreveu o rotate_translate_cylindrical programa necessário para o protocolo 5. recursos computacionais foram fornecidos pelo High Performance Cluster Computing na Universidade do Sul da Califórnia. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder # GM098536 (MDD).

Todos os procedimentos e pessoal foram aprovados pela universidade do instituto do sul da Califórnia para Animal Care e do Comitê Use (IACUC), protocolo nº 11394. 1. Baculum Dissecção e Preparação <ol><li> Euthanize um rato macho sexualmente maduros através de dióxido de carbono sobre-exposição, de acordo com protocolos estabelecidos pelo Comité pertinente Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC). </li><li> Coloque o animal em decúbito dorsal, e prolongar o pénis através da aplicação de pressão com os polegares lateralmente à abertura do prepúcio. </li><li> Uma vez que o pénis é prolongada, alargar o tecido através do prepúcio, tanto quanto possível. </li><li> Com uma tesoura, corte o proximal do corpo do pénis à glande do pénis onde o baculum reside. </li><li> Transfira os pénis dissecados para um tubo de 1,7 ml e adicionar 200 mL de água da torneira. Certifique-se de que o pênis está totalmente submersa no líquido. </li><li> Incubar o tecido em água a ~ 50 ° C durante 3-5 dias. </li><li&gt; Após incubação adequada, remova o tecido circundante do báculo, usando uma pinça sob um microscópio de dissecação. Gentilmente esguichar 70% de etanol para empurrar restante tecido e limpar o osso. </li><li> Colocar o báculo dissecados para um novo tubo de microcentrifugação com a tampa aberta. Deixe tampão aberto O / N a secar óssea. </li></ol> Digitalização 2. MicroCT <ol><li> Pressione um suporte cilíndrico digitalização microCT em um tijolo de espuma de florista para criar um cilindro de espuma de florista. </li><li> Extraia o cilindro de espuma de florista e cortar fatias ~ 2-5 cm de espessura. </li><li> Empurrar bacula seca na espuma florista, em torno da periferia de uma fatia individual a minimizar a interferência durante a verificação. A orientação precisa dos ossos deve ser comentou permitindo a identificação adequada das amostras individuais no Protocolo 4. </li><li> Delicadamente, coloque a fatia com os ossos incorporados no suporte para microCT. </li><li> Adquirir scans microCT. No caso de bacula rato 14 </sup&gt;, Foi utilizado um scanner uCT50 (Scanco Medical AG, Bruttisellen, Suíça) na USC Molecular Imaging Center sob as seguintes configurações: 90 kVp, 155 mA, 0,5 filtro mm Al, 750 projecções por 180 (cobertura de 360), tempo de exposição de 500 ms e tamanho voxel de 15,5 mm. </li></ol> 3. Processamento MicroCT: Convertendo um Stack .dcm para um arquivo .xyz Individual NOTA: Cada varredura microCT produz uma pilha de .dcm, ou &quot;DICOM&quot;, arquivos que representam fatias de imagem obtidos através do objeto. Toda a geometria computacional jusante requer arquivos .xyz planas, que é simplesmente um arquivo de texto que contém quatro colunas - X, Y e Z coordenadas de cada pixel, e a intensidade do pixel, que vão desde -5000 (preto) para 5000 (branco). Um limiar do pixel acima de 3.000 geralmente funciona bem como um limiar para a definição de ossos. <ol><li> Instalar Python (www.python.org) e os módulos Python COMANDOS, DICOM, Pylab, SYS e Numpy. </li><li> Open &quot;01_process_dicom.py &quot;{} Figshare com qualquer editor de texto. Na seção Variáveis, caminho de mudança, limites de pixels, e nomes de diretórios, conforme necessário. </li><li> Execute &quot;01_process_dicom.py python&quot;. Progress será impresso para a tela. Dentro de cada diretório nomeado na etapa 3.2, um novo arquivo é chamado; por exemplo, directory_name.PT3000.xyz, onde PT3000 indica o limiar do pixel indicado no passo 3.2. </li></ol> 4. Processamento MicroCT: Segmentando-out individual Specimen .xyz Arquivos <ol><li> Instale R (https://www.r-project.org/) com o RGL biblioteca. </li><li> Abra o arquivo &#39;02_segment_dicoms.r&#39; {} Figshare com qualquer editor de texto. Na seção Variáveis, mudar o nome do caminho para apontar para o arquivo .xyz criado no Protocolo n.º 3 acima. </li><li> De dentro R, execute a &quot;fonte ( &#39;02_segment_dicoms.r&#39;)&quot; comando (sem as aspas). </li><li> Após a imagem tridimensional do .xyz criado no Protocolo n.º 3 aparecer, digite o number de espécimes no arquivo geral .xyz. Em seguida, rotular e selecionar os pontos de cada amostra, utilizando as funções de rolagem e zoom. NOTA: No fundo, arquivos .xyz separadas será feita para cada espécime. Estes aparecem em um diretório chamado, por exemplo, XYZ_FILES_PT3000, onde PT3000 indica o limite de pixel usado. </li></ol> 5. &quot;Alinhar&quot; Specimen .xyz arquivos para Coordenadas Comum. <ol><li> Abra o script &quot;03_transform.py&quot; Python {Figshare}, que exige a mattdean_modules.py adicional módulo {Figshare}, bem como duas aplicações autónomas: &quot;rotate_translate_cylindrical&quot; (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) e &quot;qconvex&quot; (www.qhull.org/html/qconvex.htm) que são usados ​​por este script. </li><li> Na seção Variáveis, identificar os nomes caminho completo para mattdean_modules.py, rotate_path e qconvex_dir. Além disso, identificar o caminho completo para o diretório que contém o .xy indivíduoarquivos z criou na etapa 4. </li><li> 03_transform.py executado, o que cria um novo arquivo por espécime com o sufixo .TRANSFORMED.xyz. </li></ol> 6. &quot;fatiamento&quot; Specimen Alinhados .xyz Arquivos identificar Semi-marcos. <ol><li> Abrir e executar o script Python &quot;04_identify_landmarks.py&quot; {} Figshare. Na seção Variáveis, identificar nomes de caminho completo para o diretório que contém os arquivos .TRANSFORMED.xyz. Este script identifica 802 semi pontos de referência que pode ser usado para quantificar o tamanho e forma da estrutura. </li></ol>

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	<li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrics+morphometrics.">Geometrics morphometrics.</a> Annu. Rev. Anthropol. 36, 261-281 (2007).</li><li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern morphometrics in physical anthropology. 6, (2005).</li><li>Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

As etapas críticas do protocolo acima são: 1) dissecar o bacula, 2) coleta as imagens microCT, 3) converter a saída microCT para um arquivo plano de coordenadas XYZ, 4) segmentar a nuvem de pontos de cada espécime, 5) transformar cada amostra para um padronizado sistema de coordenadas, e 6) que define semi-marcos. Estes passos são facilmente modificado para acomodar diferentes objectos. Estes métodos podem provavelmente ser aplicado a qualquer objecto que, pelo menos, não é, essencialmente &quot;haste em forma de&quot;, ou demasiado curvada. Objetos que curva sobre si mesmas para se tornar &quot;em forma de u&quot; não pode ser actualmente analisados, pois cortando (Figura 1G) retornaria pontos de diferentes partes do objeto. Tais objetos podem ser acomodados no futuro, computacionalmente endireitar o objeto antes de cortar. Nós apresentamos um método geral para matematicamente definidoras semi-marcos a partir de formas que não possuem smarcos Olid. Estes métodos gerais foram modificados para estudar a evolução de ossos pélvicos e de nervura baleia 16, que têm formas muito diferentes. Nossos métodos computacionais para marcos que definem deve ser aplicável a qualquer série de coordenadas XYZ. Nós empregamos digitalização microCT aqui, dada a pequena dimensão da bacula rato 14. Para ossos maiores, tais como os ossos pélvicos e de nervura de baleia, que empregue um scanner a laser que reconstruída a superfície dos ossos 16. É importante para inspeccionar visualmente todos os conjuntos de semi-marcos para verificar a qualidade do método. A principal vantagem dos nossos métodos computacionais é que eles precisamente quantificar o tamanho ea forma variação, e preservar a correspondência entre regiões distintas do objeto.

O campo de morfometria inclui uma diversidade de métodos para quantificar o tamanho e a forma da forma biológica, uma etapa fundamental na investigação científica 1, 2, 3, 4, 5, 6. Tradicionalmente, a análise estatística de tamanho e forma começa pela identificação de pontos de referência em uma estrutura biológica, e depois medir distâncias lineares, ângulos e proporções, que podem ser analisadas num quadro multivariada. -Marco com base geométrica Morfometria é uma abordagem que mantém a posição espacial de pontos, preservando informações geométricas de coleta de dados por meio de análise e visualização 5. Análise Procrustes Generalizada (GPA) pode ser aplicada para remover a variação na localização, dimensão e rotação dos pontos de referência para produzir um alinhamento entre amostras que a Minimizes suas diferenças ao quadrado - o que resta é a forma dissimilaridade 7. Um conceito importante de qualquer análise morfométrica é homologia, ou a ideia de que se pode identificar com segurança marcos representando características biologicamente significativas e discretas que correspondem entre amostras ou estruturas. Por exemplo, crânios humanos têm processos homólogos, forame, suturas, e dutos que podem permitir análises morfométricas. Infelizmente, a identificação de pontos de referência correspondente é difícil em muitas estruturas biológicas, especialmente aqueles com superfícies lisas ou curvas 8, 9, 10. Nós abordar este problema a seguir utilizando geometria computacional. O fluxo geral é para gerar uma análise tridimensional do objecto que pode ser representada como uma nuvem de pontos, e em seguida rodar e que transformar nuvem de pontos de modo a que todos specimens são orientados em um sistema de coordenadas comum. Então nós definimos matematicamente semi-marcos de regiões específicas do objeto. Discretas semi pontos de referência colocadas em tais regiões são biologicamente arbitrário 11. Realização GPA e as análises estatísticas subsequentes podem produzir artefatos indesejáveis 8, 12, porque os marcos colocados arbitrariamente pode não ser biologicamente homóloga. Portanto, permitimos que estas meias-marcos para matematicamente &quot;slides&quot;. Este procedimento minimiza a diferença de potencial entre as estruturas. Como argumentei o algoritmo de correr aqui utilizada é apropriada para quantificar regiões anatômicas semelhantes faltam facilmente identificados marcos 3, 6, 8, 10, 11, 12 correspondente. Esses métodos têm o seu limitations 13, mas deve ser adaptável para objectos de tamanho e forma diferentes. Aqui, nós ilustrar como este método foi aplicado em um estudo recente da baculum rato 14, um osso no pênis que tem sido ganhou e perdeu várias vezes independentes durante a evolução dos mamíferos 15. Discute-se a dissecção e preparação de um osso específico, o báculo (Protocolo 1), a geração de imagens microCT (protocolo 2), ea conversão destas imagens para um formato que permite que toda a geometria computacional jusante (Protocolos 3 e 4). Após estas etapas, cada amostra é representado por ~ 100K xyz coordenadas. Em seguida, a pé através de uma série de transformações que efetivamente alinhar todas as amostras em uma orientação comum (Protocolo 5), em seguida, definir semi-marcos de espécimes alinhados (Protocolo 6). Protocolos 1-4 deve ser semelhante, independentemente do objeto analisado. O protocolo nº 5 e Protocolo 6 são specamente projetado para um báculo, mas é nossa esperança que, detalhando estes passos, os investigadores podem imaginar modificações que seriam relevantes para o seu objeto de interesse. Por exemplo, foram aplicadas modificações destes métodos para estudar ossos pélvicos baleia e costelas 16.

<table><tbody><tr><td>Dissecting scissors</td><td>VWR</td><td>470106-338</td><td>Most sizes should work</td></tr><tr><td>Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved</td><td>VWR</td><td>82027-406</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 64-17-5</td><td>To be diluted to 70% for dissections</td></tr><tr><td>Floral Foam</td><td>Wholesale Floral</td><td>6002-48-07</td><td></td></tr><tr><td>uCT50 scanner&amp;nbsp;</td><td>Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection, microct scanning and morphometric analyses of the baculum

morfometria modernos fornece métodos poderosos para quantificar o tamanho e forma variação. Um requisito básico é uma lista de coordenadas que definem marcos; no entanto, tais coordenadas devem representar estruturas homólogas em toda espécimes. Enquanto muitos objetos biológicos consistem de marcos facilmente identificadas para satisfazer a hipótese de homologia, muitos não têm tais estruturas. Uma possível solução é matematicamente lugar semi-marcos em um objeto que representam a mesma região morfológica através de espécimes. Aqui, nós ilustrar um gasoduto recentemente desenvolvido para definir matematicamente semi-marcos do rato baculum (osso do pênis). Os nossos métodos deve ser aplicável a uma vasta gama de objectos.

As coordenadas xyz das meias-marcos produzidos no Protocolo 6 pode ser diretamente importado para qualquer morfometria geométrica análise baseada no marco 17. O oleoduto computacional supra foi aplicado para estudar bacula rato 14, bem como pélvica baleia e as costelas 16. Mais detalhes sobre a definição computacional de semi-marcos são apresentados aqui, em uma tentativa de ajudar os pesquisadores a visualizar passos que podem ser modificados para acomodar o seu objeto de interesse particular. O baculum contém várias características únicas que foram exploradas para automatizar certas transformações. Por exemplo, depois de cortar o osso computacionalmente em duas metades ao longo de um eixo proximal-distal, identificou-se a metade proximal simplesmente comparando o número total de pontos (proximal tem mais). Enquanto existem características únicas, como este, os nossos métodos deve ser adaptável a qualquerobjeto. Além disso, deve-se enfatizar que determinada empiricamente determinados limites, como &quot;10% proximal&quot;, que teve um bom desempenho em nossos estudos baculum, mas certamente precisa ser reavaliada para outros objetos. Começando no protocolo 5, o primeiro passo é computacional para calcular o casco convexo (o menor conjunto de pontos que contém todos os outros pontos de amostra) para identificar os dois pontos que se encontram mais afastados um do outro. Estes dois pontos (esferas vermelho, Figura 1C) começam a definir um novo eixo z (linha vermelha, Figura 1C) que corre proximal-distal através do osso. No caso de o báculo, a metade do ponto de nuvem que contém mais pontos é definida como a extremidade proximal. Em segundo lugar, toda a nuvem de pontos é transformada de modo a que o ponto proximal assume o x, y, z coordenadas de 0,0,0 e o ponto distai tflocos de X, Y, Z do 0,0, + Z, onde Z + é um pouco dependente do tamanho do osso positivo valor. No final deste passo, um eixo z passa através do comprimento do osso. Para os procedimentos abaixo, o comprimento desde o mínimo para coordenadas z máximos será referido como Zlength. Em terceiro lugar, para corrigir para a variância associada com a colocação exacta dos pontos proximais e distais identificados acima, a 10% mais proximal e 10% de pontos mais distais são recolhidos separadamente (Figura 1D), os seus respectivos centroides identificado (esferas vermelho, Figura 1E) e o ponto de nuvem transformada de tal modo que o centróide é 0,0,0 proximal e distal do centróide é 0,0, + z, com uma nova Z-eixo que passa através do centro da amostra (linha vermelha, Figura 1E) . Em quarto lugar, a nuvem de pontos é girado em torno do eixo z em primeiro lugar o slicE de pontos na Zlength proximal 15-15,25% da estrutura (pontos azuis, Figura 1E). Esta fatia de pontos é achatado na dimensão z (ou seja, z-coordenadas são simplesmente ignorados), a casca convexa tomada, e o retângulo delimitador mínimo (o menor retângulo que contém todos os outros pontos) calculado. Imagine uma linha que liga os pontos médios dos dois lados curtos deste retângulo de limite mínimo. Nós rodar a nuvem de pontos até que esses dois pontos médios tornar-x, 0, + z e + x, 0, + z, respectivamente, assim, esta linha torna-se um eixo x nova. Após a transformação, a distância entre os valores de x máximas e mínimas são referidos como Xlength. Um novo arquivo é criado a partir specimen.xyz para specimen.TRANSFORMED.xyz. Em quinto lugar, pontos dentro de 1% Xlength do eixo z são cortados fora (pontos azuis, Figura 1F), e o único mais proximal e distai única mais ponto identificado a partir deste centro SLgelo e rotulados proximal e distal, respectivamente. Estas são as primeiras duas meias-marcos identificados. Sexta, 50 fatias uniformemente espaçados de pontos são amostrados ao longo do eixo z (pontos vermelhos, Figura 1G). Cada fatia é uma espessura de 1% Zlength. Cada fatia é então achatada na dimensão z, e divididos igualmente por 7 linhas verticais (linhas vermelhas, Figura 1H). Pontos dentro de 2% Xlength de cada linha são mantidos (pontos vermelhos, Figura 1H), então os pontos com o máximo eo mínimo coordenada y são mantidos, projetada em cada linha respectiva, e rotulados ventral e dorsal, respectivamente. Além disso, etiquetas contêm o número fatia e o número da linha, por exemplo P15_VENTRAL4 é o ponto ventral amostrado a partir da linha vertical 4º da 15ª fatia. Importante, a cada ponto marcado, por exemplo, P15_VENTRAL4, ocorre uma vez e apenas uma vez em todas as amostras, preservando correspondence. Além dos pontos ventral e dorsal de cada uma das 7 linhas (14 semi-marcos total), os pontos com o máximo eo mínimo de valor x são amostrados e rotulados esquerda e direita, respectivamente. Os yez coordenadas de esquerda e direita são suavizados utilizando a função LOWESS na R. Para o báculo, um total de 16 semi-marcos são definidos por fatia (esferas vermelhas, Figura 1H); com 50 fatias mais proximal e semi-marcos DISTAIS definidos acima, 802 semi-marcos são amostrados por espécime (esferas verdes, Figura 1-I). Todos os outros pontos da verificação microCT original são descartados. Deve notar-se que, embora ventral / dorsal e proximal polaridade / distal foi determinada matematicamente, todos os alinhamentos espécimes foram visualmente confirmada e ajustada manualmente, conforme necessário. Em nossa amostra de 369 bacula, cerca de 10 teve de ser ajustado manualmente. Figura 1: Representação Visual do Computacional fluxo de trabalho (Protocolo 4-6). (A) Uma captura de tela do script 02_segment_dicoms.r (Protocolo 4), mostrando a atribuição de diferentes nuvens de pontos para espécimes individuais. (B) vista ampliada de uma baculum, representada por uma nuvem de pontos xyz ~ 100K. (C) Identificação de os dois pontos mais afastados um do outro (esferas vermelhas), utilizada para definir um novo Z-eixo que executa proximal-distal por meio da (linha vermelha) do osso. (D) A amostragem do proximal mais de 10% e mais distai-10% de pontos (pontos vermelhos) proporciona um meio para ajustar a ligeira variação no posicionamento exacto do eixo z. (E) o centróide dos proximais-mais de 10% e mais distal 10% (esferas vermelhas) são utilizadas para definir um novo eixo z (linha vermelha). Em seguida, uma fatia de pontos compreendidos entre 15,00-15,25% deste novo eixo z (pontos azuis) é levado para calcular o retângulo de limite mínimo. O ponto de nuvem é rodado até que o lado comprido do rectângulo de limite mínimo é paralelo a um novo eixo x. F) uma fatia de pontos que funcionam ao longo da linha média (pontos azuis) é amostrado e o mais proximal e distal ponto mais definido como um semi-marco. G) 50 fatias uniformemente espaçados de pontos são amostrados (pontos vermelhos), com H), mostrando uma tal fatia. 16 pontos vermelhos (círculos) são definidos para captar o contorno de cada fatia. I) Quando repetido em todas as fatias, um total de 802 pontos de referência (semi-esferas verdes), definem a estrutura e são usados em todas as aplicações a jusante morfométricas. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55342/55342fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Muitas estruturas biológicas falta marcos facilmente definíveis, o que torna difícil a aplicação de métodos morfométricos modernos. Aqui, ilustramos métodos para estudar o báculo rato (um osso do pénis), incluindo dissecção e digitalização microCT, seguido por métodos computacionais para definir semi-chave que são utilizadas para quantificar a forma e tamanho variação.

Dissecação, digitalização MicroCT e morfométricas Análises do Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

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Nanyang Technological University

Research

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Bioengineering

7.5K visualizações.  University of Southern California (USC).  Muitas estruturas biológicas falta marcos facilmente definíveis, o que torna difícil a aplicação de métodos morfométricos modernos. Aqui, ilustramos métodos para estudar o báculo rato (um osso do pénis), incluindo dissecção e digitalização microCT, seguido por métodos computacionais para definir semi-chave que são utilizadas para quantificar a forma e tamanho variação. 

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Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength and flexibility and allows it to fulfill its functions. Bone is continuously exposed to a variety of stimuli, which in pathological conditions can deregulate bone remodeling. To study bone biology and diseases and evaluate potential therapeutic agents, it has been necessary to develop in vitro and in vivo models.
This manuscript describes the dissection process and culture conditions of calvarias isolated from neonatal mice to study bone formation and the bone tumor microenvironment. In contrast to in vitro and in vivo models, this ex vivo model allows preservation of the three-dimensional environment of the tissue as well as the cellular diversity of the bone while culturing under defined conditions to simulate the desired microenvironment. Therefore, it is possible to investigate bone remodeling and its mechanisms, as well as the interactions with other cell types, such as the interactions between cancer cells and bone.
The assays reported here use calvarias from 5-7 day old BALB/C mice. The hemi-calvarias obtained are cultured in the presence of insulin, breast cancer cells (MDA-MB-231), or conditioned medium from breast cancer cell cultures. After analysis, it was established that insulin induced new bone formation, while cancer cells and their conditioned medium induced bone resorption. The calvarial model has been successfully used in basic and applied research to study bone development and cancer-induced bone diseases. Overall, it is an excellent option for an easy, informative, and low-cost assay.

The ex vivo culture of bone explants can be a valuable tool for the study of bone physiology and the potential evaluation of drugs in bone remodeling and bone diseases. The presented protocol describes the preparation and culture of calvarias isolated from newborn mice skulls, as well as its applications.

Medição da remodelagem óssea e recriação do microambiente tumor-osso usando a cocultura da Calvaria e a histomormormetria

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Pesquisa do câncer

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold. 
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.

Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.

Estabelecimento de um Defeito Modelo segmentar Femoral Critical-size em Ratos estabilizada por osteossíntese Placa

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

Medicina

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Rígida incorporação de fixo e manchado, inteiro, espécimes de milímetro-escala para histologia seção livre 3D por Microtomografia computadorizada

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Bioengenharia

Biomechanical Testing of Murine Tendons

Tendon disorders are common, affect people of all ages, and are often debilitating. Standard treatments, such as anti-inflammatory drugs, rehabilitation, and surgical repair, often fail. In order to define tendon function and demonstrate efficacy of new treatments, the mechanical properties of tendons from animal models must be accurately determined. Murine animal models are now widely used to study tendon disorders and evaluate novel treatments for tendinopathies; however, determining the mechanical properties of mouse tendons has been challenging. In this study, a new system was developed for tendon mechanical testing that includes 3D-printed fixtures that exactly match the anatomies of the humerus and calcaneus to mechanically test supraspinatus tendons and Achilles tendons, respectively. These fixtures were developed using 3D reconstructions of native bone anatomy, solid modeling, and additive manufacturing. The new approach eliminated artifactual gripping failures (e.g., failure at the growth plate failure rather than in the tendon), decreased overall testing time, and increased reproducibility. Furthermore, this new method is readily adaptable for testing other murine tendons and tendons from other animals.

The protocol describes efficient and reproducible tensile biomechanical testing methods for murine tendons through the use of custom-fit 3D printed fixtures.

Teste biomecânico de tendões murinos

Tendon disorders are common, affect people of all ages, and are often debilitating. Standard treatments, such as anti-inflammatory drugs, rehabilitation, ...

Analysis of Craniomaxillofacial Malformations in Mice Using Three-dimensional Microcomputed Tomography

To model craniofacial malformations caused by vitamin A deficiency (VAD), we expressed a dominant-negative retinoid receptor mutation in osteoblasts to specifically inhibit RAR transcriptional activity in mice. This approach allowed us to investigate the effects of VAD on cranial hypomineralization, mandibular deformity, and clavicular hypoplasia in clinical cases. In this study, microcomputed tomography (microCT) scanning of the craniomaxillofacial region of mice represented a valuable tool for studying the growth and development of this animal model. The manual estimation of images is both time-consuming and inaccurate. Hence, here, we present a straightforward, efficient, and accurate approach for segmenting and quantifying the microCT images of each craniomaxillofacial bone. MicroCT software was used to slice the mandible, frontal bone, parietal bone, nasal bone, premaxilla, maxilla, interparietal bone, and occipital bone of mice and measure their corresponding lengths and widths. This segmentation method can be applied to study growth and development in developmental biology, biomedicine, and other related sciences and allows researchers to analyze the effects of genetic mutations on individual craniofacial bones.

Here, we describe in depth a method, which is based on microcomputed tomography, to segment and measure 3D models of craniomaxillofacial bones in mice, for better assessment of craniomaxillofacial bone development in mice than what is possible with current methods.

Análise de malformações craniomaxilofaciais em camundongos por meio de tomografia computadorizada tridimensional

To model craniofacial malformations caused by vitamin A deficiency (VAD), we expressed a dominant-negative retinoid receptor mutation in osteoblasts to ...

Biologia do Desenvolvimento

Princípios e Protocolos de Ensaios Mecânicos para Suscetibilidade à Fratura Óssea

Practical Considerations for the Design, Execution, and Interpretation of Studies Involving Whole-Bone Bending Tests of Rodent Bones

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care costs. The ability to understand the mechanisms underlying bone disease and the response to treatment is not only desired, but critical. Mechanical testing of bone serves as a valuable technique for understanding and quantifying a bone&#39;s susceptibility to fracture. While this method appears simple to perform, inappropriate and inaccurate conclusions may be reached if governing assumptions and key steps are disregarded by the user. This has been observed across disciplines as studies continue to be published with misuse of methods and incorrect interpretation of results. This protocol will serve as a primer for the principles associated with mechanical testing along with the application of these techniques-from considerations of sample size through tissue harvesting and storage, to data analysis and interpretation. With this in hand, valuable information regarding a bone&#39;s susceptibility to fracture may be obtained, furthering understanding for both academic research and clinical solutions.

Autor em destaque: Melhorando a precisão e a reprodutibilidade em testes de flexão de ossos inteiros 

Mechanical testing of rodent bones is a valuable method for extracting information regarding a bone's susceptibility to fracture. Lacking proper practical understanding, the results may be overinterpreted or lack validity. This protocol will serve as a guide to ensure mechanical tests are performed accurately to provide valid and functional data.

Considerações práticas para o projeto, execução e interpretação de estudos envolvendo testes de flexão óssea total de ossos de roedores

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care ...

A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the structural and cellular components of the mandibular condylar cartilage (MCC). This manuscript describes methods for analyzing these changes and a method for altering the loading of the TMJ in mice (i.e., compressive static TMJ loading). The structural evaluation illustrated here is a simple morphometric approach that uses the Digimizer software and is performed in radiographs of small bones. In addition, the analysis of cellular changes leading to alterations in collagen expression, bone remodeling, cell division, and proteoglycan distribution in the MCC is described. The quantification of these changes in histological sections - by counting the positive fluorescent pixels using image software and measuring the distance mapping and stained area with Digimizer - is also demonstrated. The methods shown here are not limited to the murine TMJ, but could be used on additional bones of small experimental animals and in other regions of endochondral ossification.

This manuscript presents methods for analyzing morphometric and cellular changes within the mandibular condyle of rodents.

Um método de análise celular para o côndilo Mandibular murino e morfométricas

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the ...

Biologia

Coloração HE e Micro-CT para Avaliar a Microarquitetura do Osso Trabecular Murino

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton is crucial for gaining insight into the pathophysiology of osteoporosis and improving its treatment. However, handling bone samples can be complex due to their hard and dense properties. Secondly, specialized software makes image processing and analysis difficult. In this protocol, we present a cost-effective and easy-to-use solution for trabecular bone microstructure analysis. Detailed steps and precautions are provided. Micro-CT is a non-destructive three-dimensional (3D) imaging technique that provides high-resolution images of trabecular bone structure. It allows for the objective and quantitative evaluation of bone quality, which is why it is widely regarded as the gold standard method for bone quality assessment. However, histomorphometry remains indispensable as it offers crucial cellular-level parameters, bridging the gap between two-dimensional (2D) and 3D assessments of bone specimens. As for the histologic techniques, we chose to decalcify the bone tissue and then perform traditional paraffin embedding. In summary, combining these two methods can provide more comprehensive and accurate information on bone microstructure.

Autor em destaque: Um método econômico e eficiente para avaliação quantitativa da microarquitetura óssea em um modelo de osteoporose murina 

This protocol presents an economical and efficient method for quantitative evaluation of bone microarchitecture in a mouse model of osteoporosis by combining Hematoxylin-Eosin (HE) staining and micro-computed tomography (Micro-CT) techniques.

Avaliação da Microarquitetura Óssea Trabecular em Modelo de Osteoporose em Camundongos

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...

Dissecação, digitalização MicroCT e morfométricas Análises do Baculum

Resumo

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Medição da remodelagem óssea e recriação do microambiente tumor-osso usando a cocultura da Calvaria e a histomormormetria

Estabelecimento de um Defeito Modelo segmentar Femoral Critical-size em Ratos estabilizada por osteossíntese Placa

Rígida incorporação de fixo e manchado, inteiro, espécimes de milímetro-escala para histologia seção livre 3D por Microtomografia computadorizada

Teste biomecânico de tendões murinos

Análise de malformações craniomaxilofaciais em camundongos por meio de tomografia computadorizada tridimensional

Considerações práticas para o projeto, execução e interpretação de estudos envolvendo testes de flexão óssea total de ossos de roedores

Considerações práticas para o projeto, execução e interpretação de estudos envolvendo testes de flexão óssea total de ossos de roedores

Considerações práticas para o projeto, execução e interpretação de estudos envolvendo testes de flexão óssea total de ossos de roedores

Um método de análise celular para o côndilo Mandibular murino e morfométricas

Avaliação da Microarquitetura Óssea Trabecular em Modelo de Osteoporose em Camundongos